張善忠，付曉偉，劉芩，周毅

（1. 江西省景德鎮(zhèn)市第一人民醫(yī)院 普通外科，江西 景德鎮(zhèn) 333000；2. 南昌大學第一附屬醫(yī)院 肝膽外科，江西 南昌 330006）

膽管細胞癌為來源于膽管上皮細胞的原發(fā)性惡性腫瘤[1-2]，在肝膽系統(tǒng)腫瘤中排第2位，僅次于肝癌，約占整個消化系統(tǒng)惡性腫瘤的3%[3]。近年來，膽管癌的發(fā)病率及病死率都呈逐漸上升趨勢，特別是在南美洲和亞洲[4-5]。膽管癌起病隱匿，惡性程度高，通常以體質(zhì)量減輕、發(fā)燒，有時還可表現(xiàn)黃疸和疼痛為特征，并迅速惡化使患者出現(xiàn)惡病質(zhì)[6]。與消化道其它惡性腫瘤相比，膽管癌缺乏相對理想的早期診斷標志物，只有10%～15%的膽管癌患者適合手術治療[7-8]。大多數(shù)新發(fā)膽管癌病例診斷時已處于晚期，其治療方案主要基于化療[9]。但是，晚期膽管癌患者預后不良，總體中位生存時間一般不超過12個月[10]。因此，探索新的和膽管癌發(fā)生發(fā)展有關的基因，研發(fā)新型藥物靶點對提高我國膽管癌治療水平具有重要意義。

核仁紡錘體相關蛋白1（nucleolar spindle associated protein 1，Nusap1），一種新發(fā)現(xiàn)的微管結(jié)合蛋白，在細胞有絲分裂過程中起著不可缺少的作用，是一種重要的周期調(diào)控分子，保證著細胞周期的正常進行[11]。近年來有研究發(fā)現(xiàn)Nusap1在黑色素瘤[12]、肝癌[13]、膠質(zhì)瘤[14]、腦膜瘤[15]、乳腺癌[16-17]等諸多腫瘤中存在過表達，且其表達水平與腫瘤細胞的增殖、遷移能力密切相關，但其在膽管癌中至今未見任何報道。本研究首先根據(jù)GEPIA數(shù)據(jù)庫[18]分析Nusap1 mRNA在膽管癌組織及膽管正常組織中的表達情況；其次應用免疫組化技術檢測膽管癌患者組織及癌旁組織中Nusap1蛋白的表達水平，并結(jié)合相關臨床資料初步探討該蛋白在膽管癌發(fā)生發(fā)展過程中的可能作用。

1 材料與方法

1.1 標本來源

收集2011年10月—2014年8月因膽管癌在南昌大學第一附屬醫(yī)院普外科行手術治療的61例組織切片（包括癌組織及相對應的癌旁組織），患者術前均未行化療或放療等相關抗腫瘤治療。所有標本均經(jīng)病理證實為膽管癌，且所取癌旁組織也經(jīng)病理證實為非腫瘤組織。本研究由醫(yī)院倫理委員會批準，并根據(jù)美國AJCC癌癥分期手冊[19]進行腫瘤TNM分期。

1.2 免疫組化檢測

Nusap1（A16000）抗體購于武漢ABclonal公司，工作液濃度為1:200。免疫組化試劑均購于北京中杉金橋公司。標本用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋。然后用免疫組化檢測肝癌組織中Nusap1的表達。切片常規(guī)脫蠟，復水，抗原修復，山羊血清封閉，1抗過夜，2抗孵育，DAB顯色，復染，中性樹膠封片，最后置于鏡下觀察。免疫組化染色結(jié)果判定[20]：閱片采用雙盲法，Nusap1主要定位于細胞核，核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色代表陽性結(jié)果。染色強度：無色為0分；弱陽性為1分；中等陽性為2分；強陽性為3分。染色范圍：0～10%為1分；10%～40%為2分；41%～100%為3分。最終所得分為染色強度與染色范圍兩者相乘，評分范圍為0～9分，0～1分為Nusap1陰性組，2～9分為Nusap1陽性組。

1.3 臨床隨訪

隨訪方式主要為電話隨訪及定期門診復查，隨訪從手術日開始至2017年8月，或者以患者死亡為終止日期。

1.4 GEPIA 數(shù)據(jù)庫分析

GEPIA數(shù)據(jù)庫是由北京大學新研發(fā)出的網(wǎng)絡服務器，用于分析來自TCGA和GTEx中樣本的RNA測序表達數(shù)據(jù)；Nusap1 mRNA在膽管癌及正常膽管組織中的表達水平由GEPIA數(shù)據(jù)庫進行分析。

1.5 統(tǒng)計學處理

采用χ2檢驗測定Nusap1的表達與臨床病理參數(shù)間的關系；Kaplan-Meier生存分析評估Nusap1的表達與膽管癌患者總生存期的關系；P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義；統(tǒng)計分析均由SPSS 17.0統(tǒng)計軟件完成。

2 結(jié) 果

2.1 GEPIA 數(shù)據(jù)庫分析膽管癌組織中Nusap1 mRNA 的表達情況

首先通過公共數(shù)據(jù)庫GEPIA來明確膽管癌和正常膽管組織中Nusap1 mRNA的表達情況，采用箱式圖進行比較分析。結(jié)果顯示，在膽管癌組織中，Nusap1 mRNA的表達水平明顯高于正常膽管組織（P＜0.05）（圖1）。

圖1 GEPIA 數(shù)據(jù)庫分析Nusap1 mRNA 在膽管癌及正常膽管組織中的表達Figure 1 Nusap1 mRNA expressions in cholangiocarcinoma and normal bile duct tissue based on GEPIA database analysis

2.2 膽管癌組織中Nusap1 蛋白的表達情況

免疫組化結(jié)果顯示，膽管癌組織標本中，Nusap1陽性表達率為47.5%（29/61），且發(fā)現(xiàn)Nusap1蛋白主要定位于細胞核；而相對應的癌旁組織標本中Nusap1陽性表達率為14.8%（9/61）。膽管癌組織中Nusap1蛋白的表達水平明顯高于配對癌旁組織（47.5%vs.14.8%，P＜0.05）（圖2）。

圖2 免疫組化檢測Nusap1 蛋白表達（×400） A：癌旁組織中Nusap1 蛋白的陰性表達；B：膽管癌組織中Nusap1 蛋白的陽性表達Figure 2 Immunohistochemical staining for Nusap1 expression (×400) A: Negative staining of Nusap1 in tumor adjacent tissue; B: Positive staining of Nusap1 in cholangiocarcinoma tissue

2.3 膽管癌組織中Nusap1 蛋白的表達與患者臨床數(shù)據(jù)的關系

分析膽管癌組織中Nusap1蛋白的表達水平與患者臨床數(shù)據(jù)的關系，結(jié)果顯示，Nusap1的表達水平與患者臨床TNM分期（P=0.001）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P=0.011）及術后生存狀態(tài)（P=0.010）密切相關，而與患者年齡（P=0.2 0 2）、性別（P=0.124）、腫瘤大?。≒=1.000）、CA19-9水平（P=0.306）、分化程度（P=0.800）無明顯關系（表1）。

表1 膽管癌中Nusap1 的表達與臨床病理參數(shù)的關系 [n（%）]Table 1 Relations of the Nusap1 expression with the clinicopathological characteristics of patients with cholangiocarcinoma [n(%)]

2.4 Nusap1 與患者預后的關系

Kaplan-Meier生存分析顯示，Nusap1蛋白陽性組患者術后總生存時間較陰性組明顯縮短（P=0.000）（圖3）。其中Nusap1蛋白陽性組患者術后中位生存時間為23個月，陰性組患者術后中位生存時間為45個月。

圖3 Nusap1 表達與患者術后總生存時間的關系Figure 3 Relation of Nusap1 expression with postoperative overall survival time of the patients

3 討 論

膽管癌的早期診斷及手術根治或許給患者提供了治愈的機會[21]，但由于缺少有效的早期診斷方法，只有10%～15%的膽管癌患者適合手術治療[7]。因此，探索新的和膽管癌發(fā)生發(fā)展有關的基因，研發(fā)新型藥物靶點顯得尤為重要。Nusap1 是一種新型微管結(jié)合蛋白，其分子量大約為55 kD。Nusap1的mRNA和蛋白水平在細胞周期G2/M期達到峰值，是一種重要的周期調(diào)控分子，主要參與紡錘體組裝和染色體分離，在細胞有絲分裂過程中保證細胞周期的正常進行[22]。Nusap1表達升高使細胞核內(nèi)微管聚集從而導致細胞周期停滯；相反，Nusap1的表達下降導致細胞形成異常的紡錘體，最終產(chǎn)生異常的胞質(zhì)分裂[11]，因此說明Nusap1在細胞有絲分裂過程中起著不可缺少的作用。

近年來的研究[23]發(fā)現(xiàn)，Nusap1 基因在多種癌細胞中存在過表達，且與腫瘤復發(fā)和侵襲密切相關。但是在正常體細胞中，如腦、肝、腎等，幾乎沒有發(fā)現(xiàn)Nusap1的表達。因此有學者[24]推測Nusap1可能參與癌癥的形成，并可能成為一種高選擇性的化療靶點。在肝癌的研究中，張猛等[13]發(fā)現(xiàn)Nusap1 的表達水平明顯高于癌旁組織，并與肝癌的侵襲性及早期復發(fā)密切相關。最近，Roy等[25]同樣發(fā)現(xiàn)Nusap1在人肝癌組織和細胞系中表達上調(diào)，是miR-193a-5p的直接作用靶點，且腫瘤組織中Nusap1的水平升高與患者生存時間縮短密切相關；下調(diào)肝癌細胞株Huh7和Hep3B中Nusap1的表達后，其細胞增殖能力、克隆形成能力、遷移能力明顯減弱，凋亡率上升，且引起細胞周期阻滯；在體外實驗中同樣證明抑制Nusap1的表達可以減緩腫瘤的生長。在浸潤性乳腺癌中，Nusap1也呈高表達，下調(diào)Nusap1可以通過調(diào)控CDK1和DLGAP5的表達，抑制乳腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲，增強對表柔比星的敏感性[16]；在三陰性乳腺癌中，高水平的Nusap1與患者預后差相關[17]。在口腔鱗癌中，抑制Nusap1的表達，可以提高腫瘤對紫杉醇的化療敏感性[26]。Gordon等[27-28]發(fā)現(xiàn)Nusap1在前列腺癌中表達上調(diào)，可作為早期前列腺癌的腫瘤標記物，并通過增強前列腺癌細胞的增殖和侵襲能力來促進前列腺癌的進展，且Nusap1的表達受到E2F1和RB1基因的調(diào)控。在腦腫瘤的相關研究中，Wu等[29]發(fā)現(xiàn)與正常星形細胞和腦組織相比，Nusap1在腫瘤組織和細胞系中表達上調(diào)，并通過激活Hedgehog信號通路增強腫瘤細胞侵襲性，促進星形細胞瘤的進展，可能是星形細胞瘤的潛在預后生物標志物和靶點。但是，Nusap1在膽管癌中仍未見任何相關報道。

本研究首先通過GEPIA數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)，膽管癌組織中Nusap1的mRNA表達水平明顯高于正常膽管組織。然后首次通過免疫組化證明，膽管癌組織中Nusap1蛋白的表達水平顯著高于對應癌旁組織。這與肝癌、乳腺癌等惡性腫瘤中的研究結(jié)果一致。同時統(tǒng)計分析提示，Nusap1 的表達水平與患者臨床TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及術后生存狀態(tài)顯著相關，而與患者年齡、性別、腫瘤大小、CA19-9水平、分化程度無明顯關聯(lián)。進一步Kaplan-Meier生存分析也顯示Nusap1蛋白陽性組患者術后總生存期較陰性組顯著縮短；其中Nusap1蛋白陽性組患者術后中位生存時間為23個月，陰性組患者術后中位生存時間為45個月，這些提示，Nusap1 與膽管癌患者的不良預后密切相關。但Nusap1蛋白在膽管癌細胞周期進程中的具體調(diào)控分子機制還有待進一步的研究。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)，Nusap1在膽管癌組織中高表達，并與患者不良預后密切相關。Nusap1高表達患者，其術后生存時間顯著縮短。本研究為更深入認識Nusap1在膽管癌中的生物學功能，尋找新的膽管癌治療靶點提供了一定的思路。但關于Nusap1影響膽管癌發(fā)生發(fā)展的具體機制尚不明確，還需要大量的實驗去研究探索。