黃嬌 編譯，穆青 審校

(復(fù)旦大學(xué)藥學(xué)院，上海 200000)

20世紀(jì)出現(xiàn)了許多能成功預(yù)防與控制感染性疾病的方法，然而人們卻誤認(rèn)為對(duì)抗感染性疾病的戰(zhàn)爭(zhēng)已經(jīng)結(jié)束。在20世紀(jì)80年代，藥企普遍認(rèn)為貨架上有足夠的抗生素，因此，他們將研究的精力轉(zhuǎn)移至別處。當(dāng)新的流感病毒爆發(fā)以及耐藥病原菌再次出現(xiàn)時(shí)，發(fā)現(xiàn)這種樂觀態(tài)度只是暫時(shí)的。超級(jí)細(xì)菌，即幾乎對(duì)所有抗生素產(chǎn)生抗藥性的細(xì)菌，對(duì)人類健康造成巨大威脅。每年在全世界范圍內(nèi)超過一千三百萬人死于新的感染性疾病或者先前被認(rèn)為容易控制的二次感染。Christina Kourtesi等在期刊The Open Microbiology Journal, 2013, 7 (Suppl 1-M3): 34-52發(fā)表了題目為Microbial Efflux Systems and Inhibitors:Approaches to drug discoveryand the challenge of clinical implementation的綜述文章，我們通過編譯其前半部分內(nèi)容介紹細(xì)菌的外排泵耐藥系統(tǒng)。

多藥外排作用是致使多種抗生素以及化學(xué)治療藥物對(duì)細(xì)菌無效的一個(gè)主要原因。外排作用來源于膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的活性，這種蛋白即為多藥外排系統(tǒng)。多藥外排系統(tǒng)在細(xì)胞代謝過程中非常重要，并且在膜拓?fù)?、能量耦合機(jī)制以及底物特異性方面的作用各有不同。鑒定天然底物和外排系統(tǒng)抑制劑需要積極而有拓展性的研究課題。基于序列的相似性，外排系統(tǒng)被劃分為以下六個(gè)超級(jí)家族(圖1)：ATP結(jié)合盒(ABC)、多藥及毒性化合物外排(MATE)、耐藥節(jié)結(jié)化細(xì)胞分化家族(RND)、小多重耐藥性家族(SMR)、多種抗生素外排蛋白家族以及多藥核內(nèi)體轉(zhuǎn)運(yùn)家族(MET)。前5個(gè)家族存在于微生物中，而MET家族似乎僅限于高等真核生物。所有家族的代表成員都在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)。ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體是最大的超級(jí)家族，基于其序列及結(jié)構(gòu)的同源性，可將其分為A～G等7個(gè)亞家族。

轉(zhuǎn)運(yùn)底物識(shí)別的分子機(jī)制、動(dòng)力學(xué)、化學(xué)計(jì)量學(xué)以及反轉(zhuǎn)運(yùn)的特點(diǎn)是一直在持續(xù)進(jìn)行的研究領(lǐng)域。結(jié)構(gòu)研究表明，轉(zhuǎn)運(yùn)體可直接從周質(zhì)或者細(xì)胞質(zhì)膜的外部leaflet與底物結(jié)合。回顧一下，藥物轉(zhuǎn)運(yùn)過程包括幾個(gè)具體的關(guān)鍵步驟，即分子內(nèi)和分子間構(gòu)象變化以及分子間動(dòng)力學(xué)的相互作用；需要晶體學(xué)、分子建模、分子生物學(xué)、能量計(jì)算和生物功能調(diào)查等多方面學(xué)科的協(xié)同作用，才能理解藥物轉(zhuǎn)運(yùn)過程。由于一些藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白有協(xié)同作用或者能夠按順序發(fā)揮作用，使得這些作用情形顯得更加復(fù)雜。

由于RND以及ABC外排系統(tǒng)在反向轉(zhuǎn)運(yùn)以及能量依賴性外排方面存在機(jī)制差異，有關(guān)RND以及ABC外排系統(tǒng)中的藥物運(yùn)輸具有根本性的挑戰(zhàn)，即廣泛的特異性或稱多特異性。區(qū)分“單一”結(jié)合步驟以及在具有活性構(gòu)象的高親和力口袋中正確識(shí)別結(jié)合很困難，這種結(jié)合可有效地將藥物轉(zhuǎn)運(yùn)到外膜通道。包括分子對(duì)接計(jì)算在內(nèi)的結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)雖然提供了一些信息，但是沒有生物學(xué)支持，遠(yuǎn)遠(yuǎn)達(dá)不到模型開發(fā)的程度。能量來源是運(yùn)輸功能以及底物識(shí)別的關(guān)鍵因素，至少質(zhì)子反轉(zhuǎn)運(yùn)外排是一個(gè)PH依賴過程，這也是研究各種病原體的一個(gè)熱門領(lǐng)域。

為了克服外排作用對(duì)化學(xué)治療的阻礙，①改進(jìn)舊的抗生素分子設(shè)計(jì)以減少外排以此繞開外排系統(tǒng)。②通過直接修飾減少隔膜功能，或者減少外膜通道造成“交通阻塞”的通道阻滯劑的功效，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)藥物的高濃度貯存。③阻斷外排能力，通過競(jìng)爭(zhēng)或非競(jìng)爭(zhēng)抑制，反向轉(zhuǎn)運(yùn)位點(diǎn)的直接或間接的能量消耗，細(xì)菌細(xì)胞胞外被膜能量驅(qū)動(dòng)機(jī)制的瓦解。

通過對(duì)感染和腫瘤多種靶標(biāo)提供活性結(jié)構(gòu)骨架，天然產(chǎn)物在藥物發(fā)現(xiàn)中扮演了重要角色。運(yùn)用天然產(chǎn)物作為外排系統(tǒng)抑制這一戰(zhàn)略出現(xiàn)在近十年。全新的和已知的天然化學(xué)分子實(shí)體的活性涵蓋了幾乎所有的主要微生物外排系統(tǒng)，這些報(bào)道遍布化學(xué)領(lǐng)域和其它文獻(xiàn)。通過使用外排抑制劑恢復(fù)和提高抗菌素功用是吸引人的，但迄今為止還未進(jìn)入使用狀態(tài)。發(fā)現(xiàn)外排抑制劑的努力在多角度和深入展開，但很多概念和方法上的缺口依然阻礙著先導(dǎo)外排抑制劑進(jìn)入臨床運(yùn)用。本綜述重點(diǎn)對(duì)植物來源的外排泵抑制劑發(fā)現(xiàn)和確證的工具及其特點(diǎn)進(jìn)行了總結(jié)，同時(shí)大致描述了它們的進(jìn)一步發(fā)展和臨床應(yīng)用發(fā)展之路。

1 革蘭陽性菌中的多藥外排系統(tǒng)

與革蘭陽性菌耐藥性相關(guān)的主要外排系統(tǒng)為染色體編碼的MFS家族，包括NorA，NorB，NorC以及MdeA；MATE家族，如mepRAB(多藥外排蛋白)；SMR家族，如SepA。另外，也存在質(zhì)粒編碼體系，如QacA，QacB以及Tet(K)，這些體系具有四環(huán)素-二價(jià)金屬絡(luò)合物/H+反轉(zhuǎn)運(yùn)體功能。NorA同系物(EmeA)也已經(jīng)在糞腸球菌中得到驗(yàn)證。這些系統(tǒng)均具有廣泛的、重疊的底物特異性，具體包括喹諾酮，四環(huán)素，單價(jià)和二價(jià)抗微生物陽離子(插層染料，季銨化合物，聯(lián)脒，雙胍)和植物次生代謝物，見表1。

2 革蘭陰性菌中的多藥外排系統(tǒng)

多重耐藥(MDR)和泛耐藥(PDR)革蘭陰性菌使得感染真正無法治愈，對(duì)人類生命構(gòu)成了嚴(yán)重的威脅。外排系統(tǒng)是各種具有挑戰(zhàn)性的臨床感染的關(guān)鍵角色。耐藥-節(jié)結(jié)化細(xì)胞分化家族(RND)包括在大腸埃希菌中以AcrAB-TolC為主要成員的質(zhì)子驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)，它們?cè)诟ナ夏咎m弧菌(Francisella tularensis)、耶爾森菌(Yersinia pestis)和布魯桿菌(Brucella)屬中具有強(qiáng)同源性，AcrB是與外膜通道TolC和膜融合蛋白AcrA相關(guān)聯(lián)的多亞單位復(fù)合物。在銅綠假單胞菌中存在12種RND型外排系統(tǒng)，其中MexAB-OprM，MexCD-OprJ和MexXY-OprM已被證明對(duì)β-內(nèi)酰胺類和氟喹諾酮類有耐藥性(另外還有MexEF-oprN)。雖然已經(jīng)建立了與氨基糖苷類抗生素、抗菌肽和生物膜形成相關(guān)的耐藥外排劃分體系，但是這只是復(fù)雜的細(xì)胞反應(yīng)的一部分。最近分析了新增加的RND類型系統(tǒng)的特點(diǎn)，包括MexABC-OpmB和一種三氯生外排泵TriABCOpmH(MexABC-OpmB和TriABC-OpmH均為新增加的RND類型系統(tǒng))。銅綠假單胞菌中的mex-locci與3個(gè)關(guān)鍵病原體的同源系統(tǒng)具有系統(tǒng)發(fā)生相關(guān)性。

圖1 微生物外排系統(tǒng)中5個(gè)超級(jí)家族關(guān)鍵成員的示意圖

2.1 Bpe-外排系統(tǒng)

伯氏假單胞菌(Bulkhoderia pseudomallei)以及鼻疽伯克霍爾德菌(B.mallei)中的11個(gè)Bpe-外排系統(tǒng)。BpeAB-OprB是一種廣譜多藥外排系統(tǒng)，僅在低水平表達(dá)，只對(duì)多重耐藥有微弱的貢獻(xiàn)。相反，表達(dá)BpeEF-OprC的菌株對(duì)于大多數(shù)臨床有用的抗瘧疾抗生素具有高度抗藥性。

2.2 Bme-外排系統(tǒng)

存在于新洋蔥伯克霍爾德菌(B.cenocepacia)中的16種RND外排系統(tǒng)(Bcc復(fù)合物，RND-1至-16)以及脆弱擬桿菌中的Bme(ABC1-16)。至少有七種BmeB外排泵在轉(zhuǎn)運(yùn)抗微生物藥物方面起著重要作用，并且具有相互交疊的底物，另外至少有四種具有固有抗藥性。

2.3 Ade RND系統(tǒng)以及ABC外排系統(tǒng)

在鮑曼不動(dòng)桿菌中至少有5種Ade RND系統(tǒng)具有完全的功能特征，其中包括AdeIJK，AdeSR-adeABC，AdeDE和AdeFGH。

ABC外排系統(tǒng)已經(jīng)在多種情況下被證實(shí)，包括黏質(zhì)沙雷菌中的雜二聚體SmdAB和大腸埃希菌大環(huán)內(nèi)酯轉(zhuǎn)運(yùn)體MacAB，MacAB在尼日利亞淋病中也得到了驗(yàn)證。

一些具有外排能力的MFS存在于革蘭陰性菌，其中包括腸系膜沙門菌Typhimurium SmvA基因，(極其類似于金黃色葡萄球菌的QacA)，大腸埃希菌的EmrAB-TolC以及在大腸埃希菌和克雷伯菌[44]中涉及喹諾酮耐藥性的QepA和OqxAB質(zhì)粒，但MFS在腸桿菌科中分布廣泛。鮑曼不動(dòng)桿菌中的外排泵CraA與大腸埃希菌的MdfA同源，氯霉素和獲得性窄譜系統(tǒng)TetA，TetB，CmlA和FloR對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌中的CraA無效。AmvA調(diào)節(jié)著鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)抗菌和消毒作用的耐藥性。SMR和MATE家族的成員已經(jīng)在各種革蘭陰性菌中被檢測(cè)到。AbeM和AbeS已經(jīng)在鮑曼不動(dòng)桿菌中確定特征，不動(dòng)桿菌屬其它種的AdeXYZ，AdeDE和QacE也是如此，SugE在陰溝腸桿菌(Enterobacter cloacae)中具有抗菌素耐藥性，見表2。

3 分枝桿菌中的多藥外排系統(tǒng)

分枝桿菌復(fù)合物具有相當(dāng)多樣化的外排系統(tǒng)，它們是MFS或者ABC超級(jí)家族成員。相比于基因組大小，結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)被公認(rèn)為是具有最大的藥物外排泵數(shù)量的菌種之一。生物信息學(xué)以及直接和間接證據(jù)已經(jīng)確定了藥物外排與結(jié)核分枝桿菌固有耐藥性或者獲得耐藥性之間的關(guān)系。Tap是第一個(gè)鑒定出的MFS系統(tǒng)，Rv1258在結(jié)核分枝桿菌基因組的注釋序列中。已經(jīng)鑒定的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白與其他生物組織鑒定出的蛋白質(zhì)之間的基因組分析和同源檢索，揭示了屬于MFS的編碼公認(rèn)的藥物外排泵的16個(gè)開放閱讀框，包括序列Rv0849在內(nèi)至少三個(gè)被證明有藥物外排功能。這一列表正在擴(kuò)展，包括ABC超家族成員，如DrrAB、Bcg0231(牛分枝桿菌BCG)、Rv0194、Rv1218c、Rv1456c-Rv1457c-Rv1458c和SMR系統(tǒng)Rv3065，恥垢分枝桿菌中的LfrA，以及結(jié)核分枝桿菌的同源物Rv1145、Rv1146、Rv1877、Rv2846c(efpA)和在結(jié)核分枝桿菌和恥垢分枝桿菌中的Rv3065(mmr和emrE)。

表1 臨床常見革蘭陽性菌的外排系統(tǒng)

表2 臨床常見革蘭陰性菌和結(jié)核桿菌的外排系統(tǒng)

4 真菌中的多藥外排系統(tǒng)

真菌多藥外排系統(tǒng)得以最好研究的家族來自釀酒酵母，特別是那些多效藥耐藥(PDR)菌株。這個(gè)家族的成員是高度保守的，并且通常是致病真菌物種產(chǎn)生耐藥性的來源。雖然真菌細(xì)胞含有兩種類型系統(tǒng)的許多基因，一類為管家基因，一類為奢侈基因，但臨床唑類耐藥性通常與ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體的過度表達(dá)有關(guān)。臨床上重要的PDR轉(zhuǎn)運(yùn)體包括白念珠菌Cdr1p(CaCdr1p)和CaCdr2p，它們是釀酒酵母Pdr5p(ScPdr5p) 和哺乳動(dòng)物G型ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體的同系物。真菌PDR外排系統(tǒng)具有相對(duì)較雜的底物特異性，可能是由于其跨膜結(jié)構(gòu)域的底物特異性。通過分析白色念珠菌基因組鑒定了幾種屬于ABC超家族的外排泵(CDR1、CDR2、CDR3、CDR4、CDR5、SNQ2和YOR1)。表1和表2列舉了一些臨床常見的幾種菌的外排系統(tǒng)。

5 結(jié)語

由于抗生素的濫用，細(xì)菌對(duì)臨床所使用的幾乎所有抗生素產(chǎn)生了耐藥性，新的抗菌藥物的研發(fā)越來越具有挑戰(zhàn)性，因此，如何應(yīng)對(duì)耐藥菌感染是目前亟需解決的一大難題。研究表明，由外排泵介導(dǎo)的耐藥性較為普遍，且大部分外排泵在結(jié)構(gòu)上具有同源性，有助于發(fā)現(xiàn)對(duì)不同細(xì)菌的不同外排泵具有廣泛抑制作用的外排泵抑制劑。另外，細(xì)菌外排泵的種類繁多，作用機(jī)制復(fù)雜，因此需要對(duì)細(xì)菌外排泵的結(jié)構(gòu)以及作用機(jī)制等進(jìn)行深入研究，以克服細(xì)菌耐藥性，將外排泵抑制劑與抗生素聯(lián)用的策略提高抗生素的效用。