鐘日勝 秦東泉 冉雪蓮 梁樹聰 辜春霖

(廣西南寧市第二人民醫(yī)院麻醉科，南寧市 530031，電子郵箱：2686510875@qq.com)

蛛網(wǎng)膜下腔出血(subarachnoid haemorrhage，SAH)是一種破壞性的腦血管疾病，有較高的死亡率和致殘率。SAH僅占腦卒中的5%，但其病死率占腦血管病死亡的25%[1-2]。SAH后72 h內(nèi)可發(fā)生早期腦損傷，氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡是早期腦損傷的可能機(jī)制[3-5]。小膠質(zhì)細(xì)胞由中樞神經(jīng)系統(tǒng)激活，可吞噬有害物質(zhì)，但過度活化的小膠質(zhì)細(xì)胞可釋放促炎細(xì)胞因子、趨化因子、氧化代謝物等加劇腦損傷[6-7]。此外，炎性細(xì)胞因子、趨化因子的釋放可進(jìn)一步誘導(dǎo)循環(huán)免疫細(xì)胞的后續(xù)活化和浸潤(rùn)，故消除炎癥的藥物可能是SAH患者麻醉的新策略[8]。NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3(NOD-like receptor pyrin domain containing protein 3,NLRP3)炎性體參與SAH后的炎癥反應(yīng)，SAH后24 h NLRP3炎性體的表達(dá)顯著增加[9-10]。當(dāng)NLRP3炎性體被激活時(shí)，促半胱氨酸蛋白酶-1轉(zhuǎn)化為半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1(Caspase-1)，可促進(jìn)白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-1β和IL-18的釋放[11]。右美托咪定是一種高選擇性的α2受體，有鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜作用，可在創(chuàng)傷性腦損傷和腦缺血后發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[12]。本文探討右美托咪定通過下調(diào)NLRP3炎性小體的表達(dá)減輕SAH患者腦損傷的機(jī)制，為SAH患者麻醉劑的選擇提供理論和臨床基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2017年6月至2018年6月我院收治的80例SAH患者為研究對(duì)象，其中男39例，女41例，年齡(58.63±5.79)歲。入選標(biāo)準(zhǔn)：診斷符合我國(guó)腦血管病學(xué)術(shù)會(huì)議制定的蛛網(wǎng)膜下腔出血診斷標(biāo)準(zhǔn)[13]，并經(jīng)頭顱CT、CT血管成像、MRI血管成像、腦血管造影等檢查確診；研究對(duì)象及家屬均知情同意并簽署知情同意書；研究方案經(jīng)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：患有心血管疾病史、心肌炎、急性心衰和胸部外傷者；肝臟、腎臟、肺臟等有嚴(yán)重炎癥和功能損傷者；糖尿病患者；血清肌酐濃度≥176.8 μmol/L；患有血液性或傳染性疾病者；無法耐受手術(shù)者。按隨機(jī)數(shù)字法將患者分為觀察組及對(duì)照組，每組40例。兩組患者性別、年齡、體重、發(fā)病至手術(shù)時(shí)間比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)，具有可比性，見表1。

表1 兩組患者一般資料比較

1.2 方法 兩組患者均在全麻下行顱內(nèi)血腫清除術(shù)。采用靜-吸復(fù)合麻醉，麻醉誘導(dǎo)用靜脈注射維庫溴銨(荷蘭Organon公司，批號(hào)：1332285)0.1 mg/kg、芬太尼(湖北宜昌人福藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：315023)2 μg/kg、丙泊酚(北京費(fèi)森尤斯卡比醫(yī)藥有限公司，批號(hào)：16LG8017)1 mg/kg；麻醉維持用異氟醚(1.5%～2%，美國(guó)雅培制藥有限公司，批號(hào)：07010，規(guī)格：100 ml)低流量持續(xù)吸入，用維庫溴銨2 mg/次間斷推注。切皮前給予5 μg舒芬太尼(湖北宜昌人福藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號(hào)：1150309)靜脈推注。觀察組麻醉維持期間微量泵入右美托咪定(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，批號(hào)：170211BC)，負(fù)荷量為1 μg/(kg·10 min)。

1.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)腦脊液中小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量 分別于麻醉前和麻醉后30 min取腦脊液2 ml送檢。用40 μm尼龍細(xì)胞過濾器濾過腦脊液，用磷酸緩沖鹽溶液(phosphate-buffered saline，PBS)洗滌細(xì)胞，并在4℃下以2 000 r/min離心5 min,隨后將細(xì)胞重懸于5 ml 30%細(xì)胞分離液中離心10 min，加入異硫氰酸熒光素標(biāo)記GSA同工酶B4混勻，室溫避光放置20 min。加入PBS 2 ml，3 000 r/min離心5 min，棄上清，加入300 μl PBS重懸細(xì)胞。采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)腦脊液小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量，以CellQuest軟件獲取細(xì)胞，分析細(xì)胞表面的平均熒光強(qiáng)度。

1.4 免疫印跡試驗(yàn)檢測(cè)腦脊液NLRP3和Caspase-1水平 分別麻醉前后取腦脊液1 ml，采用全蛋白提取試劑盒(南京碧云天公司，批號(hào)：90090605)提取腦脊液樣品中的全蛋白，進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析。取等量蛋白質(zhì)樣品置于10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳中，在80 V下分離蛋白質(zhì)30 min，然后將電壓升至120 V，持續(xù)60 min。電泳結(jié)束后，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到0.45 μm厚的硝酸纖維素膜上，然后在室溫下用脫脂乳封閉2 h。隨后，將膜分別置于鼠抗人NLRP3單克隆抗體(1 ∶1 000，南京碧云天公司，批號(hào)：15050403)、小鼠抗人Caspase-1單克隆抗體(1 ∶1 000，南京碧云天公司，批號(hào)：17088235)在4℃溫育過夜，檢測(cè)腦脊液NLRP3、Caspase-1表達(dá)水平。

1.5 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)血清IL-1β、IL-18水平 分別于麻醉前后空腹抽取靜脈血5 ml，肝素抗凝，3 000 r/min離心5 min，取血清4℃冰箱冷藏保存待檢。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)血清IL-1β、IL-18水平。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑盒購(gòu)自南京碧云天公司(IL-1β批號(hào)：16092549，IL-18批號(hào)：17090206)，嚴(yán)格按照產(chǎn)品說明書操作。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以(x±s)表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用百分率(%)表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組患者腦脊液小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)比較 麻醉前，兩組患者腦脊液小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，麻醉后，兩組腦脊液內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞少于麻醉前，且觀察組少于對(duì)照組(P<0.05)，見表2。

表2 麻醉前后兩組患者腦脊液小膠質(zhì)細(xì)胞計(jì)數(shù)比較(x±s，×105)

2.2 兩組血清IL-1β和IL-18水平比較 麻醉前，兩組血清IL-1β、IL-18水平比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)，麻醉后，兩組IL-1β、IL-18水平均低于麻醉前，且觀察組低于對(duì)照組(均P<0.05)，見表3。

表3 麻醉前后兩組血清IL-1β、IL-18水平比較(x±s，ng/ml)

2.3 兩組麻醉前后腦脊液NLRP3炎性體、Caspase-1表達(dá)水平比較 麻醉前，兩組患者腦脊液NLRP3炎性體、Caspase-1表達(dá)量比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)，麻醉后，兩組腦脊液NLRP3炎性體、Caspase-1表達(dá)量均低于麻醉前，并且觀察組低于對(duì)照組(均P<0.05)，見表4。

表4 麻醉前后兩組患者腦脊液NLRP3、Caspase-1相對(duì)表達(dá)量比較(x±s)

3 討 論

SAH是指腦底部或腦表面的病變血管破裂，導(dǎo)致血液直接流入蛛網(wǎng)膜下腔引起而引發(fā)的一系列臨床綜合征。SHA早期腦損傷的發(fā)生機(jī)制可能為：神經(jīng)元發(fā)生免疫炎癥反應(yīng)；腦細(xì)胞凋亡；血腦屏障損傷以及腦水腫；發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)等；一氧化氮合酶減少[14]。減輕SAH后早期腦損傷，促進(jìn)神經(jīng)修復(fù)對(duì)提高患者生存率與生存質(zhì)量具有重要意義。

右旋美托咪啶是一種高選擇性α2受體激動(dòng)劑，可在多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病中發(fā)揮多重保護(hù)作用，抗炎作用與其抗交感神經(jīng)活動(dòng)有關(guān)[15]。研究發(fā)現(xiàn)，右旋美托咪啶可以通過降低大鼠的體溫而減輕繼發(fā)性腦損傷，并可改善大鼠的神經(jīng)學(xué)評(píng)分[16]。右旋美托咪啶能夠抑制麻醉劑異氟醚對(duì)新生乳鼠的腦損傷[17-18]。本研究結(jié)果顯示，麻醉后，觀察組患者血清IL-1β、IL-18水平均低于麻醉前及對(duì)照組(均P<0.05)，提示右旋美托咪啶可抑制炎癥反應(yīng)的擴(kuò)增，從而阻止血腦屏障的破壞、細(xì)胞凋亡以及腦水腫的惡化[19-20]。本文結(jié)果還顯示，麻醉后，觀察組腦脊液內(nèi)NLRP3炎性體、Caspase-1表達(dá)量均低于麻醉前及對(duì)照組(均P<0.05)，說明右美托咪定可通過阻斷NLRP3炎性體的激活從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。NLRP3炎性體影響機(jī)體的免疫防御系統(tǒng)，參與各種疾病的發(fā)生發(fā)展，如急性肺損傷、痛風(fēng)、糖尿病和動(dòng)脈粥樣硬化。NLRP3炎性體的激活主要有以下兩個(gè)步驟[21]：(1)響應(yīng)危險(xiǎn)信號(hào)啟動(dòng)NLRP3炎性體，危險(xiǎn)信號(hào)包括與微生物感染相關(guān)的病原體相關(guān)分子模式和與無菌炎癥反應(yīng)相關(guān)的損傷相關(guān)分子模式。(2)NLRP3炎性體的寡聚化和凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白的募集。有研究發(fā)現(xiàn)，Caspase-1的抑制降低了由脂多糖處理的RAW 264.7巨噬細(xì)胞激活的BV2小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中的IL-1β產(chǎn)生[22]。小膠質(zhì)細(xì)胞是大腦的常駐免疫細(xì)胞，也是NLRP3炎性體的主要受體，當(dāng)外界環(huán)境發(fā)生改變時(shí)，可被血液成分激活而發(fā)生遷移和吞噬作用，并可產(chǎn)生各種細(xì)胞因子和趨化因子，為受傷區(qū)域募集額外的外周免疫細(xì)胞。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，麻醉后觀察組患者腦脊液小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量少于麻醉前及對(duì)照組(均P<0.05)，提示右旋美托咪啶可以下調(diào)小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量，抑制或消耗小膠質(zhì)細(xì)胞的激活，為腦損傷提供神經(jīng)保護(hù)作用，調(diào)節(jié)過度的炎癥反應(yīng)，減輕腦水腫、血腦屏障破壞和細(xì)胞凋亡[17]。

綜上所述，右美托咪定可能通過抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的激活，抑制IL-β、IL-18的釋放及Caspase-1的轉(zhuǎn)化，下調(diào)NLRP3炎性體的表達(dá)，從而減輕SAH患者早期腦損傷。