王 蕓 李 俠 郭殿選

(江蘇省淮安市第二人民醫(yī)院暨徐州醫(yī)科大學(xué)附屬淮安醫(yī)院老年病科，淮安市 223002，電子郵箱：wyun1105@126.com)

目前，糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)已成為糖尿病患者出現(xiàn)終末期腎病的重要原因，也是導(dǎo)致糖尿病患者死亡的主要原因[1]。單核細(xì)胞趨化蛋白-1(monocyte chemotactic protein 1，MCP-1)主要由內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞及單核/巨噬細(xì)胞分泌。在糖尿病發(fā)展過程中，MCP-1可趨化血液循環(huán)中的單核細(xì)胞進(jìn)入腎組織，并在腎小球基底膜下活化成巨噬細(xì)胞；而巨噬細(xì)胞通過結(jié)合相關(guān)受體趨化因子受體2，激活相應(yīng)的信號(hào)通路，誘導(dǎo)不同細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子的分泌，從而促進(jìn)了上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞的增殖，引起細(xì)胞外基質(zhì)堆積和基底膜增厚，進(jìn)而導(dǎo)致腎間質(zhì)纖維化和腎小球硬化的發(fā)生[2-3]，最終引起DN。已有研究表明MCP-1基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)-2518存在A/G多態(tài)性，并且該多態(tài)性與MCP-1的轉(zhuǎn)錄及表達(dá)相關(guān)[4]，這可能與DN的發(fā)病有關(guān)。因此，為了進(jìn)一步探討MCP-1與DN的關(guān)系，本研究對(duì)比DN患者、非DN糖尿病患者、健康體檢者M(jìn)CP-1基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)-2518A/G的多態(tài)性及MCP-1的血清水平。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2017年2～10月期間在我院住院治療的112例2型糖尿病患者為研究對(duì)象。2型糖尿病的診斷參照1999年世界衛(wèi)生組織制定的標(biāo)準(zhǔn)[5]：(1)有糖尿病癥狀，并且隨機(jī)(餐后任何時(shí)間)血糖≥11.1 mmol/L；(2)FBG(禁食至少8 h)≥7.0 mmol/L；(3)OGTT后2 h血糖≥11.1 mmol/L；符合上述標(biāo)準(zhǔn)中的一項(xiàng)或多項(xiàng)者即可診斷為糖尿病。排除原發(fā)性腎病者、其他非糖尿病因素引起的繼發(fā)性腎病者、嚴(yán)重高血壓者、近段時(shí)間發(fā)生過糖尿病急性并發(fā)癥者。根據(jù)24 h尿白蛋白排泄率及血清肌酐，將2型糖尿病患者分為兩組：(1)糖尿病組共52例，其24 h尿白蛋白排泄率≤30 mg/24 h及血清肌酐≤133 μmol/L；(2)DN組共60例，其24 h尿白蛋白排泄率>300 mg/24 h或血清肌酐>133 μmol/L。另外選擇78例健康體檢者作為正常對(duì)照組，均排除感染、心血管疾病、糖尿病及相應(yīng)疾病家族史。3組間年齡、性別、FBG、糖化血紅蛋白(hemoglobin A1c，HbA1c)等比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)，見表1。

表1 3組的一般資料比較

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集：所有受試者均隔夜空腹8 h以上，于次晨空腹經(jīng)肘正中靜脈取血5 ml，用乙二胺四乙酸抗凝，其中2 ml保存在-20℃冷柜，用于提取DNA；另外3 ml血標(biāo)本在室溫(20℃～25℃)下放置60 min，1 000 r/min，離心15 min后，留取上清液置于-80℃保存待測(cè)，用于測(cè)定血清MCP-1水平。

1.2.2 MCP-1基因多態(tài)性的檢測(cè)：(1)按照全血DNA提取試劑盒(北京百奧森泰生物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：Lot B130200)的步驟提取DNA，置于-20℃冷柜保存。(2)利用等位基因特異性擴(kuò)增技術(shù)，根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)[6]的方法合成序列，其中上游引物為5′-CCGAGATGTTCCCAGCACAG-3′，下游引物為5′-CTGCTTTGCTTGTGCCTCTT-3′，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。 按照實(shí)時(shí)熒光PCR試劑盒(上海生工生物工程股份有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：B639297)的說明書進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR的反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5 min；93℃變性50 s，56℃退火40 s，72℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)；最后70℃延伸10 min。(3)取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切電泳鑒定。10 μl擴(kuò)增產(chǎn)物中加入1 μl的限制性內(nèi)切酶PvuⅡ，2 μl的10×FastDigest緩沖液，17 μl去離子水，混勻后放入37℃水浴酶切5 h。酶切產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)束后將凝膠置于紫外燈下進(jìn)行觀察分析。根據(jù)MCP-1基因經(jīng)內(nèi)切酶PvuⅡ酶切片段的情況，基因型分為3種(見圖1)：AA純合子無(wú)酶切點(diǎn)，僅顯示1個(gè)片段(930 bp，條帶3)；GG純合子可完全酶切為兩種片段(708 bp、222 bp，條帶2、4)，AG雜合子可酶切為3種片段(930 bp、708 bp、222 bp，條帶1、5、6)。

圖1 MCP-1基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)-2518產(chǎn)物PvuⅡ酶切電泳示意圖

1.2.3 血清MCP-1水平的測(cè)定：用酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定血標(biāo)本MCP-1水平。試劑盒購(gòu)自上海生工生物工程股份有限公司(生產(chǎn)批號(hào)：C547421-0048)，嚴(yán)格按說明書進(jìn)行測(cè)定。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以(x±s)表示，組間比較采用t檢驗(yàn)或方差分析；計(jì)數(shù)資料以例數(shù)(百分比)表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。采用Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)分析研究樣本的群體代表性。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組MCP-1基因型和等位基因頻率分布情況 MCP-1基因型頻率在正常對(duì)照組中的分布符合遺傳平衡定律(均P>0.05)，見表2。3組間MCP-1基因型和等位基因頻率分布比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，其中，DN組的GG基因型及G等位基因頻率均高于糖尿病組、正常對(duì)照組(均P<0.05)，而糖尿病組與正常對(duì)照組間MCP-1基因型和等位基因頻率分布比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)，見表3。

表2 MCP-1基因型在各組中的Hard-Weinberg平衡檢驗(yàn)[n(%)]

表3 3組MCP-1基因型和等位基因頻率分布比較[n(%)]

2.2 3組不同基因型研究對(duì)象血清MCP-1水平 在不同基因型研究對(duì)象中，正常對(duì)照組、糖尿病組、DN組MCP-1的血清水平均依次升高(均P<0.05)；而在同一組中，3種基因型研究對(duì)象的血清MCP-1水平比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。見表4。

表4 3組不同基因亞型研究對(duì)象血清MCP-1水平(x±s，pg/ml)

注：與正常對(duì)照組比較，*P<0.05；與糖尿病組比較，#P<0.05。

3 討 論

DN作為糖尿病的并發(fā)癥之一，嚴(yán)重影響糖尿病患者的預(yù)后，目前認(rèn)為其基本的病理改變主要為細(xì)胞外基質(zhì)過度積累、基底膜增厚、腎小球系膜基質(zhì)增加、彌漫性和結(jié)節(jié)性腎小球硬化、間質(zhì)纖維化和足突融合[7-8]。MCP-1在單核細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、血管及平滑肌細(xì)胞上均可表達(dá)[9]。在DN的發(fā)展過程中，腎小管上皮細(xì)胞產(chǎn)生的MCP-1可直接引起腎小管周圍大量巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞的募集，造成小管受損，從而加重腎損傷[9]。在DN早期，MCP-1可通過引起腎小球巨噬細(xì)胞的廣泛浸潤(rùn)，誘導(dǎo)腎纖維化的發(fā)生；隨后MCP-1可通過直接與腎小球基底膜細(xì)胞上的趨化因子受體2結(jié)合引起纖維化反應(yīng)，同時(shí)可刺激腎小球基底膜細(xì)胞過度表達(dá)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1，促進(jìn)成纖維細(xì)胞細(xì)胞外基質(zhì)的合成，進(jìn)一步加速DN患者的腎臟纖維化進(jìn)程[10]。另有研究表明，MCP-1 mRNA及蛋白質(zhì)的表達(dá)與腎損害的程度呈正相關(guān)[11]。本研究結(jié)果顯示，無(wú)論為何種基因型，正常對(duì)照組、糖尿病組、DN組研究對(duì)象的血清MCP-1水平均依次升高(均P<0.05)。結(jié)合MCP-1在誘導(dǎo)腎臟纖維化的作用，我們推測(cè)MCP-1廣泛參與了DN的發(fā)生發(fā)展過程。

單核苷酸多態(tài)性是人類DNA序列中最常見的變異形式，此領(lǐng)域的研究是探討基因與疾病關(guān)系的重要途徑。MCP-1基因啟動(dòng)子區(qū)域的-2518位點(diǎn)存在單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)，包含3種基因型：純合子AA、突變型純合子GG以及雜合子AG[9]。本研究結(jié)果顯示，DN組患者M(jìn)CP-1基因-2518位點(diǎn)的GG基因型及G等位基因頻率均高于糖尿病組和正常對(duì)照組(P<0.05)，但糖尿病組、正常對(duì)照組間MCP-1基因型和等位基因頻率分布比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)，提示MCP-1基因-2518位點(diǎn)的多態(tài)性可能與DN的發(fā)生相關(guān)，G等位基因可能會(huì)增加DN的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。Raina等[12]的研究結(jié)果表明MCP-1基因-2518位點(diǎn)GG基因型可能增加DN進(jìn)展到終末期腎病的風(fēng)險(xiǎn)；Mao等[13]研究發(fā)現(xiàn)MCP-1基因-2518位點(diǎn)的G等位基因可能是亞洲人尤其是印度人發(fā)生DN的危險(xiǎn)因素。但國(guó)外也有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，A等位基因可能是2型糖尿病進(jìn)展的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，其與腎功能衰竭存在顯著相關(guān)性[14-15]。因此，關(guān)于MCP-1基因-2518位點(diǎn)多態(tài)性與DN關(guān)系仍存在爭(zhēng)議，究其原因可能與研究對(duì)象來(lái)自不同國(guó)家、種族，其MCP-1基因型的分布頻率在不同人群分布差異較大有關(guān)。

本研究結(jié)果還顯示，各組不同基因亞型人群間的血清MCP-1水平比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。有研究結(jié)果顯示，MCP-1基因的多態(tài)性對(duì)其轉(zhuǎn)錄活性存在影響，其中含G等位基因者M(jìn)CP-1表達(dá)水平更高[16]，但我們并未觀測(cè)到相似結(jié)果，這可能與本研究納入的研究對(duì)象不同有關(guān)。另外，本研究樣本量較小，所得結(jié)論的論證強(qiáng)度較弱，仍需要進(jìn)行多中心、大樣本的病例對(duì)照研究來(lái)證實(shí)結(jié)論的可靠性。

綜上所述，MCP-1可能參與了DN的發(fā)生發(fā)展過程；MCP-1基因的多態(tài)性可能與DN的發(fā)生有關(guān)，其中G等位基因可能是2型糖尿病患者發(fā)生DN的易感基因。但由于DN是多基因遺傳性疾病，其遺傳易感性模式至今尚不清楚，仍需要更深入的研究來(lái)進(jìn)一步分析MCP-1基因多態(tài)性及血清水平在DN進(jìn)展過程中的作用。