李桐，張燦，宋芳，王建東#

1首都醫(yī)科大學附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院婦瘤科，北京 100006

2安徽同科生物科技有限公司，安徽 六安 237300

宮頸癌是最常見的三大婦科腫瘤之一，也是女性第二大常見的惡性腫瘤[1]。目前普遍認為，高危型人乳頭瘤病毒（high-risk human papilloma virus，HR-HPV）持續(xù)感染是宮頸上皮內(nèi)瘤變（cervical intraepithelialneoplasia，CIN）發(fā)展為惡性腫瘤的直接原因。乳頭瘤病毒（papilloma virus，PV）是一種可以感染爬行類、鳥類和哺乳類等脊椎動物的小型雙鏈DNA病毒[2-3]。人乳頭瘤病毒（human papilloma virus，HPV）主要是通過感染皮膚和黏膜鱗狀上皮的基底細胞先引起微小磨損而后產(chǎn)生損傷。大部分HPV可被宿主免疫系統(tǒng)清除，患者并無癥狀或僅有較小損傷，只有某些特定的HPV產(chǎn)生持續(xù)性感染，開始是以環(huán)狀DNA方式自我復制，隨著病情進展，有些HPV整合到宿主細胞DNA中，造成宿主細胞異常分化并導致癌變[4]。HPV基因組是一個8000 bp左右的雙鏈環(huán)狀DNA，包含3個功能區(qū)域：早期蛋白編碼區(qū)（E1～E7）、晚期蛋白編碼區(qū)（L1和L2）和長控制區(qū)（long control region，LCR）[5]。早期蛋白編碼區(qū)E1～E2參與HPV基因組的復制和轉(zhuǎn)錄，晚期蛋白編碼區(qū)L1和L2及其包裹的病毒DNA為基因轉(zhuǎn)錄復制調(diào)控區(qū)，晚期蛋白編碼區(qū)編碼組成病毒衣殼的結(jié)構蛋白，L1、L2蛋白分別是病毒的主要和次要衣殼蛋白[6]。LCR作為調(diào)控區(qū)域，與E2蛋白結(jié)合調(diào)控E6和E7基因的表達[7]。根據(jù)感染能力，可將HPV分為HR-HPV和低危型HPV（low-risk HPV，LR-HPV），HR-HPV的主要致癌基因是E6和E7[8]。E6和E7蛋白參與眾多致癌過程，例如維持細胞增殖、逃避細胞生長抑制、造成基因組不穩(wěn)定和突變、阻止細胞凋亡、促進細胞遷移和侵襲、誘導血管生成等過程[9]。

表觀遺傳學是指非基因序列改變導致的基因表達水平的變化。常見的表觀遺傳學改變有DNA甲基化、組蛋白乙?；?去乙?；?、染色體重塑、染色體失活、基因組印記、非編碼RNA的調(diào)控等。研究表明，表觀遺傳學修飾將會影響細胞生長、分化、凋亡、轉(zhuǎn)化等與腫瘤相關的生物學過程[10]。DNA甲基化是目前研究最清楚、最重要的表觀遺傳修飾形式。在哺乳動物體細胞中，DNA甲基化是在甲基轉(zhuǎn)移酶的催化下，DNA的CG兩個核苷酸的胞嘧啶被選擇性地添加甲基，形成5-甲基胞嘧啶。CpG二核苷酸聚集的DNA區(qū)域稱為CpG島，該區(qū)域平均長度為10 000個堿基對，G+C堿基的含量至少占50%，通常位于基因的5'調(diào)控區(qū)。大約60%的人類基因啟動子與CpG島相關，并且呈非甲基化狀態(tài)，約6%人類基因啟動子區(qū)域的CpG島在早期發(fā)育和分化的細胞中以組織特異性方式甲基化，介導基因轉(zhuǎn)錄沉默[11-12]。已有研究揭示了DNA甲基化可通過不同機制調(diào)控基因表達：①可促進與甲基化CpG結(jié)合蛋白的結(jié)合能力，募集組蛋白修飾和染色體重塑復合物至甲基化的CpG位點，從而介導基因的轉(zhuǎn)錄抑制[13]；②胞嘧啶甲基化也可以通過阻斷轉(zhuǎn)錄激活因子結(jié)合到相關DNA序列上，直接抑制轉(zhuǎn)錄[14]；③在哺乳動物DNA中大多數(shù)5-甲基胞嘧啶在重復序列中被發(fā)現(xiàn)，這種DNA甲基化在防止基因易位、保護染色體完整性中發(fā)揮著重要作用[15]。在腫瘤細胞中發(fā)現(xiàn)很多基因的CpG島發(fā)生甲基化，主要包括腫瘤抑制基因和細胞周期相關基因。由病毒誘導的腫瘤細胞中也發(fā)現(xiàn)了DNA甲基化改變，腫瘤相關病毒可以編碼影響DNA甲基化的致癌蛋白，從而改變宿主和病毒基因的表達。本文就近年來宮頸癌中DNA甲基化改變及其致癌機制的研究進展作一綜述，以期更好地了解宮頸癌的發(fā)生發(fā)展過程，進一步推進宮頸癌的防治。

1 宮頸癌變中宿主DNA甲基化

在宮頸癌中，異常DNA甲基化包括低甲基化和高甲基化兩種模式。低甲基化一般發(fā)生在基因的啟動子區(qū)域，已發(fā)現(xiàn)主要有STK31、COL17A1和核糖體DNA三個基因。研究表明，在HPV16/18感染的宮頸癌細胞系中STK31基因啟動子區(qū)域出現(xiàn)低甲基化，并誘導了HPV16 E6/E7的整合[16]。另有研究發(fā)現(xiàn)，宮頸癌細胞中COL17A1基因的啟動子區(qū)域發(fā)生低甲基化，增加了宮頸癌細胞的轉(zhuǎn)移和侵襲能力，提示COL17A1基因啟動子的甲基化狀態(tài)可用于預測患者預后，改變COL17A1基因啟動子甲基化狀態(tài)可能是預防宮頸癌轉(zhuǎn)移的一種新策略[17]。

在CIN和宮頸癌組織中，DNA高甲基化較為常見，且宮頸癌組織中DNA甲基化水平高于CIN和正常宮頸組織，表明甲基化水平升高與宮頸癌的發(fā)生密切相關[16]。研究發(fā)現(xiàn)，CDKN2A轉(zhuǎn)錄起始位點下游區(qū)域的DNA甲基化可導致p16（INK4a）/p14（ARF）表達水平增加，這在宮頸早期病變中具有重要作用[18]。SALL3是一種腫瘤抑制基因，HPV感染可介導SALL3基因啟動子區(qū)域高甲基化，誘導SALL3的抑癌功能失活，從而促進宮頸癌的發(fā)生[19]。研究表明，γ-干擾素（interferon-γ，IFN-γ）基因甲基化在宮頸癌、CINⅠ級、CINⅡ～Ⅲ級及正常宮頸組織中的發(fā)生率分別為34.9%、13.0%、15.4%及4.7%。另外，在發(fā)生甲基化的宮頸癌組織中，IFN-γmRNA的表達水平低于未發(fā)生甲基化的宮頸癌組織；在發(fā)生甲基化的CINⅡ～Ⅲ級組織中，IFN-γmRNA的表達水平明顯低于未發(fā)生甲基化的CINⅡ～Ⅲ級組織[20]。宮頸活檢發(fā)現(xiàn)，細胞黏附分子1（cell adhesion molecule 1，CADM 1）/T淋巴細胞成熟相關蛋白（T-lymphocyte maturation-associated protein，MAL）基因甲基化程度隨著病變嚴重程度的增加而增加，尤其在CINⅢ級和宮頸癌中CADM 1/MAL的甲基化程度最高[21]。研究表明，宮頸癌、CINⅢ級及CINⅡ級組織中LINE1、HS3ST2、CCNA1、EPB41L3、EDNRB、LMX1、DPYS、PAX1基因的甲基化水平均高于正常宮頸組織和CINⅠ級組織[22-24]。研究發(fā)現(xiàn)，死亡相關蛋白激酶1（death associated protein kinase 1，DAPK1）啟動子甲基化狀態(tài)與宮頸病變的分級呈正相關（P＜0.05），DAPK1聯(lián)合O-6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（O-6-methylguanine-DNAmethyltransferase，MGMT）基因、MGMT聯(lián)合維甲酸受體β（retinoic acid receptor beta，RARB）基因、DAPK1聯(lián)合RARB基因等甲基化均與宮頸病變的分級呈正相關（P＜0.05）[25]。宮頸癌組織中Keap1基因啟動子CpG島發(fā)生高甲基化可導致kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關蛋白1（kelchlike ECH-associated protein 1，KEAP1）的表達水平降低，核轉(zhuǎn)錄因子紅細胞系相關因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2，NRF2）的表達水平升高，從而促進腫瘤細胞增殖、遷移及侵襲，抑制腫瘤細胞凋亡[26]。腫瘤抑制基因LDOC1在宮頸癌細胞系中表達沉默，對啟動子的甲基化情況進行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)LDOC1啟動子發(fā)生高甲基化導致LDOC1表達沉默，而這一現(xiàn)象可以通過DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑得到恢復，表明LDOC1可能成為宮頸癌的潛在分子標志物[27]。TSLC1是一種腫瘤抑制基因，研究發(fā)現(xiàn)TSLC1基因啟動子甲基化可能是宮頸癌發(fā)生的早期事件，TSLC1可作為宮頸癌早期的敏感標志物，為其預防提供依據(jù)[28]。Kabekkodu等[29]研究表明，在宮頸癌發(fā)生過程中，DOC2B基因啟動子高甲基化和基因表達沉默是一個早期且高頻事件，DNA啟動子甲基化可導致其表達水平降低，促進克隆形成和細胞增殖，同時發(fā)現(xiàn)DOC2B基因啟動子區(qū)域甲基化抑制了蛋白激酶B（protein kinase B，PKB，又稱AKT）和胞外信號調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）1/2信號通路。由此可見，這些基因啟動子甲基化對于宮頸癌的臨床分期和腫瘤分級具有重要意義。

2 宮頸癌變中HPV基因甲基化

HPV基因組發(fā)生甲基化能夠阻止其被清除，從而維持持久的感染狀態(tài)。HPV基因組甲基化在宮頸癌的發(fā)生過程中具有重要作用。目前，有關HPV中L1、L2、LCR區(qū)域CpG位點甲基化的研究最多，這些區(qū)域的甲基化與宮頸癌和CIN的發(fā)生具有密切關系。HPVL1基因甲基化是宮頸組織發(fā)生惡變的危險因素。研究表明，HPV16L1基因甲基化與惡性腫瘤的發(fā)生密切相關，利用甲基化敏感性高分辨率熔解（methylation-sensitive high resolution melting，MS-HRM）曲線檢測HPV16L1基因甲基化可能成為檢測HPV16陽性的一種有效方法，可以識別出具有侵襲性惡性腫瘤的高風險患者，同時發(fā)現(xiàn)HPV16L1基因甲基化可影響E6、E7mRNA的表達[30-31]。HPV16L1、L2和E5基因CpG位點甲基化可成為診斷HPV16陽性的CINⅡ級病變的生物 標 志 物[32]。 HPV18、HPV31、HPV33、HPV45、HPV52、HPV51和HPV58的L1和L2基因的CpG位點異常甲基化與CIN發(fā)生的早期階段有關，可成為宮頸惡性瘤變的生物標志物[33-34]。另有研究發(fā)現(xiàn)，年輕女性中HPV16L1、L2甲基化與宮頸病變的分級具有弱相關性，提示HPV甲基化作為生物標志物需要考慮年齡因素[35]。

在宮頸癌中，甲基化改變不僅發(fā)生在DNA水平，還發(fā)生在RNA和蛋白質(zhì)水平。N6-甲基腺苷（N6-methyladenosine，m6A）是一種普遍存在且保守的RNA修飾，通過影響mRNA的剪接、運輸、定位、傳導和翻譯參與細胞分化、代謝、免疫耐受和神經(jīng)信號傳導等生物學過程[36]。目前有關m6A在宮頸癌中作用的研究較少，然而非編碼RNA的甲基化調(diào)控在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中的作用也是不可忽視的。研究發(fā)現(xiàn)，宮頸癌中微小RNA（m icroRNA，m iRNA）-9前體啟動子的高甲基化導致miRNA-9表達水平下調(diào)，從而削弱了對白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）/Janus激酶（Janus kinase，JAK）/信號轉(zhuǎn)導及轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）信號通路的抑制作用[37]。HPV16E6參與miRNA-23b啟動子甲基化調(diào)控，通過下調(diào)miRNA-23b的表達水平，從而增強肝細胞生長因子受體（hepatocyte grow th factor receptor，HGFR，也稱 c-met）的活性，誘導宮頸癌細胞凋亡[38]。研究表明，過表達的漿細胞瘤轉(zhuǎn)化遷移基 因 1（plasmacytoma variant translocatin 1 gene，PVT1）可促進宮頸癌細胞增殖和遷移，其作用機制為PVT1結(jié)合并募集果蠅zeste 2多梳抑制復合物2亞基增強子（enhancer of zeste 2 polycomb repressive repressive complex 2 subunit，EZH2）到miRNA-200b的啟動子區(qū)，增加了組蛋白H3K27在miRNA-200b啟動子區(qū)的甲基化水平，從而抑制miRNA-200b的表達[39]。

3 HPV與宿主DNA 甲基化的關系

HPV和宿主DNA甲基化對CIN和宮頸癌的發(fā)生具有重要作用，同時HPV和宿主DNA甲基化可互相調(diào)控，這種調(diào)控作用在宮頸癌的發(fā)生過程中也發(fā)揮重要作用。甲基化基因可成為預防和治療宮頸癌的有效靶點。HS3ST2和CCNA1基因的高甲基化與HPV16和HPV18感染的宮頸鱗狀上皮內(nèi)病變和宮頸癌的發(fā)生率呈正相關（P＜0.05），甲基化陽性的宮頸組織中HS3ST2和CCNA1基因的表達水平均低于甲基化陰性的宮頸組織，表明HS3ST2和CCNA1基因可能在HPV誘導的宮頸癌中發(fā)揮重要作用，具有特異性高甲基化基因的患者更有可能發(fā)展為侵襲性宮頸癌[40]。另一項研究發(fā)現(xiàn)，HPV16感染的宮頸鱗狀細胞癌中表皮生長因子受體（epidermal grow th factor receptor，EGFR）啟動子發(fā)生高甲基化，感染HPV16的宮頸鱗狀細胞癌中EGFR啟動子的甲基化率明顯高于感染其他HPV基因型的宮頸鱗狀細胞癌，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）[41]。研究表明，宮頸癌中CpG島高甲基化可抑制脆性組氨酸三聯(lián)體（fragile histidine triad，F(xiàn)HIT）的表達，F(xiàn)HIT基因甲基化與HPV16感染具有相關性，提示FHIT可能是宮頸癌預防和治療的有效靶點[42]。另有研究表明，DLX4和SIM 1基因啟動子高甲基化與HPV感染具有相關性，這些基因可能成為宮頸癌HPV感染的重要標志物[43]。PRDM 14、FAM19A4、EPB41L3基因甲基化作為HRHPV感染的陽性標志物，可為HPV感染的宮頸癌的防治提供重要靶標，其中FAM19A4、EPB41L3能夠較為準確地預測宮頸癌和CINⅡ～Ⅲ級病變[44-46]。

基因甲基化可影響HPV感染，HPV感染也能夠引起基因的異常甲基化。人類端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（human telomerase reverse transcriptase，hTERT）啟動子和近端外顯子序列的甲基化程度與HPV感染的宮頸癌中hTERT的異常表達有關，這些區(qū)域的DNA甲基化檢測可能為宮頸癌的早期診斷提供依據(jù)[47]。Steenbergen等[48]在人原代角質(zhì)形成細胞中模擬HPV誘導轉(zhuǎn)化的不同階段，通過甲基化特異性數(shù)字染色體組型（methylation specific digital karyotyping，MSDK）分析發(fā)現(xiàn)了新的DNA甲基化，包括FAM 19A4、LHX1、NKX2-8、PHACTR3和PRDM 14基因，這些基因可能作為分子標志物評估HR-HPV陽性感染患者是否存在宮頸病變。HPV癌蛋白在腫瘤細胞中可以誘導特異的啟動子發(fā)生甲基化，例如HPV E7蛋白可驅(qū)使CCNA1基因發(fā)生甲基化。CCNA1基因是一種抑癌基因，參與細胞周期調(diào)控，是細胞順利通過S期和G2/M期所必須的調(diào)節(jié)因子。研究表明，在HPV感染的上皮細胞中可發(fā)現(xiàn)CCNA1啟動子高甲基化，當HPV整合到宿主基因組中，CCNA1啟動子甲基化程度進一步加深，HPV E7蛋白通過其鋅指結(jié)構域CR3與DNA甲基轉(zhuǎn)移酶 1（DNA methyltransferase 1，DNMT1）結(jié)合，從而在CCNA1啟動子區(qū)域形成蛋白復合物，誘導CCNA1啟動子區(qū)域發(fā)生高甲基化，造成CCNA1表達下調(diào)，CCNA1的異常表達導致細胞無限增殖和腫瘤形成[49]。在HPV16陽性的人宮頸癌SiHa和CaSki細胞中，敲低E6的表達后，p53基因表達水平升高，抑制了DNMT1蛋白表達和啟動子活性；而敲低p53的表達后可促進DNMT1蛋白表達和啟動子活性；E6敲低后導致SiHa細胞生長緩慢，而DNMT1過表達可部分逆轉(zhuǎn)這一現(xiàn)象，提示HPV16E6通過抑制p53的表達促進DNMT1蛋白表達并增加啟動子活性[50]。

4 HPV和宿主DNA甲基化與HPV免疫逃逸的關系

某些腫瘤病毒可通過調(diào)控宿主DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的活性影響宿主細胞中免疫相關基因的表達，或者通過誘導基因啟動子甲基化修飾抑制免疫相關基因的表達，導致這些基因的免疫功能受到抑制，從而破壞宿主免疫系統(tǒng)對病毒的攻擊，實現(xiàn)病毒在宿主內(nèi)的免疫逃逸，當病毒發(fā)生免疫逃逸后會進行持續(xù)感染，病毒引起的免疫系統(tǒng)的損傷導致腫瘤細胞逃逸抗腫瘤免疫系統(tǒng)的監(jiān)視，從而導致腫瘤的發(fā)生[51]。干擾素-κ（interferon-kappa，IFN-κ）介導的HPV DNA甲基化修飾對免疫基因的表達具有調(diào)控作用。研究發(fā)現(xiàn)HPV16E6而非E7誘導IFN-κ啟動子甲基化，從而導致IFN-κ的表達水平降低[52-53]。在HPV16陽性的CIN和宮頸癌中IFN-κ幾乎不表達，在HPV16陰性的正常宮頸組織中IFN-κ呈高表達，表明HPV16干擾了IFN-κ的表達，促進了HPV在宿主細胞中的持續(xù)感染[52]。CXC趨化因子配體14（C-X-C motif chemokine ligand 14，CXCL14）可以抑制血管生成，直接募集免疫細胞如樹突狀細胞、自然殺傷細胞和T細胞等，在多種腫瘤中具有抗腫瘤活性[54-57]。研究報道，HPV16E7通過誘導CXCL14啟動子甲基化顯著下調(diào)其表達，從而達到逃逸宿主免疫監(jiān)視的作用，CXCL14表達水平升高后能夠增加自然殺傷細胞、CD4+T和CD8+T細胞對腫瘤引流淋巴結(jié)的浸潤能力，誘導免疫細胞的趨化性[55-56]。還有研究發(fā)現(xiàn)，HR-HPVE7通過誘導人類白細胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）-E啟動子甲基化下調(diào)其表達，HLA-E是HLA中非經(jīng)典的HLA-Ⅰ類分子，HLA-E呈遞的病毒抗原可促進CD8+T細胞的殺傷活性[57]。研究表明，HR-HPVE7可誘導HLA-E啟動子甲基化導致其表達下調(diào)，抑制其將病毒抗原呈遞給CD8+T細胞，從而使病毒逃逸宿主的免疫監(jiān)視，得以持續(xù)感染，繼而導致HPV感染相關腫瘤的發(fā)生[58]。

5 HPV和宿主DNA 甲基化在宮頸癌防治中的應用

目前HPV檢測是篩查宮頸癌和CIN的重要手段。研究表明，基因的甲基化狀態(tài)檢測可為診斷CINⅡ級及以上的宮頸病變提供證據(jù)[59-60]。在CINⅡ級及以上宮頸病變的診斷中，PCDHA4和PCDHA13甲基化檢測與HPV基因檢測具有相似的靈敏度，但前者的特異度更高[59]。PAX1基因甲基化對亞洲人群宮頸癌具有潛在的診斷價值，在宮頸刮片中對PAX1甲基化和HPV基因進行平行檢測較單獨HPV基因檢測的準確度更高[61]。焦磷酸測序結(jié)果證實，DAPK1、RARB、WIF1和SLIT2基因是宮頸癌患者中甲基化異常的常見靶點，相較于單獨應用HPV篩查宮頸癌，HPV聯(lián)合上述4種基因甲基化水平的檢測能有效提高篩查宮頸癌的特異度，同時甲基化改變可能發(fā)生在宮頸癌早期，可為宮頸癌的早期篩查提供重要證據(jù)[62]。研究顯示HPV16L1/L2區(qū)域中DNA甲基化程度與宮頸病變的分級有關，HPVE2區(qū)域和L1/L2區(qū)域中DNA甲基化程度在核分裂患者中顯著增加，對L1/L2區(qū)域CpG的第5600和5609位核苷酸進行甲基化評估，可獲得正常樣品和異常核分裂樣品的最佳分離[63]。上述基因的甲基化有望成為宮頸癌篩查的輔助生物標志物。

研究表明，順鉑和5-氮雜胞苷可通過對腫瘤相關基因ESR1、BRCA1、RASSF1A、MLH1和MYOD1啟動子去甲基化而引發(fā)細胞毒性、抑制細胞生長[64]。在宮頸癌患者中，TNFRSF10C和TNFRSF10D啟動子高甲基化，在癌前病變中也可檢測到TNFRSF10C甲基化，提示這種變化是宮頸癌發(fā)生的早期事件。腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體（TNF related apoptosis inducing ligand，TRAIL）及其受體誘導的凋亡作用與宮頸癌細胞系中TNFRSF10C和（或）TNFRSF10D的下調(diào)有關，TNFRSF10C和（或）TNFRSF10D的下調(diào)可與化療藥物協(xié)同發(fā)揮作用，提示這些基因失活在體外凋亡通路中發(fā)揮關鍵作用[65]。上述研究表明甲基化調(diào)控為研究新的治療靶點提供了新思路。

6 小結(jié)與展望

宮頸癌是最常見的婦科惡性腫瘤之一，HRHPV持續(xù)感染是宮頸癌發(fā)生的主要危險因素。雖然近年來宮頸細胞學篩查和HPV疫苗的應用使宮頸癌和癌前病變得以早期被發(fā)現(xiàn)和治療，但目前仍缺乏有效的監(jiān)測指標且其分子機制尚未完全清楚。HPV基因組甲基化和HPV對宿主DNA甲基化的調(diào)節(jié)作用可為HPV致癌機制和免疫逃逸機制提供更深入的理論依據(jù)。甲基化修飾基因不僅可作為宮頸癌早期診斷、疾病進展和預后的潛在標志物，還可以通過調(diào)控甲基化狀態(tài)制訂有效的治療策略，對治療宮頸癌具有深遠的指導意義。