王 蕓 李 俠 郭殿選
(江蘇省淮安市第二人民醫(yī)院暨徐州醫(yī)科大學(xué)附屬淮安醫(yī)院老年病科,淮安市 223002,電子郵箱:wyun1105@126.com)
目前,糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)已成為糖尿病患者出現(xiàn)終末期腎病的重要原因,也是導(dǎo)致糖尿病患者死亡的主要原因[1]。單核細(xì)胞趨化蛋白-1(monocyte chemotactic protein 1,MCP-1)主要由內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞及單核/巨噬細(xì)胞分泌。在糖尿病發(fā)展過程中,MCP-1可趨化血液循環(huán)中的單核細(xì)胞進(jìn)入腎組織,并在腎小球基底膜下活化成巨噬細(xì)胞;而巨噬細(xì)胞通過結(jié)合相關(guān)受體趨化因子受體2,激活相應(yīng)的信號通路,誘導(dǎo)不同細(xì)胞因子和生長因子的分泌,從而促進(jìn)了上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞的增殖,引起細(xì)胞外基質(zhì)堆積和基底膜增厚,進(jìn)而導(dǎo)致腎間質(zhì)纖維化和腎小球硬化的發(fā)生[2-3],最終引起DN。已有研究表明MCP-1基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)-2518存在A/G多態(tài)性,并且該多態(tài)性與MCP-1的轉(zhuǎn)錄及表達(dá)相關(guān)[4],這可能與DN的發(fā)病有關(guān)。因此,為了進(jìn)一步探討MCP-1與DN的關(guān)系,本研究對比DN患者、非DN糖尿病患者、健康體檢者M(jìn)CP-1基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)-2518A/G的多態(tài)性及MCP-1的血清水平。
1.1 臨床資料 選擇2017年2~10月期間在我院住院治療的112例2型糖尿病患者為研究對象。2型糖尿病的診斷參照1999年世界衛(wèi)生組織制定的標(biāo)準(zhǔn)[5]:(1)有糖尿病癥狀,并且隨機(jī)(餐后任何時(shí)間)血糖≥11.1 mmol/L;(2)FBG(禁食至少8 h)≥7.0 mmol/L;(3)OGTT后2 h血糖≥11.1 mmol/L;符合上述標(biāo)準(zhǔn)中的一項(xiàng)或多項(xiàng)者即可診斷為糖尿病。排除原發(fā)性腎病者、其他非糖尿病因素引起的繼發(fā)性腎病者、嚴(yán)重高血壓者、近段時(shí)間發(fā)生過糖尿病急性并發(fā)癥者。根據(jù)24 h尿白蛋白排泄率及血清肌酐,將2型糖尿病患者分為兩組:(1)糖尿病組共52例,其24 h尿白蛋白排泄率≤30 mg/24 h及血清肌酐≤133 μmol/L;(2)DN組共60例,其24 h尿白蛋白排泄率>300 mg/24 h或血清肌酐>133 μmol/L。另外選擇78例健康體檢者作為正常對照組,均排除感染、心血管疾病、糖尿病及相應(yīng)疾病家族史。3組間年齡、性別、FBG、糖化血紅蛋白(hemoglobin A1c,HbA1c)等比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05),見表1。
表1 3組的一般資料比較
1.2 方法
1.2.1 標(biāo)本采集:所有受試者均隔夜空腹8 h以上,于次晨空腹經(jīng)肘正中靜脈取血5 ml,用乙二胺四乙酸抗凝,其中2 ml保存在-20℃冷柜,用于提取DNA;另外3 ml血標(biāo)本在室溫(20℃~25℃)下放置60 min,1 000 r/min,離心15 min后,留取上清液置于-80℃保存待測,用于測定血清MCP-1水平。
1.2.2 MCP-1基因多態(tài)性的檢測:(1)按照全血DNA提取試劑盒(北京百奧森泰生物技術(shù)有限公司,生產(chǎn)批號:Lot B130200)的步驟提取DNA,置于-20℃冷柜保存。(2)利用等位基因特異性擴(kuò)增技術(shù),根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)[6]的方法合成序列,其中上游引物為5′-CCGAGATGTTCCCAGCACAG-3′,下游引物為5′-CTGCTTTGCTTGTGCCTCTT-3′,引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。 按照實(shí)時(shí)熒光PCR試劑盒(上海生工生物工程股份有限公司,生產(chǎn)批號:B639297)的說明書進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR的反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性5 min;93℃變性50 s,56℃退火40 s,72℃延伸1 min,共35個(gè)循環(huán);最后70℃延伸10 min。(3)取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切電泳鑒定。10 μl擴(kuò)增產(chǎn)物中加入1 μl的限制性內(nèi)切酶PvuⅡ,2 μl的10×FastDigest緩沖液,17 μl去離子水,混勻后放入37℃水浴酶切5 h。酶切產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳,電泳結(jié)束后將凝膠置于紫外燈下進(jìn)行觀察分析。根據(jù)MCP-1基因經(jīng)內(nèi)切酶PvuⅡ酶切片段的情況,基因型分為3種(見圖1):AA純合子無酶切點(diǎn),僅顯示1個(gè)片段(930 bp,條帶3);GG純合子可完全酶切為兩種片段(708 bp、222 bp,條帶2、4),AG雜合子可酶切為3種片段(930 bp、708 bp、222 bp,條帶1、5、6)。
圖1 MCP-1基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)-2518產(chǎn)物PvuⅡ酶切電泳示意圖
1.2.3 血清MCP-1水平的測定:用酶聯(lián)免疫吸附法測定血標(biāo)本MCP-1水平。試劑盒購自上海生工生物工程股份有限公司(生產(chǎn)批號:C547421-0048),嚴(yán)格按說明書進(jìn)行測定。
1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以(x±s)表示,組間比較采用t檢驗(yàn)或方差分析;計(jì)數(shù)資料以例數(shù)(百分比)表示,組間比較采用χ2檢驗(yàn)。采用Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)分析研究樣本的群體代表性。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2.1 各組MCP-1基因型和等位基因頻率分布情況 MCP-1基因型頻率在正常對照組中的分布符合遺傳平衡定律(均P>0.05),見表2。3組間MCP-1基因型和等位基因頻率分布比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05),其中,DN組的GG基因型及G等位基因頻率均高于糖尿病組、正常對照組(均P<0.05),而糖尿病組與正常對照組間MCP-1基因型和等位基因頻率分布比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05),見表3。
表2 MCP-1基因型在各組中的Hard-Weinberg平衡檢驗(yàn)[n(%)]
表3 3組MCP-1基因型和等位基因頻率分布比較[n(%)]
2.2 3組不同基因型研究對象血清MCP-1水平 在不同基因型研究對象中,正常對照組、糖尿病組、DN組MCP-1的血清水平均依次升高(均P<0.05);而在同一組中,3種基因型研究對象的血清MCP-1水平比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。見表4。
表4 3組不同基因亞型研究對象血清MCP-1水平(x±s,pg/ml)
注:與正常對照組比較,*P<0.05;與糖尿病組比較,#P<0.05。
DN作為糖尿病的并發(fā)癥之一,嚴(yán)重影響糖尿病患者的預(yù)后,目前認(rèn)為其基本的病理改變主要為細(xì)胞外基質(zhì)過度積累、基底膜增厚、腎小球系膜基質(zhì)增加、彌漫性和結(jié)節(jié)性腎小球硬化、間質(zhì)纖維化和足突融合[7-8]。MCP-1在單核細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、血管及平滑肌細(xì)胞上均可表達(dá)[9]。在DN的發(fā)展過程中,腎小管上皮細(xì)胞產(chǎn)生的MCP-1可直接引起腎小管周圍大量巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞的募集,造成小管受損,從而加重腎損傷[9]。在DN早期,MCP-1可通過引起腎小球巨噬細(xì)胞的廣泛浸潤,誘導(dǎo)腎纖維化的發(fā)生;隨后MCP-1可通過直接與腎小球基底膜細(xì)胞上的趨化因子受體2結(jié)合引起纖維化反應(yīng),同時(shí)可刺激腎小球基底膜細(xì)胞過度表達(dá)轉(zhuǎn)化生長因子-β1,促進(jìn)成纖維細(xì)胞細(xì)胞外基質(zhì)的合成,進(jìn)一步加速DN患者的腎臟纖維化進(jìn)程[10]。另有研究表明,MCP-1 mRNA及蛋白質(zhì)的表達(dá)與腎損害的程度呈正相關(guān)[11]。本研究結(jié)果顯示,無論為何種基因型,正常對照組、糖尿病組、DN組研究對象的血清MCP-1水平均依次升高(均P<0.05)。結(jié)合MCP-1在誘導(dǎo)腎臟纖維化的作用,我們推測MCP-1廣泛參與了DN的發(fā)生發(fā)展過程。
單核苷酸多態(tài)性是人類DNA序列中最常見的變異形式,此領(lǐng)域的研究是探討基因與疾病關(guān)系的重要途徑。MCP-1基因啟動(dòng)子區(qū)域的-2518位點(diǎn)存在單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn),包含3種基因型:純合子AA、突變型純合子GG以及雜合子AG[9]。本研究結(jié)果顯示,DN組患者M(jìn)CP-1基因-2518位點(diǎn)的GG基因型及G等位基因頻率均高于糖尿病組和正常對照組(P<0.05),但糖尿病組、正常對照組間MCP-1基因型和等位基因頻率分布比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05),提示MCP-1基因-2518位點(diǎn)的多態(tài)性可能與DN的發(fā)生相關(guān),G等位基因可能會增加DN的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。Raina等[12]的研究結(jié)果表明MCP-1基因-2518位點(diǎn)GG基因型可能增加DN進(jìn)展到終末期腎病的風(fēng)險(xiǎn);Mao等[13]研究發(fā)現(xiàn)MCP-1基因-2518位點(diǎn)的G等位基因可能是亞洲人尤其是印度人發(fā)生DN的危險(xiǎn)因素。但國外也有學(xué)者發(fā)現(xiàn),A等位基因可能是2型糖尿病進(jìn)展的獨(dú)立危險(xiǎn)因素,其與腎功能衰竭存在顯著相關(guān)性[14-15]。因此,關(guān)于MCP-1基因-2518位點(diǎn)多態(tài)性與DN關(guān)系仍存在爭議,究其原因可能與研究對象來自不同國家、種族,其MCP-1基因型的分布頻率在不同人群分布差異較大有關(guān)。
本研究結(jié)果還顯示,各組不同基因亞型人群間的血清MCP-1水平比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。有研究結(jié)果顯示,MCP-1基因的多態(tài)性對其轉(zhuǎn)錄活性存在影響,其中含G等位基因者M(jìn)CP-1表達(dá)水平更高[16],但我們并未觀測到相似結(jié)果,這可能與本研究納入的研究對象不同有關(guān)。另外,本研究樣本量較小,所得結(jié)論的論證強(qiáng)度較弱,仍需要進(jìn)行多中心、大樣本的病例對照研究來證實(shí)結(jié)論的可靠性。
綜上所述,MCP-1可能參與了DN的發(fā)生發(fā)展過程;MCP-1基因的多態(tài)性可能與DN的發(fā)生有關(guān),其中G等位基因可能是2型糖尿病患者發(fā)生DN的易感基因。但由于DN是多基因遺傳性疾病,其遺傳易感性模式至今尚不清楚,仍需要更深入的研究來進(jìn)一步分析MCP-1基因多態(tài)性及血清水平在DN進(jìn)展過程中的作用。