劉宴娟 祁愛蓉 路 遙 李順民

(1 廣州中醫(yī)藥大學(xué)第四臨床醫(yī)學(xué)院腎病科，廣東省深圳市 518033，電子郵箱：851534964@qq.com；2 南方醫(yī)科大學(xué)深圳醫(yī)院腎內(nèi)科，廣東省深圳市 518033)

雷公藤提取物因具有糖皮質(zhì)激素樣藥理作用而無激素樣副作用[1]，而被廣泛用于治療腎臟疾病及多種免疫性疾病，且療效顯著[2]。但其有較高的生殖毒性，發(fā)生率達(dá)14.1%～22.5%[3-4]，其生殖毒性可導(dǎo)致女性月經(jīng)不調(diào)，甚至閉經(jīng)。研究表明，對于在育齡期接受雷公藤治療的女性患者，早期應(yīng)用雌孕激素干預(yù)治療可保護(hù)其卵巢功能。黃體酮作為卵巢分泌的孕激素，可改善雌激素水平和黃體功能，治療藥源性閉經(jīng)[5]。本研究通過采用雷公藤甲素干預(yù)體外培養(yǎng)的倉鼠卵巢細(xì)胞，觀察細(xì)胞凋亡程度，探討其對細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制，同時觀察黃體酮對雷公藤甲素所致倉鼠卵巢細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑及儀器 中國倉鼠卵巢(Chinese hamster ovary,CHO)細(xì)胞(上海中科院細(xì)胞庫，批號：GNHa3)，杜氏改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco′s modified Eagle medium，DMEM；美國Gibco公司，批號：C11995500BT)，胎牛血清(杭州四季青公司，11011-8611)，青霉素-鏈霉素溶液(雙抗；美國Gibco公司，批號：15140-122)，胰酶(美國Gibco公司，批號：12605-028)，杜氏磷酸緩沖液(Dulbecco′s phosphate-buffered saline，DPBS；美國HyClone公司，批號：SH30256.01)，膜聯(lián)蛋白Ⅴ-異硫氰酸熒光素(annexin Ⅴ-fluorescein isothiocyanate，Annexin Ⅴ-FITC)/碘化丙啶(propidium iodide，PI)雙染細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(凱基公司，批號：KGA108)，雷公藤甲素、黃體酮(純度≥98%)均購自南京春秋生物工程有限公司(批號：38748-32-2、180522A)，兔抗試劑盒Ⅰ抗、Ⅱ抗(美國ProteinSimple公司，批號：PS-ST01-8、SM-W002-1)，細(xì)胞培養(yǎng)箱(三洋電機(jī)株式會社，型號：MCO-18AIC)，離心機(jī)(上海盧湘儀離心機(jī)，型號：TDZ4-WS)，流式細(xì)胞儀(美國BD公司，型號：Accuri C6)，蛋白印跡儀(美國ProteinSimple公司，型號：WesS/N:WS-2494)。

1.2 實驗方法

1.2.1 細(xì)胞分組及培養(yǎng)：將CHO細(xì)胞接種于含10%胎牛血清及1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基中，隨機(jī)分成對照組、黃體酮組、雷公藤甲素組和雷公藤甲素+黃體酮組，分別加入等量的DMEM培養(yǎng)液、0.05 μg/ml黃體酮、0.05 μg/ml雷公藤甲素、0.05 μg/ml雷公藤甲素+0.05 μg/ml黃體酮進(jìn)行干預(yù)，每組設(shè)置3個復(fù)孔，其中雷公藤甲素、黃體酮臨用時應(yīng)用DMEM培養(yǎng)液稀釋成所需濃度。將細(xì)胞置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別于干預(yù)后6 h、12 h收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.2.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡：收集細(xì)胞，在20℃下1 500 r/min 離心5 min；加入500 μl DPBS沉淀洗滌細(xì)胞1 min；加入500 μl緩沖液重懸細(xì)胞；加入5 μl Annexin V-FITC和5 μl PI，混勻；室溫下避光孵育15 min；1 h內(nèi)上機(jī)檢測，按常規(guī)標(biāo)準(zhǔn)判定結(jié)果。

1.2.3 蛋白印跡法檢測細(xì)胞外信號調(diào)控的蛋白激酶磷酸化水平及即早基因c-fos表達(dá)水平：收集細(xì)胞后應(yīng)用裂解液裂解30 min，冰上進(jìn)行操作。收集裂解后的細(xì)胞到EP管，蛋白定量法測定細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)、即早基因c-fos蛋白水平，95℃～100℃煮沸5 min，即為樣本蛋白。每個泳道加入蛋白樣品10 μg，經(jīng)10%聚丙烯酰胺凝膠電泳后，利用濕法將蛋白轉(zhuǎn)移至膜上，用含5%脫脂奶粉封閉1 h，分別加入對應(yīng)Ⅰ抗4℃孵育過夜，洗膜3次后，加入對應(yīng)Ⅱ抗室溫?fù)u床孵育2 h，洗膜3次，發(fā)光顯影，定影后進(jìn)行分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析面。計量資料以(x±s)表示，比較采用t檢驗或方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 4組CHO細(xì)胞凋亡率比較 干預(yù)后6 h，雷公藤甲素組、雷公藤甲素+黃體酮組細(xì)胞凋亡率均高于對照組和黃體酮組(均P<0.05)，而雷公藤甲素+黃體酮組細(xì)胞凋亡率低于雷公藤甲素組(P<0.05)。干預(yù)后12 h，雷公藤甲素組細(xì)胞凋亡率高于對照組和黃體酮組(P<0.05)，但雷公藤甲素+黃體酮組細(xì)胞凋亡率與雷公藤甲素組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。雷公藤甲素組干預(yù)后6 h與12 h細(xì)胞凋亡率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，而雷公藤甲素+黃體酮組干預(yù)后12 h的細(xì)胞凋亡率低于干預(yù)后6 h(P<0.05)。見表1。

表1 4組CHO細(xì)胞凋亡率比較(x±s，%)

注：與對照組相比，*P<0.05；與黃體酮組相比，△P<0.05；與雷公藤甲素組相比，#P<0.05。

2.2 4組CHO細(xì)胞ERK磷酸化及c-fos蛋白表達(dá)水平比較 雷公藤甲素組的ERK磷酸化水平低于對照組，c-fos水平高于對照組(P<0.05)；黃體酮組的ERK磷酸化水平、c-fos水平均低于對照組(P<0.05)；雷公藤甲素+黃體酮組的ERK磷酸化水平、c-fos水平均低于對照組、雷公藤甲素組(P<0.05)，見圖1。

3 討 論

雷公藤又名斷腸草，屬衛(wèi)矛科一年生藤本植物，具有免疫調(diào)節(jié)、抗炎等藥理作用，臨床主要用于治療自身免疫性疾病，其療效較好，但副作用也較多。雷公藤主要化學(xué)成分包括雷公藤二萜(如雷公藤甲素、雷公藤內(nèi)酯酮)、三萜(如雷公藤紅素、雷公藤內(nèi)酯甲)和雷公藤生物堿(如雷酚內(nèi)酯、雷公藤次堿)等。雷公藤甲素既是發(fā)揮藥理作用的主要活性成分，也是主要的毒性成分。雷公藤甲素可通過擾亂正常的內(nèi)分泌狀態(tài)致相關(guān)因子含量變化從而引起一系列損傷，其中包括生殖系統(tǒng)損害，這限制了雷公藤制劑的臨床應(yīng)用[6-7]。本研究結(jié)果顯示，干預(yù)后6 h、12 h雷公藤甲素組細(xì)胞凋亡率均高于對照組(均P<0.05)，且雷公藤甲素組6 h與12 h細(xì)胞凋亡率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，即隨雷公藤甲素處理細(xì)胞時間延長，細(xì)胞凋亡率并不增加，提示雷公藤甲素可致CHO細(xì)胞凋亡，但并不具有時間效應(yīng)。

蛋白磷酸化對外界信號具有級聯(lián)放大作用，在胞內(nèi)介導(dǎo)胞外信號時具有專一應(yīng)答性,且調(diào)節(jié)速度快，其也是細(xì)胞外信號影響細(xì)胞基因表達(dá)調(diào)控的重要通路，對外界信號的持續(xù)反應(yīng)起重要作用?；罨慕z裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)通過磷酸化核轉(zhuǎn)錄因子、細(xì)胞骨架蛋白及酶類等參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、轉(zhuǎn)化及凋亡，而ERK為MAPK 家族的信號通路之一，包括ERK1和ERK2兩個亞型。雌激素可激活細(xì)胞中MAPK的活性，并產(chǎn)生一系列的反應(yīng)。c-fos是調(diào)控細(xì)胞對外界刺激進(jìn)行快速反應(yīng)的即早基因之一，其轉(zhuǎn)錄和翻譯不需要新蛋白質(zhì)的合成[8]。本研究結(jié)果顯示，雷公藤甲素組ERK磷酸化水平較對照組降低，c-fos水平較對照組升高(均P<0.05)，提示雷公藤可能通過引起ERK/c-fos異常表達(dá)導(dǎo)致CHO細(xì)胞凋亡。

黃體酮作為卵巢分泌的孕激素，能夠維持女性正常的生理周期，臨床上常被用于治療月經(jīng)失調(diào)、功能性子宮出血、黃體功能不足、先兆流產(chǎn)和習(xí)慣性流產(chǎn)等[9-11]。研究表明，對于服用雷公藤的育齡期女性患者，早期應(yīng)用雌孕激素類藥物對保護(hù)卵巢功能有一定的療效，其中黃體酮作為最常用的激素藥物，可改善雌激素水平和黃體功能，治療藥源性閉經(jīng)[12]。本研究結(jié)果顯示，雷公藤甲素+黃體酮組干預(yù)后6 h的細(xì)胞凋亡率低于雷公藤甲素組(P<0.05)，且干預(yù)后12 h的細(xì)胞凋亡率低于干預(yù)后6 h(P<0.05)，說明黃體酮對雷公藤甲素所致CHO細(xì)胞損害具有保護(hù)功能。

綜上所述，雷公藤甲素可致CHO細(xì)胞凋亡，可能與其引起ERK/c-fos異常表達(dá)有關(guān)，但延長雷公藤甲素處理細(xì)胞的時間并不增加細(xì)胞凋亡程度。黃體酮對雷公藤甲素所致倉鼠卵巢細(xì)胞損害具有保護(hù)功能。