王 蕓 李 俠 郭殿選

(江蘇省淮安市第二人民醫(yī)院暨徐州醫(yī)科大學附屬淮安醫(yī)院老年病科，淮安市 223002，電子郵箱：wyun1105@126.com)

目前，糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)已成為糖尿病患者出現(xiàn)終末期腎病的重要原因，也是導致糖尿病患者死亡的主要原因[1]。單核細胞趨化蛋白-1(monocyte chemotactic protein 1，MCP-1)主要由內(nèi)皮細胞、血管平滑肌細胞及單核/巨噬細胞分泌。在糖尿病發(fā)展過程中，MCP-1可趨化血液循環(huán)中的單核細胞進入腎組織，并在腎小球基底膜下活化成巨噬細胞；而巨噬細胞通過結合相關受體趨化因子受體2，激活相應的信號通路，誘導不同細胞因子和生長因子的分泌，從而促進了上皮細胞、內(nèi)皮細胞和血管平滑肌細胞的增殖，引起細胞外基質(zhì)堆積和基底膜增厚，進而導致腎間質(zhì)纖維化和腎小球硬化的發(fā)生[2-3]，最終引起DN。已有研究表明MCP-1基因的轉錄起始位點-2518存在A/G多態(tài)性，并且該多態(tài)性與MCP-1的轉錄及表達相關[4]，這可能與DN的發(fā)病有關。因此，為了進一步探討MCP-1與DN的關系，本研究對比DN患者、非DN糖尿病患者、健康體檢者MCP-1基因轉錄起始位點-2518A/G的多態(tài)性及MCP-1的血清水平。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2017年2～10月期間在我院住院治療的112例2型糖尿病患者為研究對象。2型糖尿病的診斷參照1999年世界衛(wèi)生組織制定的標準[5]：(1)有糖尿病癥狀，并且隨機(餐后任何時間)血糖≥11.1 mmol/L；(2)FBG(禁食至少8 h)≥7.0 mmol/L；(3)OGTT后2 h血糖≥11.1 mmol/L；符合上述標準中的一項或多項者即可診斷為糖尿病。排除原發(fā)性腎病者、其他非糖尿病因素引起的繼發(fā)性腎病者、嚴重高血壓者、近段時間發(fā)生過糖尿病急性并發(fā)癥者。根據(jù)24 h尿白蛋白排泄率及血清肌酐，將2型糖尿病患者分為兩組：(1)糖尿病組共52例，其24 h尿白蛋白排泄率≤30 mg/24 h及血清肌酐≤133 μmol/L；(2)DN組共60例，其24 h尿白蛋白排泄率>300 mg/24 h或血清肌酐>133 μmol/L。另外選擇78例健康體檢者作為正常對照組，均排除感染、心血管疾病、糖尿病及相應疾病家族史。3組間年齡、性別、FBG、糖化血紅蛋白(hemoglobin A1c，HbA1c)等比較，差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)，見表1。

表1 3組的一般資料比較

1.2 方法

1.2.1 標本采集：所有受試者均隔夜空腹8 h以上，于次晨空腹經(jīng)肘正中靜脈取血5 ml，用乙二胺四乙酸抗凝，其中2 ml保存在-20℃冷柜，用于提取DNA；另外3 ml血標本在室溫(20℃～25℃)下放置60 min，1 000 r/min，離心15 min后，留取上清液置于-80℃保存待測，用于測定血清MCP-1水平。

1.2.2 MCP-1基因多態(tài)性的檢測：(1)按照全血DNA提取試劑盒(北京百奧森泰生物技術有限公司，生產(chǎn)批號：Lot B130200)的步驟提取DNA，置于-20℃冷柜保存。(2)利用等位基因特異性擴增技術，根據(jù)相關文獻[6]的方法合成序列，其中上游引物為5′-CCGAGATGTTCCCAGCACAG-3′，下游引物為5′-CTGCTTTGCTTGTGCCTCTT-3′，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。 按照實時熒光PCR試劑盒(上海生工生物工程股份有限公司，生產(chǎn)批號：B639297)的說明書進行PCR反應。PCR的反應條件為：94℃預變性5 min；93℃變性50 s，56℃退火40 s，72℃延伸1 min，共35個循環(huán)；最后70℃延伸10 min。(3)取PCR擴增產(chǎn)物進行酶切電泳鑒定。10 μl擴增產(chǎn)物中加入1 μl的限制性內(nèi)切酶PvuⅡ，2 μl的10×FastDigest緩沖液，17 μl去離子水，混勻后放入37℃水浴酶切5 h。酶切產(chǎn)物進行2%瓊脂糖凝膠電泳，電泳結束后將凝膠置于紫外燈下進行觀察分析。根據(jù)MCP-1基因經(jīng)內(nèi)切酶PvuⅡ酶切片段的情況，基因型分為3種(見圖1)：AA純合子無酶切點，僅顯示1個片段(930 bp，條帶3)；GG純合子可完全酶切為兩種片段(708 bp、222 bp，條帶2、4)，AG雜合子可酶切為3種片段(930 bp、708 bp、222 bp，條帶1、5、6)。

圖1 MCP-1基因轉錄起始位點-2518產(chǎn)物PvuⅡ酶切電泳示意圖

1.2.3 血清MCP-1水平的測定：用酶聯(lián)免疫吸附法測定血標本MCP-1水平。試劑盒購自上海生工生物工程股份有限公司(生產(chǎn)批號：C547421-0048)，嚴格按說明書進行測定。

1.3 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以(x±s)表示，組間比較采用t檢驗或方差分析；計數(shù)資料以例數(shù)(百分比)表示，組間比較采用χ2檢驗。采用Hardy-Weinberg平衡檢驗分析研究樣本的群體代表性。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 各組MCP-1基因型和等位基因頻率分布情況 MCP-1基因型頻率在正常對照組中的分布符合遺傳平衡定律(均P>0.05)，見表2。3組間MCP-1基因型和等位基因頻率分布比較，差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)，其中，DN組的GG基因型及G等位基因頻率均高于糖尿病組、正常對照組(均P<0.05)，而糖尿病組與正常對照組間MCP-1基因型和等位基因頻率分布比較，差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)，見表3。

表2 MCP-1基因型在各組中的Hard-Weinberg平衡檢驗[n(%)]

表3 3組MCP-1基因型和等位基因頻率分布比較[n(%)]

2.2 3組不同基因型研究對象血清MCP-1水平 在不同基因型研究對象中，正常對照組、糖尿病組、DN組MCP-1的血清水平均依次升高(均P<0.05)；而在同一組中，3種基因型研究對象的血清MCP-1水平比較，差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)。見表4。

表4 3組不同基因亞型研究對象血清MCP-1水平(x±s，pg/ml)

注：與正常對照組比較，*P<0.05；與糖尿病組比較，#P<0.05。

3 討 論

DN作為糖尿病的并發(fā)癥之一，嚴重影響糖尿病患者的預后，目前認為其基本的病理改變主要為細胞外基質(zhì)過度積累、基底膜增厚、腎小球系膜基質(zhì)增加、彌漫性和結節(jié)性腎小球硬化、間質(zhì)纖維化和足突融合[7-8]。MCP-1在單核細胞、內(nèi)皮細胞、巨噬細胞、成纖維細胞、血管及平滑肌細胞上均可表達[9]。在DN的發(fā)展過程中，腎小管上皮細胞產(chǎn)生的MCP-1可直接引起腎小管周圍大量巨噬細胞、成纖維細胞的募集，造成小管受損，從而加重腎損傷[9]。在DN早期，MCP-1可通過引起腎小球巨噬細胞的廣泛浸潤，誘導腎纖維化的發(fā)生；隨后MCP-1可通過直接與腎小球基底膜細胞上的趨化因子受體2結合引起纖維化反應，同時可刺激腎小球基底膜細胞過度表達轉化生長因子-β1，促進成纖維細胞細胞外基質(zhì)的合成，進一步加速DN患者的腎臟纖維化進程[10]。另有研究表明，MCP-1 mRNA及蛋白質(zhì)的表達與腎損害的程度呈正相關[11]。本研究結果顯示，無論為何種基因型，正常對照組、糖尿病組、DN組研究對象的血清MCP-1水平均依次升高(均P<0.05)。結合MCP-1在誘導腎臟纖維化的作用，我們推測MCP-1廣泛參與了DN的發(fā)生發(fā)展過程。

單核苷酸多態(tài)性是人類DNA序列中最常見的變異形式，此領域的研究是探討基因與疾病關系的重要途徑。MCP-1基因啟動子區(qū)域的-2518位點存在單核苷酸多態(tài)性位點，包含3種基因型：純合子AA、突變型純合子GG以及雜合子AG[9]。本研究結果顯示，DN組患者MCP-1基因-2518位點的GG基因型及G等位基因頻率均高于糖尿病組和正常對照組(P<0.05)，但糖尿病組、正常對照組間MCP-1基因型和等位基因頻率分布比較，差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)，提示MCP-1基因-2518位點的多態(tài)性可能與DN的發(fā)生相關，G等位基因可能會增加DN的發(fā)病風險。Raina等[12]的研究結果表明MCP-1基因-2518位點GG基因型可能增加DN進展到終末期腎病的風險；Mao等[13]研究發(fā)現(xiàn)MCP-1基因-2518位點的G等位基因可能是亞洲人尤其是印度人發(fā)生DN的危險因素。但國外也有學者發(fā)現(xiàn)，A等位基因可能是2型糖尿病進展的獨立危險因素，其與腎功能衰竭存在顯著相關性[14-15]。因此，關于MCP-1基因-2518位點多態(tài)性與DN關系仍存在爭議，究其原因可能與研究對象來自不同國家、種族，其MCP-1基因型的分布頻率在不同人群分布差異較大有關。

本研究結果還顯示，各組不同基因亞型人群間的血清MCP-1水平比較，差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)。有研究結果顯示，MCP-1基因的多態(tài)性對其轉錄活性存在影響，其中含G等位基因者MCP-1表達水平更高[16]，但我們并未觀測到相似結果，這可能與本研究納入的研究對象不同有關。另外，本研究樣本量較小，所得結論的論證強度較弱，仍需要進行多中心、大樣本的病例對照研究來證實結論的可靠性。

綜上所述，MCP-1可能參與了DN的發(fā)生發(fā)展過程；MCP-1基因的多態(tài)性可能與DN的發(fā)生有關，其中G等位基因可能是2型糖尿病患者發(fā)生DN的易感基因。但由于DN是多基因遺傳性疾病，其遺傳易感性模式至今尚不清楚，仍需要更深入的研究來進一步分析MCP-1基因多態(tài)性及血清水平在DN進展過程中的作用。