黃楨雅 陳俊男 賴琳英 周桂文 周云超 梁黎明 陳敏亮

[摘要]目的：探討在-80℃低溫條件下凍存不同時(shí)間的脂肪組織顆粒的結(jié)構(gòu)及生物學(xué)活性變化。方法：將吸脂后的脂肪經(jīng)過(guò)洗滌、離心后低溫保存，1周、4周、8周、12周、16周、20周、24周后，對(duì)復(fù)溫后的脂肪組織顆粒進(jìn)行大體觀察、組織學(xué)觀察、活性檢測(cè)、SVF細(xì)胞培養(yǎng)等。結(jié)果：隨凍存時(shí)間的延長(zhǎng)，脂肪組織的結(jié)構(gòu)及生物學(xué)活性逐步下降，凍存1周的脂肪組織活細(xì)胞面積（35.35±4.05）%較新鮮脂肪（79.25±7.44）%顯著減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），凍存1周的脂肪細(xì)胞較新鮮脂肪細(xì)胞線粒體活性顯著下降（P<0.01），SVF細(xì)胞培養(yǎng)，凍存脂肪來(lái)源的貼壁細(xì)胞數(shù)量較新鮮脂肪顯著減少（P<0.01），且細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢、狀態(tài)較差。結(jié)論：大多數(shù)脂肪細(xì)胞在一次冷凍保存過(guò)程中便失活，而凍存時(shí)間的延長(zhǎng)與脂肪細(xì)胞活性降低的相關(guān)性并不明顯，不推薦臨床使用不添加保護(hù)劑直接凍存的脂肪進(jìn)行移植。

[關(guān)鍵詞]脂肪組織;低溫保存;冷凍;脂肪移植;細(xì)胞形態(tài);細(xì)胞活力

[中圖分類(lèi)號(hào)]R622? ? [文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A? ? [文章編號(hào)]1008-6455（2019）02-0014-04

Abstract： Objective? The aim of this study was to observe the changes of histological structure and biological activity of adipose granules frozen at -80℃ for different time. Methods? The adipose tissue obtained by liposuction was stored at low temperature after washing and centrifugation. After 1 week， 4 weeks， 8 weeks， 12 weeks， 16 weeks， 20 weeks and 24 weeks， the granules of adipose tissue after rewarming were observed by gross observation， histological observation， activity detection， SVF cell culture and so on. Results? With the prolongation of freezing time， the histological structure and biological activity of fat gradually decreased. The area of living cells in adipose tissue frozen for 1 week （35.35±4.05）% was significantly lower than that of fresh adipose tissue （79.25±7.44）%， the difference was statistically significant（P<0.01）. The mitochondrial activity of adipocytes frozen for 1 week was significantly lower than that of fresh adipocytes （P<0.01）. In SVF cell culture， the number of adherent cells derived from cryopreserved fat was significantly lower than that of fresh fat （P<0.01）， and the cells grew slowly and in poor condition. Conclusion? Most adipocytes are inactivated during a single cryopreservation. There was no significant correlation between the prolongation of freezing time and the decrease of adipocyte activity. It is not recommended to transplant directly frozen fat without protective agent in clinic.

Key words： adipose tissue; cryopreservation; freezing; fat transplantation; cell morphology; cell viability

人自體脂肪組織顆粒是外科領(lǐng)域常用的軟組織填充材料，將其移植以治療軟組織凹陷的效果已得到醫(yī)生及患者的肯定。而目前無(wú)法一次治療就達(dá)到滿意效果的主要原因是脂肪的高吸收率，甚至可高達(dá)70%[1]。臨床上仍需要通過(guò)少量、多次的移植以達(dá)到最終治療效果。除此之外，脂肪組織中含有豐富的脂肪干細(xì)胞（Adipose derived stem or stromal cells，ADSCs），使其在再生醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用也日漸得到重視。故如何將脂肪組織體外有效地長(zhǎng)期保存以備日后所需，是值得學(xué)者們研究的問(wèn)題。根據(jù)以往的凍存脂肪相關(guān)研究[2-6]，確有不少有差異甚至矛盾的結(jié)果。本研究主要從凍存時(shí)長(zhǎng)的角度切入，將人脂肪組織顆粒保存在-80℃環(huán)境中，凍存不同時(shí)間后觀察復(fù)溫后脂肪組織的生物學(xué)性狀改變，以期為凍存脂肪的進(jìn)一步優(yōu)化及標(biāo)準(zhǔn)化提供相關(guān)理論參考和基礎(chǔ)性的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1? 材料和方法

1.1 臨床組織標(biāo)本

1.1.1 人自體脂肪組織顆粒臨床樣本來(lái)源：本實(shí)驗(yàn)所用標(biāo)本均取自于中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院第四醫(yī)學(xué)中心燒傷整形科，供者為進(jìn)行吸脂術(shù)的健康成年女性，年齡24～38歲，取脂部位為腹部及大腿。實(shí)驗(yàn)樣本的采集均經(jīng)過(guò)患者本人知情同意，并經(jīng)醫(yī)院機(jī)構(gòu)審查委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.1.2 脂肪組織顆粒獲取與純化：供區(qū)腫脹麻醉后，使用側(cè)孔直徑1mm、針管直徑3mm的多側(cè)孔吸脂針，連接20ml注射器進(jìn)行吸脂。使用林格氏液漂洗獲取脂肪組織顆粒，并剔除粗大纖維結(jié)締組織，垂直靜置分層后去除下層的腫脹液及血液混合物（此過(guò)程可重復(fù)操作多次）。之后于溫控離心機(jī)中以1 000r/min離心3min。棄掉上層的油脂及底層液體，保留中層脂肪組織。

1.2 試劑和儀器

1.2.1 試劑：HE染色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司），Anti-Perilipin-1抗體（英國(guó)Abcam），山羊Anti-Rabbit IgG H&L（Alexa Fluor? 647）（英國(guó)Abcam），DAPI（北京索萊寶科技有限公司），Ⅰ型膠原酶（美國(guó)Gibico），胰蛋白酶（美國(guó)Invitrogen），PBS緩沖液，胎牛血清（美國(guó)Gibico），青鏈霉素（北京索萊寶科技有限公司），低糖DMEM培養(yǎng)液（美國(guó)Gibico），Cell Counting Kit-8（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）。

1.2.2 主要儀器：離心機(jī)，CO2培養(yǎng)箱（37℃，5%CO2），恒溫水浴箱，倒置顯微鏡，共聚焦顯微照相系統(tǒng)，普通家用冰箱，超低溫冰箱，切片機(jī)，超凈工作臺(tái)，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀。

1.3 方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)分組：將純化后的脂肪組織顆粒，隨機(jī)分為8組。1組新鮮脂肪組織顆粒作為對(duì)照組，其余脂肪組織顆粒按凍存時(shí)長(zhǎng)的不同分為1周組、4周組、8周組、12周組、16周組、20周組、24周組。

1.3.2 脂肪組織顆粒凍存與復(fù)蘇：①凍存：純化后的脂肪組織顆粒分裝于無(wú)菌離心管中，4℃平衡30min后，移入-20℃冰箱，4h后移入-80℃深低溫冰箱保存;②復(fù)蘇：取出凍存的脂肪，置于37℃水浴箱中快速震蕩復(fù)溫，靜置后去除上層油脂，獲得純脂肪組織顆粒。

1.3.3 組織學(xué)檢測(cè)：每組各取5份0.5ml復(fù)溫后的脂肪組織顆粒，用濾紙包裹后，經(jīng)過(guò)固定、脫水、透明、浸蠟、包埋、切片等步驟，制作成石蠟切片。①HE染色：常規(guī)蘇木素伊紅染色，觀察脂肪細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài);②免疫熒光染色：脂滴包被蛋白（Perilipin）是一種包被于脂滴表面的脂肪代謝相關(guān)蛋白，通過(guò)染色活脂肪細(xì)胞標(biāo)志蛋白Perilipin以評(píng)估脂肪細(xì)胞活力[7];使用一抗兔抗Perilipin和二抗Alexa Fluor 647標(biāo)記的山羊抗兔IgG染色Perilipin，抗熒光衰減封片劑（含DAPI）封片。

1.3.4 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力：取復(fù)溫后的脂肪組織顆粒置于離心管中，加入等體積含有0.1%Ⅰ型膠原酶的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS），放入37℃水浴箱中振蕩消化40min，終止消化后，將消化好的組織靜置5min，待其分層后吸取上層的脂肪細(xì)胞于新的離心管中，使用PBS洗滌細(xì)胞，再次靜置5min后，收集上層相對(duì)純凈的脂肪細(xì)胞，最后將脂肪細(xì)胞加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)基中，調(diào)整細(xì)胞濃度，制備脂肪細(xì)胞懸液。以5 000個(gè)/孔的數(shù)量將脂肪細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板，每孔體積200μl，培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱預(yù)培養(yǎng)1h，之后向每孔加入20μl CCK-8溶液，繼續(xù)放置培養(yǎng)箱內(nèi)孵育，4h后取出，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定在450nm處的吸光度（OD值）。

1.3.5 SVF細(xì)胞培養(yǎng)：取復(fù)溫后的脂肪組織顆粒，經(jīng)過(guò)膠原酶消化、過(guò)濾、離心等步驟后獲得基質(zhì)血管成分（stromal vascular fraction，SVF）[8]，之后將分離的SVF進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，培養(yǎng)基每3d更換1次，原代培養(yǎng)14d后，觀察培養(yǎng)瓶貼壁細(xì)胞的形態(tài)，并計(jì)數(shù)[9]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：以SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x?±s）表示，采用單因素方差分析，SNK法進(jìn)行兩兩比較的顯著性檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2? 結(jié)果

2.1 自體脂肪組織顆粒大體形態(tài)觀察：新鮮脂肪顆粒飽滿有光澤，無(wú)液化油脂;隨凍存時(shí)間的延長(zhǎng)，復(fù)溫后的脂肪組織顆粒形態(tài)逐漸下降、液化油脂雜質(zhì)增多;凍存24周復(fù)溫的脂肪組織中可見(jiàn)大量液化油脂，且破損顆粒多，脂肪細(xì)胞破壞嚴(yán)重。

2.2 組織學(xué)檢測(cè)結(jié)果

2.2.1 不同凍存時(shí)間的脂肪組織顆粒的HE染色結(jié)果：新鮮脂肪組織顆粒的細(xì)胞形態(tài)良好，細(xì)胞膜及細(xì)胞間質(zhì)清晰完整，細(xì)胞核大小一致，胞內(nèi)脂滴溶解使細(xì)胞呈空泡樣，細(xì)胞之間排列規(guī)律、緊密;凍存1周的脂肪組織顆粒，脂肪細(xì)胞結(jié)構(gòu)較為清晰完整，光鏡下與新鮮脂肪形態(tài)上無(wú)明顯差異;凍存4、8、12、16、20、24周的脂肪組織顆粒，組織結(jié)構(gòu)隨凍存時(shí)間的延長(zhǎng)越發(fā)紊亂，壞死結(jié)構(gòu)增多，細(xì)胞膜變形、破裂，細(xì)胞核模糊不清。

2.2.2 不同凍存時(shí)間脂肪組織顆粒的免疫熒光染色結(jié)果：通過(guò)對(duì)新鮮及復(fù)溫后的脂肪進(jìn)行免疫熒光染色（脂肪：Perilipin、細(xì)胞核：DAPI），以評(píng)估脂肪細(xì)胞的活力。新鮮對(duì)照組中可觀察到Perilipin強(qiáng)烈表達(dá)的脂肪細(xì)胞，而凍存脂肪的Perilipin陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目明顯減少，隨凍存凍存時(shí)間的延長(zhǎng)，脂肪細(xì)胞活性逐漸降低。計(jì)算Perilipin陽(yáng)性區(qū)域面積，顯示出：凍存1周的脂肪組織活細(xì)胞面積為（35.35±4.05）%較新鮮對(duì)照組（79.25±7.44）%顯著減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）;凍存4周的脂肪組織活細(xì)胞面積為（27.08±4.10）%較凍存1周的脂肪明顯減少（P<0.05），其余各組脂肪每相鄰兩組間活細(xì)胞面積無(wú)顯著性差異。

2.3 脂肪細(xì)胞線粒體活性檢測(cè)結(jié)果：CCK-8結(jié)果顯示，凍存1周的脂肪細(xì)胞較新鮮脂肪細(xì)胞活性顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）;凍存4周的脂肪細(xì)胞較凍存1周的脂肪細(xì)胞活性明顯下降（P<0.05），而其余各組脂肪每相鄰兩組間脂肪細(xì)胞線粒體活性無(wú)顯著性差異。

2.4 SVF細(xì)胞培養(yǎng)：取新鮮、凍存1周、凍存24周的脂肪組織經(jīng)過(guò)膠原酶消化、過(guò)濾、離心后獲得SVF，通過(guò)SVF細(xì)胞培養(yǎng)獲得貼壁細(xì)胞。新鮮脂肪來(lái)源的貼壁細(xì)胞數(shù)量多，細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形，形態(tài)完整均一，生長(zhǎng)狀態(tài)良好，凍存脂肪來(lái)源的貼壁細(xì)胞數(shù)量顯著減少（P<0.01），凍存1周、凍存24周的脂肪組織獲得的貼壁細(xì)胞數(shù)量無(wú)顯著性差異;凍存培養(yǎng)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，形態(tài)非規(guī)則長(zhǎng)梭形、多角，部分細(xì)胞呈羽狀樣并停止生長(zhǎng)（紅色箭頭所示），這些細(xì)胞可能無(wú)活性或活性降低。

3? 討論

近年來(lái)，隨脂肪抽吸及移植技術(shù)的不斷優(yōu)化，自體脂肪移植在整形外科臨床治療中被廣泛應(yīng)用。人自體脂肪不僅可作為填充材料用于改善軟組織凹陷，其對(duì)面部年輕化、瘢痕等的治療效果也逐漸得到了臨床醫(yī)生的肯定[10-11]。無(wú)論是從造?；颊哌€是節(jié)約醫(yī)療資源的角度考慮，將一次抽吸的脂肪組織體外保存以供后續(xù)之用，是患者和醫(yī)生共同的愿望和追求。

低溫凍存是目前保存器官、組織或細(xì)胞最值得信賴的方法。近二十年來(lái)，眾多學(xué)者為脂肪組織的低溫保存已進(jìn)行了大量的工作，包括優(yōu)化脂肪組織的獲取、添加冷凍保護(hù)劑、尋找更適應(yīng)保存組織的溫度、控制降溫速率等，但目前并未形成一個(gè)完全標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)一的冷凍保存方案[12-15]。由于研究中的不確定因素較多，不同的研究人員在不同實(shí)驗(yàn)研究中得出了很多不甚相同的結(jié)果。在這樣冷凍脂肪臨床應(yīng)用的安全性得不到保證的情況下，有不少個(gè)人和私立機(jī)構(gòu)違規(guī)將脂肪組織直接保存于普通冰箱冷凍室，之后再度進(jìn)行脂肪移植。這一不確定的治療行為可能給患者帶來(lái)了更大的術(shù)后并發(fā)癥發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[16-17]。

本研究從臨床角度出發(fā)，將人脂肪組織顆粒洗滌、離心后，不添加任何冷凍保護(hù)劑，保存于深低溫冰箱（-80℃）中，凍存不同時(shí)間后觀察復(fù)溫后脂肪組織的細(xì)胞結(jié)構(gòu)、活力、代謝改變，為冷凍脂肪的進(jìn)一步優(yōu)化以及標(biāo)準(zhǔn)化提供相關(guān)的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。深低溫冰箱（-80℃）及液氮（-196℃）的較普通家用冰箱（-20℃）更利于組織保存[18]，但由于液氮維護(hù)困難、穩(wěn)定性較差不利于臨床應(yīng)用，故本實(shí)驗(yàn)選用了-80℃作為保存脂肪組織的實(shí)驗(yàn)條件。

從各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果來(lái)看，隨凍存時(shí)間的延長(zhǎng)，脂肪組織的結(jié)構(gòu)及生物學(xué)活性逐步下降。在凍存早期（1、4周），盡管大體外觀和組織結(jié)構(gòu)較新鮮脂肪變化不明顯，但活脂肪細(xì)胞面積百分比及線粒體活性卻呈現(xiàn)顯著的下降趨勢(shì)。只冷凍保存1周的脂肪，獲得的貼壁細(xì)胞數(shù)量也顯著低于新鮮脂肪，且生長(zhǎng)狀態(tài)較差。復(fù)合組織的冷凍過(guò)程是較單個(gè)細(xì)胞更為復(fù)雜的。在凍存早期，除細(xì)胞失水、胞內(nèi)冰晶形成外，胞外冰的形成、血管損傷破裂、復(fù)溫過(guò)程的熱應(yīng)力損傷對(duì)多細(xì)胞組織的低溫保存也產(chǎn)生了很大的影響[19]。而這些損傷大多發(fā)生在降溫、凍存早期及復(fù)溫過(guò)程中。則可以認(rèn)為，大多數(shù)脂肪細(xì)胞在一次冷凍保存過(guò)程中便失活，而凍存時(shí)間的延長(zhǎng)與脂肪細(xì)胞活性降低的相關(guān)性并不明顯。冷凍復(fù)溫的脂肪組織可能更多是作為一種無(wú)活性或低活性的惰性材料植入體內(nèi)。

本實(shí)驗(yàn)有一定的局限性，僅選擇了單一的保存溫度，且缺少相關(guān)的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。將活性減低的凍存脂肪移植入體內(nèi)是否會(huì)增加相關(guān)移植并發(fā)癥的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，需更進(jìn)一步的研究。但就本實(shí)驗(yàn)結(jié)果而言，仍然不推薦臨床使用不添加保護(hù)劑直接凍存的脂肪。期待日后有更優(yōu)化的冷凍保存方法和革新技術(shù)，早日使冷凍脂肪廣泛應(yīng)用于臨床。

[參考文獻(xiàn)]

[1]Coleman SR.Structural fat grafts： the ideal filler？[J].Clin Plast Surg，2001，28（1）：111-119.

[2]Moscatello DK，Dougherty M，Narins RS，et al.Cryopreservation of human fat for soft tissue augmentation： viability requires use of cryoprotectant and controlled freezing and storage[J].Dermatol Surg，2005，31（11 Pt 2）：1506-1510.

[3]MacRae JW，Tholpady SS，Ogle RC，et al.Ex vivo fat graft preservation： effects and implications of cryopreservation[J].Ann Plast Surg，2004，52（3）：281-282，283.

[4]Zanata F，Bowles A，F(xiàn)razier T，et al.Effect of cryopreservation on human adipose tissue and isolated stromal vascular? fraction cells： in vitro and in vivo analyses[J].Plast Reconstr Surg，2018，141（2）：232e-243e.

[5]孫音，伍明政，顧洛莎，等.人不同部位凍存顆粒脂肪活性的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國(guó)美容整形外科雜志，2018，29（7）：417-420.

[6]鄧穎，劉少倩，謝紅炬，等.海藻糖對(duì)脂肪細(xì)胞凍存后存活率的影響[J].中南大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2017，42（5）：507-510.

[7]Nishimura S，Manabe I，Nagasaki M，et al.Adipogenesis in obesity requires close interplay between differentiating adipocytes， stromal cells， and blood vessels[J].Diabetes，2007，56（6）：1517-1526.

[8]Yoshimura K，Shigeura T，Matsumoto D，et al.Characterization of freshly isolated and cultured cells derived from the fatty and fluid portions of liposuction aspirates[J].J Cell Physiol，2006，208（1）：64-76.

[9]Mashiko T，Wu SH，Kanayama K，et al.Biological properties and therapeutic value of cryopreserved fat tissue[J].Plast Reconstr Surg，2018，141（1）：104-115.

[10]Xu X，Lai L，Zhang X，et al.Autologous chyle fat grafting for the treatment of hypertrophic scars and scar-related conditions[J].Stem Cell Res Ther，2018，9（1）：64.

[11]王斐，陳敏亮，賴琳瑛，等.自體乳糜脂肪治療增生性瘢痕的臨床探究[J].中國(guó)美容醫(yī)學(xué)，2017，26（12）：9-13.

[12]Cui X，Pu LL.The search for a useful method for the optimal cryopreservation of adipose aspirates： part Ⅱ.In vivo study[J].Aesthet Surg J，2010，30（3）：451-456.

[13]Cui X，Pu LL.The search for a useful method for the optimal cryopreservation of adipose aspirates： part Ⅰ.In vitro study[J].Aesthet Surg J，2009，29（3）：248-252.

[14]Cui XD，Gao DY，F(xiàn)ink BF，et al.Cryopreservation of human adipose tissues[J].Cryobiology，2007，55（3）：269-278.

[15]Pu LL，Cui X，Li J，et al.The fate of cryopreserved adipose aspirates after in vivo transplantation[J].Aesthet Surg J，2006，26（6）：653-661.

[16]Clover A，Buckley CE.Discussion： biological properties and therapeutic value of cryopreserved fat tissue[J].Plast Reconstr Surg，2018，141（1）：116-117.

[17]Chaput B，Orio J，Garrido I，et al.A clinical scalable cryopreservation method of adipose tissue for reconstructive? surgery assessed by stromal vascular fraction and mice studies[J].Plast Reconstr Surg，2014，133（4）：815-826.

[18]肖斌，劉毅，于晟，等.脂肪顆粒組織在不同凍存條件下低溫保護(hù)劑的篩選[J].中國(guó)美容醫(yī)學(xué)，2005，14（4）：397-399.

[19]Shu Z，Gao D，Pu LL.Update on cryopreservation of adipose tissue and adipose-derived stem cells[J].Clin Plast Surg，2015，42（2）：209-218.