梁慶華 何本進(jìn) 韋 勇 利榮喬 秦嬌琴

(廣西壯族自治區(qū)江濱醫(yī)院1 檢驗(yàn)科，2 神經(jīng)內(nèi)科，南寧市 530021，電子郵箱：215656503@qq.com)

近年來，隨著人口老齡化的加劇，阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)患病率呈現(xiàn)逐年攀升的趨勢。該病的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前尚未完全明確。研究表明，維生素B6、維生素B12和葉酸缺乏可導(dǎo)致高同型半胱氨酸血癥(hyperhomocysteinemia，HHcy)，而在不同的AD模型小鼠中HHcy可增加β淀粉樣蛋白(amyloidβ-protein,Aβ)的沉積，從而損害其認(rèn)知功能；在AD患者中HHcy通過Aβ與纖維蛋白原之間的相互作用，使病情惡化，因此同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)被認(rèn)為是AD的一個(gè)獨(dú)立危險(xiǎn)因素[1-3]。在體內(nèi)代謝過程中Hcy可產(chǎn)生活性氧，增加氧化應(yīng)激水平。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)是機(jī)體內(nèi)對抗氧化應(yīng)激的抗氧化酶，Hcy和SOD水平可間接反映機(jī)體對抗氧化應(yīng)激，清除自由基的能力。本研究分析AD患者血清Hcy和SOD的表達(dá)水平，探討這兩項(xiàng)指標(biāo)與AD的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2016年1月至2018年3月在我院神經(jīng)內(nèi)科確診為AD的患者100例作為AD組。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)均符合美國國立神經(jīng)病語言障礙卒中研究所-AD及相關(guān)疾病協(xié)會制定的診斷標(biāo)準(zhǔn)[4]：① 經(jīng)臨床神經(jīng)心理檢查及認(rèn)知量表測試確定為癡呆；② 有兩項(xiàng)或兩項(xiàng)以上的認(rèn)知功能缺損；③ 40～90歲之間發(fā)病。(2)無意識障礙；(3)記憶和其他認(rèn)知功能進(jìn)行性衰退；(4)不存在可導(dǎo)致記憶和認(rèn)知功能進(jìn)行性缺損的軀體疾病或其他腦部疾患。其中男49例，女51例，年齡62～90(75.5±7.2)歲。另選取同期健康體檢者100例作為對照組，其中男55例，女45例，年齡60～88(73.8±7.0)歲。兩組均排除記憶障礙、認(rèn)知障礙以及精神病家族史者。兩組性別、年齡比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)，具有可比性。

1.2 研究方法

1.2.1 儀器與試劑：貝克曼庫爾特公司AU5800型全自動生化分析儀；Hcy檢測試劑盒(酶循環(huán)法)為北京九強(qiáng)生物技術(shù)股份有限公司生產(chǎn)(批號：18-0927)，SOD檢測試劑盒(比色法)為福建福緣生物科技有限公司生產(chǎn)(批號：SOD-180611-04)；DNA濃度和純度檢測采用NanoDrop2000型超微量紫外-可見光分光光度計(jì)[賽默飛世爾科技(中國)有限公司，型號：NanoDrop2000c]。C1000型PCR擴(kuò)增儀為美國Bio-Rad公司生產(chǎn)。Gel Doc 2000凝膠圖像分析系統(tǒng)為美國Bio-Rad公司生產(chǎn)。DNA提取試劑盒(鹽析法)購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司(批號：CW2087M)。HhaⅠ限制性內(nèi)切酶購自寶生物工程(大連)有限公司(批號：CK16010)。

1.2.2 標(biāo)本采集：抽取研究對象清晨空腹肘靜脈血8 ml。5 ml置于無抗凝劑的紅頭管，靜置15～20 min后離心10 min(3 500 r/min)，取上清液檢測Hcy和SOD水平；其余3 ml置于乙二胺四乙酸-K2抗凝管，用于提取DNA，檢測載脂蛋白E(apolipoprotein E，ApoE)基因多態(tài)性。

1.2.3 相關(guān)指標(biāo)檢測方法：(1)采用全自動生化分析儀檢測Hcy和SOD水平。(2)ApoE ε4等位基因檢測采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)法。① 引物設(shè)計(jì)及合成：從NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)或UCSC(https://genome.ucsc.edu/index.html)基因組數(shù)據(jù)庫中獲取ApoE基因DNA序列，使用Primer Primier 6.0軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，其中上游引物：5′-TCCAAGGAGCTGCAGGCGGCGCA-3′，下游引物：5′-ACAGAATTCGCCCCGGCCTGGTACACTGCCA-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物長度為227 bp，引物由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成。② PCR擴(kuò)增：反應(yīng)總體積為20 μl，包括10 μl預(yù)混液(2×)、0.5 μl引物、2.5 μl基因組DNA模板、1 μl二甲基亞砜、6 μl雙蒸水。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性45 s，64℃退火30 s，72℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)，72℃延伸5 min。③ 擴(kuò)增產(chǎn)物限制性內(nèi)切酶：酶切體系為20 μl，其中15 μl PCR擴(kuò)增產(chǎn)物、2 μl緩沖液(2×)、0.3 μl HhaⅠ、以雙蒸水補(bǔ)足至20 μl，37℃消化3 h。68℃ 20 min終止反應(yīng)，酶切產(chǎn)物放置4℃冰箱，用于SDS-PAGE，分析ApoE基因多態(tài)性。同時(shí)隨機(jī)抽取兩組研究對象各50%的標(biāo)本送北京天一輝遠(yuǎn)生物科技股份有限公司進(jìn)行測序驗(yàn)證分析結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以(x±s)表示，比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例數(shù)或百分比表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；兩變量相關(guān)性使用Pearson相關(guān)性分析；采用受試者工作特征(receiver operating characteristic，ROC)曲線分析Hcy、SOD診斷AD的價(jià)值。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組血清Hcy與SOD水平比較 AD組血清Hcy水平高于對照組，SOD水平低于對照組(均P<0.05)，見表1。

表1 兩組血清Hcy與SOD水平比較(x±s)

2.2 各組ApoE ε4攜帶者與非ApoE ε4攜帶者血清Hcy及SOD水平比較 ApoE基因多態(tài)性分析結(jié)果顯示，AD組有7例攜帶ApoE ε4基因，對照組有3例攜帶ApoE ε4基因。AD組中，ApoE ε4攜帶者與非ApoE ε4攜帶者血清Hcy水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，ApoE ε4攜帶者血清SOD水平低于非ApoE ε4攜帶者(P<0.05)；對照組中，ApoE ε4攜帶者與非ApoE ε4攜帶者Hcy、SOD水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。AD組ApoE ε4攜帶者血清SOD水平低于對照組ApoE ε4攜帶者(P<0.05)，但兩者血清Hcy水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與對照組非ApoE ε4攜帶者比較，AD組非ApoE ε4攜帶者血清Hcy水平升高，而血清SOD水平降低(均P<0.05)。見表2。

表2 兩組ApoE ε4攜帶者與非ApoE ε4攜帶者血清Hcy及SOD水平比較(x±s)

2.3 AD組患者血清Hcy與SOD水平相關(guān)性分析 AD組患者血清Hcy與SOD水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.267，P=0.007)。

2.4 血清Hcy、SOD水平及聯(lián)合檢測診斷AD的價(jià)值 血清Hcy、SOD水平及其聯(lián)合檢測對AD均有一定的診斷價(jià)值，3者的曲線下面積比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=26.109，P<0.001)，其中SOD與聯(lián)合檢測的曲線下面積均大于Hcy(Z=8.269，P<0.001；Z=8.248，P<0.001)，單獨(dú)SOD診斷AD的價(jià)值與聯(lián)合檢測的診斷效能相當(dāng)(Z=0.515，P=0.606)，見表3及圖1。

圖1 Hcy、SOD及聯(lián)合指標(biāo)聯(lián)合檢測的ROC曲線

表3 Hcy、SOD及聯(lián)合檢測診斷AD的效能

檢測指標(biāo)曲線下面積P值靈敏度(%)特異度(%)Hcy0.6090.0073291SOD0.949<0.0019290聯(lián)合檢測0.949<0.0019290

3 討 論

氧化應(yīng)激可通過鈣蛋白酶活化細(xì)胞周期素依賴性蛋白激酶5以激活A(yù)β前體蛋白裂解酶，從而增加Aβ沉積；或通過激活蛋白磷酸酶2A與糖原合成酶激酶3β，引起過度磷酸化的Tau蛋白發(fā)生沉積。而神經(jīng)纖維纏結(jié)是AD的組織病理學(xué)特征之一，其主要由Aβ和過度磷酸化的Tau蛋白組成，因此氧化應(yīng)激被認(rèn)為是AD重要的發(fā)病機(jī)制之一[5]。研究發(fā)現(xiàn)，Hcy水平增高可引起Aβ沉積，損壞海馬神經(jīng)元的DNA修復(fù)，使之對Aβ毒性敏感，導(dǎo)致神經(jīng)元死亡，進(jìn)而使認(rèn)知能力進(jìn)一步下降；或引起過度磷酸化Tau蛋白大量沉積，使突觸失活，從而導(dǎo)致神經(jīng)退行性病變[6-8]。Hcy通過誘導(dǎo)氧化應(yīng)激調(diào)節(jié)Aβ與Tau蛋白通路，從而在AD發(fā)展中扮演重要角色[9]。Hooshmand等[10]研究發(fā)現(xiàn)HHcy可增加老年人患AD的風(fēng)險(xiǎn)。多個(gè)臨床研究發(fā)現(xiàn)Hcy水平升高是AD的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[11-14]。本研究結(jié)果顯示AD組血清Hcy水平高于對照組(P<0.05)，與上述研究結(jié)果相似。

SOD是一種反映人體內(nèi)自由基代謝狀態(tài)的重要抗氧化酶，在機(jī)體的氧化與抗氧化平衡中發(fā)揮很大作用，因此其水平高低可間接反映機(jī)體對抗氧化應(yīng)激，以及清除自由基的能力。除了抗氧化活性外，SOD還有抗炎、抗癌和抗衰老等生物學(xué)特性，有學(xué)者認(rèn)為其還可作為AD等疾病的診斷指標(biāo)[15]。Vinothkumar等[16]研究發(fā)現(xiàn)，AD患者血漿SOD水平明顯下降，而Aβ和脂質(zhì)過氧化水平均升高。嚴(yán)旭東等[17]研究發(fā)現(xiàn)AD患者血清SOD水平低于健康體檢者，且其水平與AD的病程及嚴(yán)重程度密切相關(guān)。此外，還有研究提示，使用SOD或具抗氧化活性的替代藥物來對抗由Aβ、過度磷酸化Tau蛋白或HHcy等產(chǎn)生的氧化應(yīng)激，不僅能顯著降低Hcy及提高SOD水平，還可明顯改善AD模型動物的學(xué)習(xí)記憶能力或AD患者的認(rèn)知功能與日常生活能力[9，18-21]。本研究結(jié)果顯示AD組SOD水平低于對照組，與上述研究結(jié)果相似。而ROC曲線分析結(jié)果顯示，Hcy、SOD水平及其聯(lián)合檢測對AD均有一定的診斷價(jià)值，SOD單獨(dú)診斷AD的價(jià)值與聯(lián)合診斷效能相當(dāng)(P>0.05)，筆者認(rèn)為SOD可用于AD患者的輔助診斷。

ApoE基因具有多態(tài)性，其3個(gè)等位基因ε2、ε3、ε4可分別編碼E2、E3、E4 3種異構(gòu)體，產(chǎn)生E2/E2、E2/E3、E2/E4、E3/E3、E3/E4、E4/E4 6種遺傳表型。AOPE基因型在正常人群中ε3/ε3最多見，ε2/ε2或ε4/ε4最少。目前認(rèn)為ApoE ε4等位基因是散發(fā)性AD發(fā)展最重要的遺傳危險(xiǎn)因素。臨床研究表明[22-25]，AD患者ApoE ε4頻率高于健康老人，攜帶ApoE ε4的輕度認(rèn)知障礙患者發(fā)展為AD的風(fēng)險(xiǎn)更高；ApoE ε4攜帶者比非攜帶者更容易患AD，且與ε4雜合子相比，攜帶ε4純合子的人群更容易發(fā)生AD，且發(fā)病時(shí)間更早。還有學(xué)者發(fā)現(xiàn)攜帶ApoE ε4的AD患者海馬區(qū)的氧化應(yīng)激水平高于非攜帶者[26]，提示Apo Eε4可能通過誘導(dǎo)機(jī)體的氧化應(yīng)激，引起Aβ大量聚集，使神經(jīng)元產(chǎn)生毒性而死亡，從而增加AD的患病風(fēng)險(xiǎn)，但其具體作用機(jī)制仍未完全清楚。本研究結(jié)果顯示，攜帶ApoE ε4與非ApoE ε4攜帶的AD患者間，以及攜帶ApoE ε4的AD患者與健康者間血清Hcy水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，這與Zverova等[11]的研究結(jié)果相似，提示AD患者血清Hcy水平可能與ApoE ε4基因型無關(guān)。而AD組中ApoE ε4攜帶者血清SOD水平低于非ApoE ε4攜帶者，AD組ApoE ε4攜帶者血清SOD水平低于對照組ApoE ε4攜帶者(P<0.05)，提示攜帶ApoE ε4的AD患者機(jī)體對抗氧化應(yīng)激、清除自由基的能力明顯下降。同時(shí)，本研究結(jié)果還顯示，AD組患者血清Hcy與SOD水平呈負(fù)相關(guān)，提示AD患者Hcy水平升高可能誘導(dǎo)了機(jī)體的氧化應(yīng)激，而機(jī)體在對抗氧化應(yīng)激時(shí)，消耗了大量的抗氧化酶，致使SOD水平降低。

綜上所述，AD患者血清Hcy水平升高，SOD水平降低，血清Hcy水平可能與AD遺傳危險(xiǎn)因素ApoE ε4無關(guān)，而SOD水平可能與ApoE ε4有關(guān)。血清SOD水平診斷AD的效能較高，可用于AD的輔助診斷。