宋本如 甄梅楠 劉小妹 唐景春

摘?要?masD和bamA基因分別是烷烴和芳烴厭氧降解的關(guān)鍵基因。本研究建立了這兩種基因的SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法。通過參考相關(guān)石油烴厭氧降解菌株的GenBank序列，利用Primer express軟件設(shè)計(jì)烷烴和芳烴厭氧降解基因的擴(kuò)增引物masD-f、masD-r和bamA-f、bamA-r。經(jīng)過常規(guī)PCR擴(kuò)增分別得到片段大小為389和354 bp擴(kuò)增產(chǎn)物，經(jīng)測(cè)序并在NCBI數(shù)據(jù)庫查詢，確定為masD和bamA片段。通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR構(gòu)建測(cè)定這兩種基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線。優(yōu)化后的擴(kuò)增體系（25 μL）為： 12.5 μL 2×Trans Start Top Green qPCR Super Mix，引物濃度為0.2 μmol/L，masD和bamA基因最適退火溫度分別為52℃和56℃。建立的兩種基因的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法具有非常好的重復(fù)性，其靈敏度比傳統(tǒng)PCR技術(shù)高100倍。對(duì)于氧化石墨烯促進(jìn)石油烴的厭氧降解體系中厭氧基因的定量檢測(cè)顯示，添加不同濃度的石墨烯均促進(jìn)了bamA拷貝數(shù)的增加，但對(duì)masD的拷貝數(shù)無顯著影響。

關(guān)鍵詞?石油烴; 厭氧降解基因; masD基因; bamA基因; 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

1?引 言

隨著石油工業(yè)迅速發(fā)展，石油烴在土壤和水體中的污染已成為普遍的環(huán)境問題[1]。好氧生物修復(fù)被認(rèn)為是修復(fù)石油烴污染的有效方法。然而，在許多被污染環(huán)境（如沉積物和地下水）中，通過提供氧氣刺激微生物的生長(zhǎng)非常困難，而且成本高昂[2]。大量研究表明，石油烴在缺氧或厭氧的環(huán)境下同樣可以被兼性菌和厭氧菌降解[3]，這一新觀點(diǎn)對(duì)于石油污染土壤、地下水及沉積物環(huán)境的原位生物修復(fù)，特別是針對(duì)一些分散的面源污染及工程修復(fù)條件較差的石油污染環(huán)境具有重要的意義。

超過半數(shù)的石油污染的主要成分是烷烴[4]。在（1-甲基烷基）琥珀酸合酶（mas）催化下的富馬酸加成反應(yīng)是大多數(shù)厭氧降解菌活化烷烴降解的關(guān)鍵步驟[5，6]。芳烴是石油污染中的重要成分，也是最常見的地下水土污染物。在厭氧環(huán)境中，大多數(shù)芳香族碳?xì)浠衔铮ㄈ绫较滴?、多環(huán)芳烴等）都經(jīng)過微生物作用，形成中間體6-十六氧環(huán)烯基-CoA。該中間體開環(huán)反應(yīng)的關(guān)鍵酶是由bamA基因編碼的6-十六氧環(huán)-1-烯-1-羰基CoA水解酶[7，8]，且bamA基因在可降解芳香烴污染物的厭氧微生物中廣泛存在。因此，將編碼這兩種關(guān)鍵酶的bamA基因和催化亞基masD基因作為遺傳標(biāo)記，為研究石油烴降解菌在厭氧環(huán)境中的分布特征和降解潛力提供了一種方法。實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Real time-qPCR）是20世紀(jì)90年代中期逐漸發(fā)展起來的技術(shù)，它可以對(duì)目的基因進(jìn)行定量檢測(cè)，是一種快速高效、準(zhǔn)確靈敏、方便易操作的檢測(cè)方法[9，10]。SYBR Green I作為一種實(shí)時(shí)定量PCR的熒光染料，在游離狀態(tài)下不發(fā)出熒光，與單鏈DNA基本不結(jié)合，但可與DNA雙鏈非特異性結(jié)合，并發(fā)出熒光，具有通用性好、成本低等優(yōu)點(diǎn)[11，12]。然而，目前實(shí)時(shí)定量PCR方法在石油烴厭氧降解方面的應(yīng)用還很少[13]。

氧化石墨烯具有豐富的官能團(tuán)和較高的比表面積，可以在厭氧條件下被許多微生物部分還原，可促進(jìn)電子轉(zhuǎn)移[14]。所有這些特征都有助于催化厭氧微生物對(duì)污染物的降解[15]。據(jù)報(bào)道，氧化石墨烯和部分還原的氧化石墨烯可促進(jìn)難降解污染物的生物和非生物降解，如偶氮染料、硝基芳族化合物和鹵化污染物[16，17]。但也有文獻(xiàn)指出，氧化石墨烯能夠吸附并破壞微生物的細(xì)胞壁，從而抑制微生物的生長(zhǎng)[18]。因此，研究厭氧條件下氧化石墨烯對(duì)石油烴生物降解的影響具有重要意義。

本研究利用SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)建立了一種檢測(cè)石油污染厭氧環(huán)境中烷烴降解基因masD及芳烴降解基因bamA的方法。優(yōu)化了反應(yīng)體系組成、退火溫度，并以氧化石墨烯對(duì)石油烴厭氧降解影響實(shí)驗(yàn)為應(yīng)用實(shí)例，定量檢測(cè)了厭氧培養(yǎng)體系中烷烴和芳烴降解基因隨時(shí)間的變化。

2?實(shí)驗(yàn)部分

2.1?儀器與試劑

CFX96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀、T100梯度型PCR儀（美國(guó)Bio-Rad公司）; Nano-100微量分光光度計(jì)（杭州奧盛儀器有限公司）。DP336土壤基因組DNA提取試劑盒、DP209瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒和DP302細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司）; D1100質(zhì)粒小量提取試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）; Premix Taq、RNase-Free Water（寶生物工程有限公司）; AQ131熒光定量PCR試劑盒、CT101pEASY-T1克隆試劑盒和CD501Trans-T1感受態(tài)細(xì)胞（北京全式金生物技術(shù)有限公司）。

2.2?引物的設(shè)計(jì)和合成

參考相關(guān)石油烴厭氧降解菌株的GenBank序列，利用Primer express軟件設(shè)計(jì)出擴(kuò)增引物masD-f、masD-r和bamA-f、bamA-r，可分別擴(kuò)增厭氧微生物降解烷烴的關(guān)鍵基因（1-甲基烷基）琥珀酸合酶基因和降解芳烴的關(guān)鍵基因6-十六氧環(huán)-1-烯-1-羰基CoA水解酶基因的保守序列。引物序列、目的片段長(zhǎng)度、理論P(yáng)CR退火溫度見表1。

2.3?DNA的提取及降解基因陽性模板制備

從天津市津南區(qū)污水處理廠二沉池采集厭氧活性污泥至于聚乙烯瓶中，4℃密封保存。用土壤基因組DNA提取試劑盒進(jìn)行DNA提取，用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行DNA檢測(cè)。masD和bamA基因特異性PCR擴(kuò)增的升溫程序?yàn)椋?94℃預(yù)變性4 min; 94℃變性30 s，masD和bamA退火溫度分別為52℃和56℃保持30 s，72℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5 min。PCR擴(kuò)增體系如下： Premix Taq 12.5 μL，10 μmol/L的前后引物各0.5 μL，DNA模板2.0 μL，RNase-Free Water 9.5 μL。將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，檢測(cè)擴(kuò)增特異性。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收純化后，連接到pEASY-T1載體上，并轉(zhuǎn)化到Trans-T1感受態(tài)細(xì)胞中。通過藍(lán)白斑篩選選取白色單菌落接種到LB培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)24 h[21]。提取重組質(zhì)粒由生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序，結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫查詢比對(duì)。

2.4?實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)條件優(yōu)化

實(shí)時(shí)熒光定量PCR 25 μL反應(yīng)體系： 12.5 μL的2×TransStart Top Green qPCR Super Mix，前后引物各0.5 μL，9.5 μL RNase-Free Water，2.0 μL經(jīng)多次10倍梯度稀釋的重組質(zhì)粒DNA模板，同時(shí)設(shè)置無DNA模板的陰性對(duì)照。為得到最合適的引物濃度及退火溫度，將實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物最終濃度分別設(shè)置為0.1、0.2和0.4 μmol/L，將兩種引物的退火溫度均依次設(shè)置為48℃、52℃和56℃。實(shí)時(shí)熒光定量PCR的反應(yīng)程序?yàn)椋?94℃預(yù)變性30 s; 94℃變性5 s，相應(yīng)引物設(shè)置的退火溫度保持15 s，72℃延伸10 s， 共設(shè)40個(gè)循環(huán)。熔解曲線程序： 50℃保持5 s，然后逐漸升到95℃（增量為0.5℃/s）。

2.5?標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

將2 μL重組質(zhì)粒滴加到微量分光光度計(jì)樣品池，以蒸餾水做空白對(duì)照，以260 nm波長(zhǎng)處的吸光度測(cè)定其濃度，以230、260、280 nm波長(zhǎng)處的吸光度比值確定其純度。通過公式計(jì)算出重組質(zhì)粒的拷貝數(shù)。每微升重組質(zhì)粒模板中的相應(yīng)基因的拷貝數(shù)（CN）： CN=[（X/（3928+b）/660）]×10-9×6.02×1023[22]，其中X為陽性質(zhì)粒濃度（μg/mL）; pEASY-T1載體長(zhǎng)3928 bp; b為masD和bamA片斷長(zhǎng)度，分別為389和354 bp; 每對(duì)堿基的平均分子量是660 Da。將已測(cè)定濃度的重組質(zhì)粒進(jìn)行多次10倍梯度稀釋作為實(shí)時(shí)熒光定量PCR的模板。根據(jù)模板起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)與循環(huán)閾值（Ct）具有反比的線性關(guān)系建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，作為樣品中masD和bamA降解基因定量的依據(jù)。

2.6?氧化石墨烯對(duì)石油烴厭氧降解影響實(shí)驗(yàn)

在厭氧手套箱中，將0.01 g厭氧活性污泥轉(zhuǎn)移到含有100 mL滅菌無機(jī)鹽培養(yǎng)基的120 mL無菌血清瓶中[23]。向培養(yǎng)體系中加入100 μL 6種正構(gòu)烷烴（C15～C20）和4種苯系物（苯、甲苯、乙苯、二甲苯）等濃度混合石油烴，作為唯一碳源，添加10 mmol/L NaNO3和Na2SO4作為混合電子受體。向厭氧體系中加入不同濃度的氧化石墨烯（0.02、0.2和2 mg/L），密封，在30℃、160 r/min條件下避光培養(yǎng)。對(duì)照組于121℃高壓滅菌20 min。分別在第2、4、6和10周進(jìn)行取樣，利用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒對(duì)樣品DNA進(jìn)行提取，并采用熒光定量PCR測(cè)定樣品中兩種厭氧降解基因的含量。

3?結(jié)果與討論

3.1?masD和bamA基因陽性克隆的特異性擴(kuò)增

為得到masD和bamA基因的陽性克隆，對(duì)厭氧活性污泥進(jìn)行DNA提取，并利用設(shè)計(jì)合成的兩種基因的引物對(duì)提取的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行連接轉(zhuǎn)化藍(lán)白斑篩選陽性重組細(xì)胞，將重組細(xì)胞培養(yǎng)并提取重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，并在NCBI數(shù)據(jù)庫查詢比對(duì)，結(jié)果表明，兩種PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分別為masD和bamA基因。降解基因masD和bamA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果表明，經(jīng)過擴(kuò)增分別得到的產(chǎn)物都只顯示一個(gè)條帶，長(zhǎng)度分別為389 bp（masD）和354 bp（bamA），與理論擴(kuò)增產(chǎn)物片段長(zhǎng)度一致，說明設(shè)計(jì)的引物序列、反應(yīng)體系適合對(duì)降解基因masD和bamA進(jìn)行特異性擴(kuò)增。

3.2?實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化

不同引物濃度條件下masD和bamA基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR的熔解曲線隨溫度變化，縱坐標(biāo)為熒光強(qiáng)度對(duì)溫度求導(dǎo)。當(dāng)引物最終濃度為0.1和0.4 μmol/L時(shí)，兩種基因在75℃時(shí)均出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增雜峰的干擾，出現(xiàn)假陽性現(xiàn)象。但當(dāng)PCR反應(yīng)體系中前后引物最終濃度均為0.2 μmol/L時(shí)，兩種基因的PCR擴(kuò)增均具有非常高的特異性，且未產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增雜峰。

當(dāng)引物最終濃度為0.2 μmol/L時(shí)，不同退火溫度下masD和bamA基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR的熔解曲線。退火溫度為48℃和56℃時(shí)，熔解曲線出現(xiàn)多條非特異性擴(kuò)增雜峰及假陽性現(xiàn)象; 當(dāng)退火溫度為52℃時(shí)，熔解曲線峰型單一，顯示出非常高的特異性，說明52℃為擴(kuò)增masD降解基因最佳退火溫度。從bamA降解基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR的熔解曲線可見，降解基因bamA熒光定量PCR的最佳退火溫度為56℃，擴(kuò)增具有很高的特異性，且未產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增雜峰。經(jīng)優(yōu)化后，體系中引物最適最終濃度為0.2 μmol/L，引物masD-f、masD-r和bamA-f、bamA-r最佳退火溫度分別為52℃和56℃。

3.3?標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

masD降解基因的熒光定量PCR檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線為Ct=5.471lgC + 42.207，相關(guān)系數(shù)R2=0.999，根據(jù)每次循環(huán)反應(yīng)體系的相對(duì)熒光單位的增加量得到擴(kuò)增效率E=53.0%; bamA降解基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線為Ct=4.764lgC+40.732，R2=0.992，擴(kuò)增效率E=63.6%。降解基因masD和bamA的標(biāo)準(zhǔn)曲線均具有良好的線性關(guān)系，反應(yīng)體系的擴(kuò)增效率均較高。

3.4?重復(fù)性檢驗(yàn)

兩種基因相同濃度的DNA模板的擴(kuò)增曲線重復(fù)性良好，相同濃度的DNA模板的擴(kuò)增曲線均非常接近，有的幾乎重合?；赟YBR Green I熒光染料的實(shí)時(shí)熒光定量PCR已用于進(jìn)行肝炎等的臨床診斷[24]。本研究將其應(yīng)用于masD和bamA這兩種石油烴厭氧降解關(guān)鍵基因的定量檢測(cè)，通過對(duì)設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行濃度和退火溫度的優(yōu)化，檢測(cè)方法具有高的穩(wěn)定性和重復(fù)性。

3.5?靈敏性檢驗(yàn)

經(jīng)實(shí)驗(yàn)，基于SYBR Green I 熒光染料的實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，能檢測(cè)到的masD和bamA基因模板質(zhì)粒最低的初始拷貝數(shù)濃度分別為6.6和5.0 copy/μL。將經(jīng)過梯度稀釋的這兩種基因的重組質(zhì)粒作為模板進(jìn)行普通PCR擴(kuò)增，并將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢查擴(kuò)增結(jié)果。結(jié)果表明， 當(dāng)兩種基因模板質(zhì)粒的初始拷貝數(shù)濃度分別為6.6×102和5.0×102 copy/μL時(shí)，普通PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在含0.5 mg/L EB的瓊脂糖凝膠中的電泳結(jié)果能觀察到清晰的條帶。說明利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)兩種石油烴厭氧降解基因檢測(cè)的靈敏度比利用普通PCR技術(shù)高約100倍，與文獻(xiàn)[25]靈敏度相當(dāng)。這為評(píng)估厭氧環(huán)境中微生物厭氧降解石油烴的潛力提供了高效、靈敏的方法。

3.6?對(duì)厭氧培養(yǎng)體系中降解基因的測(cè)定

添加不同濃度氧化石墨烯的培養(yǎng)體系中masD的拷貝數(shù)在前6周逐漸降低，隨后又略有增加。培養(yǎng)基中masD基因的拷貝數(shù)的最小值和最大值分別為97.2和288.7 copy/mL。氧化石墨烯的添加使masD的拷貝數(shù)在第6周顯著低于對(duì)照組（p<0.05），在第10周顯著高于對(duì)照組（p<0.05）。氧化石墨烯的添加量對(duì)masD的拷貝數(shù)的影響無明顯規(guī)律。

隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，添加不同濃度氧化石墨烯的培養(yǎng)體系中bamA的拷貝數(shù)均逐漸減少。培養(yǎng)基中bamA基因的拷貝數(shù)的最小值和最大值分別為48.1和365.8 copy/mL。添加氧化石墨烯的各組bamA基因的拷貝數(shù)均顯著高于空白組，其中0.02 mg/L 氧化石墨烯在第2、4周對(duì)bamA基因促進(jìn)效果最明顯，0.2 mg/L 氧化石墨烯在第6、10周對(duì)bamA基因促進(jìn)效果最明顯。說明氧化石墨烯的添加有利于促進(jìn)微生物對(duì)芳香烴的厭氧降解，對(duì)烷烴的厭氧降解促進(jìn)作用有限[14]。上述結(jié)果表明，兩種基因的熒光定量PCR方法準(zhǔn)確，可用于檢測(cè)厭氧體系中降解基因含量。

4?結(jié) 論

烷烴和芳烴是石油烴污染物的重要組成成分，masD和bamA是這兩類組分在厭氧環(huán)境中降解的關(guān)鍵基因。本研究設(shè)計(jì)了特異性引物，并特異性擴(kuò)增出兩種厭氧降解基因的DNA片段，利用SYBR Green I熒光染料結(jié)合實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)這兩種基因進(jìn)行定量檢測(cè)。優(yōu)化后的最佳反應(yīng)條件為： 引物最終濃度0.2 μmol/L，兩種基因的最適退火溫度為52℃（masD）和56℃（bamA）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，兩種基因的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法具有很高的重復(fù)性和靈敏度，靈敏度是普通PCR的100倍。本方法實(shí)現(xiàn)了對(duì)石油烴厭氧降解體系中降解基因的定量檢測(cè)，揭示了受污染環(huán)境中厭氧微生物降解石油烴的潛力，對(duì)石油污染環(huán)境的監(jiān)測(cè)和修復(fù)具有重要的借鑒意義。

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