王爍，陳波，苗雄鷹

（中南大學湘雅二醫(yī)院 普外肝膽專科，湖南 長沙 410011）

肝細胞癌（以下簡稱肝癌）是世界上最常見的惡性腫瘤之一[1]，它以惡性程度高，浸潤性和轉(zhuǎn)移性強，預后差，嚴重威脅人民健康，隨著醫(yī)療技術的不斷發(fā)展，肝癌治療已發(fā)展為多學科綜合治療模式[2-3]，其有效治療的可能性很大程度上取決于癥狀發(fā)生前早期的檢測[4]。目前已有研究表明谷胱甘肽過氧化物酶1（glutathione peroxidase 1，GPX1）在乳腺癌、前列腺癌、肺癌和結腸癌等腫瘤組織中表達上調(diào)，可能有利于腫瘤的進展和擴散[5-6]，但是GPX1在肝癌中的研究較少，尚無研究系統(tǒng)全面分析其在肝癌中的臨床價值，而實現(xiàn)肝癌的早期診斷對于肝癌的有效治療和改善預后非常重要，通過基因技術手段進行腫瘤分子標志物的篩選和基因治療，是目前治療肝癌的研究方向和熱點。

GPX1基因位于染色體3p21上，表達產(chǎn)物主要存在于氧張力較高的組織中如肺、肝、腎等[7]。GPX1在過氧化氫的解毒中起作用，是人體最重要的抗氧化酶之一。這種蛋白是高等脊椎動物中僅有的幾種含有硒半胱氨酸的蛋白之一。此外，該蛋白在N端區(qū)域以多丙氨酸序列多態(tài)性為特征，該序列中包括3 個具有5、6 或7 個丙氨酸重復序列的等位基因。GP X1 的主要功能是降解活性氧（ROS），保護細胞免受氧化應激[8-9]，而ROS在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起到了重要的推動作用。相比正常細胞腫瘤細胞內(nèi)存在更高水平的ROS[10]，腫瘤細胞可通過多種途徑產(chǎn)生過量的ROS[11-12]。過量的ROS能夠刺激腫瘤細胞發(fā)生、增殖、侵襲、遷移及血管生成，且能夠啟動逃避凋亡的機制，并誘導化療藥物耐藥性的產(chǎn)生，涉及的相關機制包括導致點突變，活化原癌基因、促進上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化、介導間質(zhì)結構破壞、血管內(nèi)皮細胞通透性增強、刺激缺氧誘導因子1α（hypoxia-inducible factor 1α，HIF-lα）表達等[13-14]。

目前GPX1在肝癌中的研究較少，尚無研究對其在肝癌中的臨床價值進行系統(tǒng)全面的分析，因此，本研究旨在通過生物信息學的方法分析GPX1在肝癌中的表達情況以及GPX1對肝癌早期篩選、預后的價值。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源

從Ualcan數(shù)據(jù)庫（http://ualcan.path.uab.edu/index.html）獲取50例正常肝組織及371例原發(fā)性肝癌組織的G PX 1 表達數(shù)據(jù)。肝癌組織中I期168例，II期84例，III期82例，IV期6例；男245例，女117例；21～40歲27例，41～60歲140例，61～80歲181例，81～100歲10例。部分患者無法準確分期或缺性別信息，以及＜20歲和＞100歲的患者例數(shù)過少均未納入統(tǒng)計。

1.2 研究方法

分析肝癌組織與正常組織及肝癌患者不同分期、性別、年齡不同分組間GPX1的表達差異，并于LinkedOmics數(shù)據(jù)庫（http://www.linkedomics.org）中檢索GPX1共表達基因，得出與GPX1正相關及負相關表達基因熱圖，同時對共表達基因做GO 富集分析、KEGG 通路分析，并基于STRING10.5（https://string-db.org）進行相關基因編碼蛋白的相互作用網(wǎng)絡分析。最后基于GEPIA數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)（http://gepia.cancer-pku.cn）分析GPX1與肝癌患者總體生存率（OS）、無病生存時間（DFS）的關系，繪制GPX1表達水平與預后生存曲線。

1.3 統(tǒng)計學處理

GPX1的表達水平經(jīng)四分位數(shù)分成四等份并分別繪制成箱線圖進行比較，數(shù)據(jù)以中位數(shù)（四分位間距）[M（P25，P75）]表示，采用秩和檢驗。GEPIA數(shù)據(jù)庫使用Kaplan-Meier生存分析法來計算生存時間及生存率并繪制OS及DFS曲線，采用Log-rank檢驗比較不同表達水平的生存差異從而得出P值。

2 結 果

2.1 GPX1 在肝癌與正常肝組織中表達情況

Ualcan數(shù)據(jù)庫中50例正常肝組織GPX1表達水平為266.211（231.986，316.004）；371例肝癌組織中GPX1表達水平為446.254（325.771，637.913）。肝癌組織中GPX1表達水平明顯高于正常肝組織（P＜0.05）（圖1）。

圖1 肝癌與正常肝組織GPX1 表達水平Figure 1 GPX1 expression levels in liver cancer and normal liver tissues

2.2 GPX1 在肝癌不同分期中表達情況

Ualcan數(shù)據(jù)庫中168例I期肝癌組織中GPX1表達水平為418.032（319.815，608.761）；84例II期肝癌組織中GPX1表達水平為527.488（406.292，708.117）；82例III期肝癌組織中GPX1表達水平為396.883（292.728，586.859）；6例IV期肝癌組織中GPX1表達水平為571.242（536.796，719.670）。I、II、III期肝癌組織中GPX1表達水平均明顯高于正常肝組織（均P＜0.05），而IV期肝癌組織中GPX1表達水平與正常肝組織差異無統(tǒng)計學意義（P=0.09）。各期肝癌組織組中GPX1表達水平兩兩比較結果顯示，II期肝癌組織GPX1表達水平高于I期肝癌組織（P＜0.01），其余各分期之間GPX1表達水平無統(tǒng)計學差異（均P＞0.05）（圖2）。

圖2 不同分期肝癌GPX1 表達水平Figure 2 GPX1 expression levels in liver cancer tissues of different stages

2.3 GPX1 在肝癌不同性別分組中表達情況

Ualcan數(shù)據(jù)庫中245例男性肝癌患者肝癌組織中GPX1表達水平為477.440（333.705，689.337）；117例女性患者肝癌組織中GPX1表達水平為418.591（269.648，524.148）。男性肝癌患者肝癌組織中GPX1表達水平明顯高于女性肝癌患者（P=0.02）（圖3）。

2.4 GPX1 在肝癌不同年齡分組中表達情況

Ualcan數(shù)據(jù)庫中27例21～40歲患者肝癌組織中GPX1表達水平為396.302（257.820，578.551）；140例41～60歲患者肝癌組織中GPX1表達水平為420.743（286.715，651.264）；181例61～80歲患者肝癌組織中GPX1表達水平為469.043（356.222，652.360）；10例81～100歲患者肝癌組織中GPX1表達水平為443.651（314.771，506.432）。各年齡段患者肝癌組織GPX1表達水平均明顯高于正常肝組織（均P＜0.05）。盡管GPX1的表達水平隨著年齡的增加有升高趨勢，但是各年齡組之間GPX1表達水平無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）（圖4）。

圖3 不同性別肝癌患者GPX1 表達水平Figure 3 GPX1 expression levels in liver cancer tissues from patients of different sexes

圖4 不同年齡肝癌患者GPX1 表達水平Figure 4 GPX1 expression levels in liver cancer tissues from patients of different ages

2.5 GO 富集分析

于LinkedOmics中檢索到3 061個與GPX1共表達基因，對相關系數(shù)＞0.3的共表達基因進行分析，GO 富集結果發(fā)現(xiàn)，這些共表達基因主要集中轉(zhuǎn)錄、翻譯、蛋白泛素化、蛋白質(zhì)磺?；壬飳W過程（表1）；細胞質(zhì)、細胞核仁、中心體、蛋白酶體復合體等細胞成分（表2）；RNA結合、蛋白質(zhì)結合、癌基因結合蛋白、螺旋酶活性等分子功能（表3）。

表1 生物學過程Table 1 Biological process

表2 細胞成分Table 2 Cellular component

表3 分子功能Table 3 Molecular function

2.6 KEGG 通路分析

KEGG通路分析結果顯示這些基因明顯富集于TGF-β信號通路、MAPK信號通路、HIF-1α信號通路、NF-κB信號通路、VEGF信號通路、Notch信號通路、RAS信號通路及各種癌癥（胰腺癌、前列腺癌、結直腸癌、腎細胞癌、子宮內(nèi)膜癌、小細胞型肺癌、非小細胞型肺癌、甲狀腺癌、阿爾茲海默癥、非酒精性脂肪肝、乙肝病毒性肝炎、急性髓樣白血?。┩緩矫黠@有關（均P ＜0.0 5）（表4）。

表4 通路分析 Table 4 Pathway analysis

2.7 GPX1 共表達基因熱圖

檢索LinkedOmics中與GPX1相關的共表達基因，根據(jù)與GPX1表達的相關性繪制出共表達基因熱圖（圖5）。

圖5 共表達基因熱圖 A：正相關基因；B：負相關基因Figure 5 The heat maps of the co-expressed genes A: Positively correlated genes; B: Negatively correlated genes

2.8 編碼蛋白相互作用網(wǎng)絡分析

STRING 10.5 數(shù)據(jù)庫檢索GPX1相關基因，結果顯示谷胱甘肽還原酶（glutathione reductase，GSR）、超氧化物歧化酶1 ～3（superoxide dismutase SOD 1-3）、谷胱甘肽合成酶（glutathione synthetase，GSS）、谷胱苷肽S-轉(zhuǎn)移酶類（glutathione S-transferase theta pseudogene 1，GSTT1P；glutathione S-transferase theta 2B，GSTT2B；glutathione S-transferase pi，GSTP1；glutathione S-transferase mu 1，GSTM1）、造血前列腺素D合成酶（hematopoietic prostaglandin D synthase，HPGDS）等10個肝癌相關基因編碼的蛋白與GPX1所編碼的蛋白存在相互作用關系（圖6）。

2.9 GPX1 表達與肝癌預后的關系

利用GEPIA數(shù)據(jù)庫繪制出GPX1表達水平與肝癌患者預后生存曲線圖，分析GPX1表達水平與OS、DFS之間的關系。結果顯示，GPX1高表達患者OS、DFS均明顯低于GPX1低表達患者（P=0.048、P=0.035）（圖7）。

圖6 肝癌相關基因編碼的蛋白與GPX1 所編碼的蛋白網(wǎng)絡Figure 6 Interaction network of the proteins encoded by liver cancer related genes and GPX1

圖7 不同GPX1 表達情況患者生存曲線Figure 7 Survival curves of patients with different GPX1 expression profiles

3 討 論

本研究結果顯示，肝癌組織中GPX1表達水平高于正常肝臟組織。I、II、III期肝癌組織中GPX1表達水平均高于正常肝組織，而IV期肝癌組織GPX1表達水平與正常肝臟組織表達水平無統(tǒng)計學差異，考慮出現(xiàn)該現(xiàn)象的原因可能為晚期腫瘤組織多伴有壞死、機化，局部氧化應激反應相對早、中期肝癌減少，遂與氧化應激反應相關的GPX1表達水平亦隨之下降。I期肝癌組織中GPX1表達水平與II期肝癌組織有統(tǒng)計學差異，表現(xiàn)為 II期肝癌組織GPX1表達水平高于I期肝癌組織，其余各分期之間GPX1表達水平無統(tǒng)計學差異。肝癌患者中男性患者GPX1表達水平較女性患者更高。不同年齡患者肝癌組織GPX1表達水平高于正?；颊逩PX1表達水平，盡管隨著年齡的增加，GPX1的表達水平逐漸升高，但是各年齡組之間GPX1表達水平無明顯統(tǒng)計學差異。GPX1高表達患者OS、DFS均低于GPX1低表達患者。

Zhao等[15]分析了肝癌細胞和正常肝細胞之間GPX1的表達情況，結果表明，人肝癌HepG2細胞中GPX1上調(diào)，提示該基因可能在肝癌發(fā)生的發(fā)生和發(fā)展中起重要作用。Su等[16]發(fā)現(xiàn)了增加的氧化劑負擔與肝癌發(fā)生有關，并且抗氧化酶抵消潛在的氧化損傷。因此，編碼抗氧化酶的基因中的GPX1可能在肝癌的發(fā)展中起重要作用。影響肝癌預后的因素很多，大致可分為患者因素、腫瘤本身因素、治療相關因素等幾大類[17]，所以分析肝癌發(fā)生發(fā)展的機理及參與的多個通路非常重要，這可以為肝癌的治療靶點提供新的方向。GO富集及KEGG通路分析發(fā)現(xiàn)GPX1共表達基因主要參與基因轉(zhuǎn)錄、翻譯、蛋白泛素化、蛋白質(zhì)磺?；RNA穩(wěn)定性調(diào)節(jié)、蛋白酶體核復合體、線粒體翻譯等分子生物學過程，并參與TGF-β、mTOR、WNT、MAPK、HIF-1α、NF-κB、VEGF、Notch等信號通路及各種癌癥疾病通路發(fā)生過程。TGF-β信號通路在肝臟腫瘤中起著重要和復雜的作用，這些包括許多不同的功能，如維持干細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)、促進纖維化、免疫調(diào)節(jié)、作為腫瘤抑制物和矛盾地作為腫瘤進展物[18-19]。RAS/MAPK信號通路在大多數(shù)肝癌患者中被激活，并且與預后不良相關，肝癌Ras通路異常激活的主要細胞內(nèi)機制及其潛在的治療意義，RAS/MAPK通路效應被認為可能是肝癌的潛在治療靶點[20]。肝癌的發(fā)病機制與肝細胞持續(xù)死亡、炎性細胞浸潤和代償性肝再生密切相關，NF-κB信號通路在發(fā)育和成年肝臟中均可促進肝細胞存活，它還通過控制一系列生長因子和細胞因子的表達，在肝臟炎癥反應中發(fā)揮關鍵作用，該信號通路也有作為治療靶點的潛力[21-22]。HIF-1α和VEGF在原發(fā)性肝癌組織中的mRNA和蛋白水平均有較高的表達，HIF-1α和VEGF的表達與腫瘤分期、淋巴結轉(zhuǎn)移和肺轉(zhuǎn)移相關。HIF-1α在原發(fā)性肝癌中的表達與VEGF表達呈正相關（r=0.665，P＜0.05）。HIF-1α和VEGF均與總生存率顯著相關，而HIF-1α是獨立的預后因子，HIF-1α和VEGF可作為肝癌TACE療效和原發(fā)性肝癌轉(zhuǎn)移的預測因子，是肝癌晚期的生物標志物，提示肝癌患者預后不良，HIF-1α和VEGF可能是改善原發(fā)性肝癌預后的靶點[23]。Notch信號通路在肝癌的轉(zhuǎn)移、復查、預后中亦有重要作用，在肝癌組織中，Notch1高表達與腫瘤大小、分級、侵襲、轉(zhuǎn)移、血管侵犯及TNM分期均顯著相關[24]。此外，Notch1在肝轉(zhuǎn)移癌組織中異常高表達，Notch1及其下游分子HES1在肝癌組織中均呈高表達狀態(tài)[25]。

綜上所述，GPX1在肝癌組織中高表達，且與肝癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關。因此，GPX1可以作為肝癌篩選、預后預測的標志物之一。