李春艷，趙欣，樊寧，胡勇，李亮，高巧營(yíng)，陳穎，王麗，崔云峰

（1.天津醫(yī)科大學(xué)研究生院，天津300070；天津市南開(kāi)醫(yī)院 3.超聲科 4.中西醫(yī)結(jié)合急腹癥研究所 5.肝膽胰外科一 ，天津300100；2.天津市北辰區(qū)中醫(yī)醫(yī)院 普通外科，天津 300400）

膽囊膽固醇結(jié)石?。╟holesterol gallstone disease，CGD）是常見(jiàn)的消化系統(tǒng)疾病，同時(shí)也是膽囊癌及膽系腫瘤的危險(xiǎn)因素，好發(fā)于成年女性[1-2]?，F(xiàn)今大量研究表明CGD的發(fā)生發(fā)展受到多個(gè)基因、環(huán)境和遺傳因素等的相互作用調(diào)控，是多因素決定的復(fù)雜性狀疾病[3]。國(guó)內(nèi)外流行病學(xué)以及遺傳學(xué)研究提示種族差異以及遺傳異質(zhì)性在CGD的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中具有重要的作用[4-5]?，F(xiàn)今基于數(shù)量性狀位點(diǎn)分析和全基因組關(guān)聯(lián)研究等篩選出了60余個(gè)膽石?。╣allstone，GD）的易感基因/位點(diǎn)[6-7]。然而目前發(fā)現(xiàn)的大部分GD候選基因是基于小鼠GD模型發(fā)現(xiàn)的，這些候選基因在家族遺傳性CGD患者（hereditary cholesterol gallstone，HCGD）肝組織中的表達(dá)情況尚未見(jiàn)報(bào)道，筆者的前期研究[8]發(fā)現(xiàn)固醇攜帶蛋白2（sterol carrier protein-2，SCP2）在HCGD中高表達(dá)，因此，基于前期研究和查閱國(guó)內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)[3,6,8-10]，筆者在與GD相關(guān)核受體（nuclear receptors，NRs）基因、合成酶基因、膜轉(zhuǎn)運(yùn)體基因中篩選了7 個(gè)與脂代謝相關(guān)的NRs基因：肝X受體α（liver X recepter α，LXRα）、法尼醇X受體（farnesoid X receptor，F(xiàn)XR）、甾醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白2（sterol regulatory element binding protein 2，SREBP-2）、雌激素受體α/β（estrogen receptors α/β，ERα/β）、G 蛋白偶聯(lián)受體3 0（G proteincoupled receptor30，GPR30）、過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferator activated receptor γ，PPARγ）基因，并采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time quantitative reverse transcriptase PCR，qRT-PCR）檢測(cè)其在漢族人群HCGD、散發(fā)性CGD患者（sporadic cholesterol gallstone，SCGD）和非膽結(jié)石患者（gallstone-free controls，對(duì)照組）肝組織mRNA水平表達(dá)變化，以期進(jìn)一步從分子水平探討HCGD發(fā)病機(jī)制奠定基礎(chǔ)，同時(shí)也為探尋早期治療HCGD患者有效藥物靶點(diǎn)提供參考。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象和實(shí)驗(yàn)標(biāo)本來(lái)源

收集自2016年9月—2017年9月于天津市南開(kāi)醫(yī)院肝膽胰外科一住院行手術(shù)治療患者肝組織20～30 mg，入選患者均為天津市漢族常住人口，經(jīng)空腹B超或手術(shù)診斷為膽囊膽固醇結(jié)石。本研究經(jīng)醫(yī)院學(xué)術(shù)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)（2017-020P），患者均簽署知情同意書(shū)。

納入標(biāo)準(zhǔn)：⑴年齡18～80周歲，性別不限；⑵ HCGD組三代直系血親中至少兩代，且每代中至少有1例CGD患者（經(jīng)空腹B超或手術(shù)診斷）；⑶ SCGD組除患者本人外，三代直系血親中經(jīng)空腹B超診斷無(wú)膽囊膽固醇結(jié)石；⑷ 對(duì)照組為肝血管瘤患者行手術(shù)治療，并經(jīng)空腹B超診斷無(wú)膽石病、無(wú)泌尿系結(jié)石的患者。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并有與膽固醇代謝紊亂相關(guān)疾病，如肥胖、糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化疾病等；酗酒、藥物（近1個(gè)月服用降低膽固醇的藥物）、妊娠、嚴(yán)重的心血管疾病、惡性腫瘤等。最終納入對(duì)照組患者7例，其中男2例，女5例；年齡30～77歲；HCGD組患者9例，其中男 4例，女5例；年齡20～58歲；SCGD組9例，其中男3例，女6例；年齡31～66歲。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

動(dòng)物組織總R N A 提取試劑盒（離心柱型，DP431）、SuperReal PreMix Plus（SYBR Green, F P 2 0 5）均購(gòu)自天根生物科技（北京）有限公司，TransScript? First-Strand cDNA Synthesis SuperMix（AT301）購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)（TransGen Biotech）有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)本收集 ⑴ 血液標(biāo)本的收集：各實(shí)驗(yàn)組患者于入院次日空腹平臥外周靜脈采血，離心，取血清備用。⑵ 肝組織標(biāo)本收集：簽署知情同意書(shū)后，于術(shù)中取20～30 mg 肝組織。

1.3.2 血脂的測(cè)定 使用全自動(dòng)生化分析儀，酶法檢測(cè)血清總膽固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、高密度脂蛋白（high-density lipoprotein，HDL）、低密度脂蛋白（low-density lipoprotein, LDL）、載脂蛋白A1（apolipoprotein A1，ApoA1）、 載脂蛋白B（apolipoprotein B，ApoB）、脂蛋白（a）[Lipoprotein（a），Lp（a）]、總膽汁酸（total bile acid，TBA）。

1.3.3 紅外光譜法定性膽囊結(jié)石化學(xué)成分 收集術(shù)后患者膽囊結(jié)石，生理鹽水反復(fù)沖洗干凈，晾干研磨后稱(chēng)取結(jié)石1 mg 和溴化鉀粉末100 mg，充分混合均勻后采用紅外光譜分析法檢測(cè)膽囊結(jié)石成分以確定為膽固醇結(jié)石。

1.3.4 檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組脂質(zhì)代謝相關(guān)基因mRNA 相對(duì)表達(dá)量 通過(guò)Primer 5.0 軟件設(shè)計(jì)脂質(zhì)代謝相關(guān)引物，并通過(guò)Blast 檢測(cè)引物的特異性，引物列表見(jiàn)表1，由上海生工生物技術(shù)公司合成引物。使用動(dòng)物組織總RNA 提取試劑盒從人肝臟組織中提取總RNA。分別采用分光光度法和瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA 濃度、純度和完整性。采用SYBR Green 法進(jìn)行qRT-PCR 檢測(cè)各組核受體LXRα、FXR、SREBP2、ERα、ERβ、GPR30、PPAR?基因mRNA 的表達(dá)。具體步驟如下：反應(yīng)體系總體 積 為20 μL，包 括2× SuperReal PreMix Plus 10 μL, 50×ROX Reference Dye 1 μL，cDNA 模板2 μL，正反向引物各0.6 μL 和RNase-Free ddH2O 5.8 μL。反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃ 15 min，變性 95 ℃ 10 s，退火59 ℃ 20 s，進(jìn)行40 個(gè)循環(huán)，終末延伸72 ℃ 32 s。ABI7500Fast 實(shí)時(shí)定量PCR 儀進(jìn)行PCR 反應(yīng)，結(jié)束后讀取Ct 值。結(jié)果采用2-ΔΔCt法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。

表1 相關(guān)基因引物序列Table 1 Primer sequences of the studied genes

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 19.0軟件和Graph Pad Prism 7.04 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析和作圖。正態(tài)分布計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示；組間差異比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），總體均數(shù)有差異的，進(jìn)一步采用LSD分別檢驗(yàn)兩組間均數(shù)差異；計(jì)量變量比較采用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行分析；Spearman相關(guān)系數(shù)分析觀測(cè)指標(biāo)間的相關(guān)性。所有統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)均為雙側(cè)檢驗(yàn)，以P＜0.05作為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié) 果

2.1 研究對(duì)象一般資料

臨床資料顯示，對(duì)照組、HCGD組、SCGD組組間性別組成、年齡、體質(zhì)量指數(shù)（BMI）差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）（表2）。

表2 三組患者一般資料比較Table 2 Comparison of the general data among the three groups of patients

2.2 血清脂代謝相關(guān)指標(biāo)

HCGD組、SCGD組血清TC、TG、LDL、ApoA1、ApoB、Lp（a）含量較對(duì)照組升高，HDL含量較對(duì)照組降低，但各組間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）；HCGD組TBA含量較對(duì)照組、SCGD組明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P ＜0.0 5）（表3）。

表3 三組血清脂代謝相關(guān)指標(biāo)比較（x-±s）Table 3 Comparison of the serum lipids metabolism related variables among the three groups (x-±s)

2.3 調(diào)節(jié)肝脂質(zhì)代謝NRs mRNA 的表達(dá)

LXRα和GPR 30m RNA在各組肝組織表達(dá)量無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＞0.05）；與對(duì)照組比較，ERα mRNA在HCGD組和SCGD組表達(dá)均明顯上調(diào)（均P＜0.01），且HCGD組ERα mRNA相對(duì)表達(dá)量高于SCGD組（P＜0.05）；FXR mRNA在SCGD組明顯上調(diào)（P＜0.05），而在HCGD組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；ERβ mRNA在HCGD組表達(dá)明顯上調(diào)（P＜0.05），而在SCGD組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；SREBP2和PPARγ mRNA在HCGD組表達(dá)均明顯上調(diào)（均P＜0.01），而SCGD組均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＞0.05）（表4）。

表4 三組患者肝組織NRs 基因相對(duì)表達(dá)量比較（±s）Table 4 Comparison of mRNA expressions of NRs among the three groups of patients (±s)

表4 三組患者肝組織NRs 基因相對(duì)表達(dá)量比較（±s）Table 4 Comparison of mRNA expressions of NRs among the three groups of patients (±s)

注：1）與對(duì)照組比較，P＜0.05；2）與SCGD 組比較，P＜0.05Note: 1) P＜0.05 vs. control group; 2) P＜0.05 vs. SCGD group

基因 對(duì)照組（n=7）HCGD 組（n=9）SCGD 組（n=9） F P LXRɑ 1.00±0.45 1.12±0.23 1.44±0.80 0.502 0.620 FXR 1.00±0.60 1.45±0.55 2.43±0.551) 5.442 0.032 SREBP2 1.00±0.36 2.72±0.531), 2) 0.97±0.20 30.836 0.000 ERɑ 1.00±0.68 14.24±2.981), 2) 10.99±1.881) 46.660 0.000 ERβ 1.00±0.36 24.76±21.061) 20.82±11.21 3.400 0.079 GPR30 1.00±0.52 2.44±0.72 3.11±1.46 3.707 0.073 PPARγ 1.00±0.46 11.71±6.901), 2) 0.05±0.03 15.860 0.002

2.4 肝組織 SREBP2、ERα、ERβ、PPARγ mRNA 表達(dá)與血清TBA 的相關(guān)性

分析結(jié)果顯示，僅在HCGD組中ERα、ERβ m R N A 表達(dá)與患者血清T B A 水平呈明顯負(fù)相關(guān)（r=-1.000，P=0.000；r=-0.989，P=0.011）（表5）。

表5 三組SREBP2、ERα/β、PPARγ mRNA 表達(dá)與血清TBA 相關(guān)性分析Table 5 Correlation analysis of mRNA expressions of SREBP2, ERα/β and PPARγ with serum TBA in the three groups

3 討 論

脂質(zhì)代謝紊亂是CGD形成過(guò)程中肝細(xì)胞所發(fā)生的重要表型變化[6,11-12]，與高脂血癥、代謝綜合征、動(dòng)脈粥樣硬化、冠心病、肥胖、糖尿病、阿爾茲海默病、腫瘤等多種疾病相關(guān)[13]。NRs不僅調(diào)節(jié)機(jī)體生長(zhǎng)發(fā)育、細(xì)胞分化與增殖、免疫，而且還參與機(jī)體內(nèi)眾多生理，特別是代謝過(guò)程中的基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)控。與其它轉(zhuǎn)錄因子不同，NRs可直接與甾體、膽汁酸等配體結(jié)合[9,14]。筆者的前期研究[5]發(fā)現(xiàn)GD具有家族聚集性且符合常染色體延遲遺傳的特點(diǎn)。NRs在HCGD中的表達(dá)尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究顯示，血清TC、TG、LDL、ApoA1、ApoB、Lp（a）在各組間無(wú)顯著性差異，與Jiang等[15]的研究結(jié)果一致。

ERα和ERβ屬于經(jīng)典的雌激素核受體，通過(guò)調(diào)節(jié)下游靶基因的轉(zhuǎn)錄而發(fā)揮“基因型”調(diào)節(jié)作用[16]。研究顯示小鼠CGD動(dòng)物模型中，17β-雌二醇主要通過(guò)雌激素受體（estrogen receptors，ERs）對(duì)靶基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控在肝膽汁膽固醇的生物合成以及致石病理生理過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用。此外，小鼠肝臟的染色質(zhì)免疫沉淀實(shí)驗(yàn)顯示，有43種脂質(zhì)相關(guān)基因是由ERα轉(zhuǎn)錄調(diào)控的[17]。deBari等[18]在去卵巢選擇性敲除ERs的ER（-/-）雌性小鼠中觀察到，其成石率較ER（+/+）組降低了70%，提示靶向性的阻斷ERα基因表達(dá)，可預(yù)防高脂飲食并且暴露于高水平雌激素的小鼠CGD的形成。本研究發(fā)現(xiàn)，HCGD組、SCGD組ERα mRNA表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組，同時(shí)HCGD組ERαmRNA表達(dá)水平明顯高于SCGD組，提示ERα基因不僅參與CGD發(fā)病，而且可能在CGD的遺傳中起著一定的作用，具體的分子機(jī)制尚需進(jìn)一步的研究。在本研究中，ERαmRNA 在CGD中高表達(dá)，這與大部分文獻(xiàn)報(bào)道的一致。Wang等[19]的研究發(fā)現(xiàn)CGD的發(fā)病與ERα上調(diào)相關(guān)，而與ERβ無(wú)關(guān)；這可能與ERα和ERβ具有不同的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域、組織分布特異性以及不同的剪接變異有關(guān)。然而，本研究發(fā)現(xiàn)，HCGD組中ERβmRNA表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組，提示ERβ可能參與了高表達(dá)ERα人群CGD遺傳性。同時(shí)，本研究還發(fā)現(xiàn)，HCGD組血清TBA比對(duì)照組、SCGD組顯著降低，并且相關(guān)性分析顯示，HCGD組血清TBA與ERα/βmRNA水平相關(guān)。GPR30是 7次跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的受體蛋白，屬于G蛋白受體偶聯(lián)超家族。目前，GPR30在膽石病中作用的研究還較少。有研究[20]表明，17β-雌二醇不僅通過(guò)激活ERα 引起去卵巢小鼠膽汁膽固醇和膽鹽代謝紊亂，而且還通過(guò)GPR30途徑參與膽固醇結(jié)晶的形成過(guò)程。在本研究中未發(fā)現(xiàn)GPR30 mRNA在對(duì)照組、HCGD組和SCGD組中顯著差異表達(dá)。

SREBP2是肝膽固醇從頭合成限速酶3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A 還原酶（3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase，HMGCR）的主要轉(zhuǎn)錄因子。筆者前期研究[21]發(fā)現(xiàn)CGD患者肝組織HMGCR mRNA表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組患者。PPARγ調(diào)控異常與肥胖、2 型糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化等糖脂代謝紊亂疾病相關(guān)，在小鼠膽石模型中被確認(rèn)為膽石易感基因[22]，然而，Schafmayer等[23]在德國(guó)人群中卻未發(fā)現(xiàn)PPARγ與膽石易感的相關(guān)證據(jù)。在本研究中，HCGD組SREBP2、PPARγ mRNA表達(dá)水平高于對(duì)照組和SCGD組；然而，SCGD組SREBP2、PPARγ mRNA表達(dá)水平與對(duì)照組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示HCGD和SCGD可能存在不同的發(fā)病機(jī)制及CGD的遺傳異質(zhì)性；SREBP2、PPARγ可能參與了HCGD的發(fā)病，然而SCGD人群CGD的發(fā)病可能是由其他與肝脂質(zhì)代謝或肝膽汁酸代謝相關(guān)的基因發(fā)揮調(diào)控作用或者是由同一基因的不同突變類(lèi)型誘導(dǎo)，從而掩蓋了SREBP2、PPARγ的調(diào)控效應(yīng)，說(shuō)明CGD發(fā)病機(jī)制的復(fù)雜性。

LXRα主要在肝臟、脂肪組織和小腸組織中表達(dá)[24]，可調(diào)節(jié)膽固醇吸收、運(yùn)輸、排泄及轉(zhuǎn)化為膽汁酸的蛋白質(zhì)的基因表達(dá)。Jiang等[15]發(fā)現(xiàn)中國(guó)CGD患者（非肥胖型、血脂正常）的核受體LXRα比對(duì)照組的表達(dá)水平增加，主要是通過(guò)調(diào)節(jié)下游靶基因ABCG5/G8實(shí)現(xiàn)的。然而，本研究結(jié)果顯示，LXR mRNA表達(dá)水平在對(duì)照組、HCGD組和SCGD組中均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，與楊士勇等[25]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。FXR也稱(chēng)為膽汁酸受體，Moschetta 等[26]發(fā)現(xiàn)與野生型小鼠相比，F(xiàn)XR基因敲除小鼠喂食致石飼料僅1周后即表現(xiàn)出CGD的所有病理表型，提示FXR的功能與CGD相關(guān)。其機(jī)制可能是FXR基因敲除后引起與膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因ABCB11 以及與磷脂轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因ABCB4的表達(dá)下調(diào)，使膽汁酸和磷脂的轉(zhuǎn)運(yùn)受損；與膽汁酸合成的相關(guān)基因CYP27A1、CYP7A1和CYP8B1的表達(dá)上調(diào)引起膽固醇飽和指數(shù)增加，最終膽固醇結(jié)晶析出。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SCGD組FXR mRNA表達(dá)水平高于對(duì)照組和HCGD組，而HCGD組FXR mRNA表達(dá)水平與對(duì)照組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示FXR可能參與了SCGD的發(fā)生。然而楊士勇等[25]的研究顯示，CGD患者肝臟FXR mRNA的表達(dá)與膽固醇結(jié)石形成無(wú)關(guān)。這也從另一側(cè)面提示SCGD人群和HCGD人群攜帶的FXR基因可能存在多態(tài)性。

綜上所述，核受體基因ERα/ERβ、SREBP2、PPARγ與HCGD發(fā)病相關(guān)，這些基因可能在CGD的遺傳中起著一定的作用。其中，SREBP2、PPARγ在HCGD發(fā)病與SCGD發(fā)病中可能存在不同的調(diào)控機(jī)制。肝臟中“ERα-SREBP2”的調(diào)節(jié)通路可能參與了HCGD的發(fā)生。進(jìn)一步明確肝組織NRs基因FXR、ERα/β、SREBP2和PPARγ在CGD形成過(guò)程中具有重要的作用，今后探尋這些基因間相互作用的重要調(diào)控點(diǎn)以及調(diào)控的下游靶基因，或可為防治CGD及其他脂質(zhì)代謝紊亂疾病的藥物靶點(diǎn)提供理論基礎(chǔ)。肝NRs mRNA在CGD與非膽石肝組織中表達(dá)存在差異，而且SCGD和HCGD中也存在不同的基因表達(dá)。進(jìn)一步證明CGD是微效多基因遺傳性疾病。本研究?jī)H在mRNA水平探尋與HCGD相關(guān)的核受體基因，尚需進(jìn)一步進(jìn)行Western blot和免疫組化等從蛋白水平證實(shí)NRs蛋白表達(dá)情況，以期進(jìn)一步從轉(zhuǎn)錄后或翻譯后水平探討核受體在CGD中基因調(diào)控機(jī)制。