程歲寒，潘存鋒，張彥

(酵母功能湖北省重點實驗室，宜昌 443003)

1 前言

抗生素(antibiotics)又稱抗菌素，是由微生物(包括細菌、真菌、放線菌屬)或高等動植物在生活過程中所產(chǎn)生的具有抗病原體或其它活性的一類次級代謝產(chǎn)物，能干擾其他生物細胞發(fā)育功能的一種化學物質(zhì)[1]。抗生素具有抑菌或殺菌作用，在禽畜養(yǎng)殖業(yè)中起著預防、治療疾病，或促生長的作用，應用十分廣泛。目前，世界上已知用于動物飼料的抗生素，有四環(huán)素類、磺胺類、大環(huán)內(nèi)酯類、氨基糖苷類等，總數(shù)多達60多種[2]。然而這些抗生素，在禽畜體內(nèi)并不能完全吸收或轉(zhuǎn)化，大多直接以原形被排出[3-4]。有研究表明：隨禽畜糞便排出體外的抗生素約＞30%，從而進入水體、土壤等周圍環(huán)境中，成為重要的抗生素污染源[5]，而環(huán)境中的抗生素會通過食物鏈最終進入人體，或以畜禽肉類作食物，直接將殘留的抗生素轉(zhuǎn)移至人體內(nèi)，最終導致人體產(chǎn)生抗藥性，影響疾病治療與康復[6]。因此，抗生素的限量使用和殘留檢測越來越受各國政府和學者們關(guān)注。目前，抗生素殘留檢測方法主要有色譜法、毛細管電泳法、微生物檢測法、薄層層析法和免疫分析法等[7-9]，其中高效液相色譜(High-Performance LiquidChromatography，HPLC)是色譜法的一個分支，自上世紀60年代末逐步發(fā)展起來的一種分離分析技術(shù)，具備快速、高效、靈敏度高、自動化的特點，在抗生素的分析中應用廣泛。隨著色譜技術(shù)逐漸成熟，眾學者更是將HPLC技術(shù)與各種高性能檢測器聯(lián)用，以實現(xiàn)同時檢測多種抗生素或獲得更低的檢測限(LOD)。抗生素殘留時往往配有紫外檢測器(UV)、熒光檢測器(FLD)、二級陣列檢測器(DAD)以及質(zhì)譜或者串聯(lián)質(zhì)譜檢測器等。本文就高效液相色譜技術(shù)在獸用抗生素殘留檢測方面的研究進展進行綜述。

2 高效液相色譜-紫外檢測器

HPLC是目前在抗生素含量檢測中應用較為普遍的技術(shù)，2015年版《中國藥典》就有275種抗生素類藥物使用HPLC進行檢測，約占抗生素總收載數(shù)(493)的一半。根據(jù)抗生素藥品的種類不同來選擇流動相和紫外吸收波長，檢測器大部分都是UV檢測器[10]。抗生素的殘留分析所涉及的樣品復雜，檢測需求持續(xù)增加，對建立快速、高效的分離方法的要求越來越高。因而對HPLC的分離性能提出了更高的要求。由于色譜柱是HPLC分離的核心，新型或高性能的色譜填料(又稱為填充劑、固定相)的應用，為抗生素的檢測提供了更多的選擇。另一方面樣品前處理也是抗生素殘留分析的重要步驟，通過對樣品前處理的優(yōu)化可提高分析檢測的靈敏性，特異性和準確度?？股貧埩魴z測時多使用液液萃取，固相萃取方法，固相微萃取等方法對樣品進行除雜凈化，因待檢測樣品和待測目標物的性質(zhì)不同往往需要選用不同的前處理方法，如氨基糖苷類抗生素多數(shù)采用固相萃取法[11]。張志強等[12]在檢測土壤和有機肥中3種四環(huán)素類抗生素殘留時采用BondElut-SAX固相萃取小柱對樣品進行提取凈化，提取效率達到52%～95%，使用AgilentZORBAX SB C18的15cm短柱進行分析，大大縮短分析時間。徐少華[13]在檢測雞肉樣品時利用親水親脂平衡柱(HLB柱)和羧酸根陽離子交換柱兩種固相萃取小柱對樣品進行固相萃取，發(fā)現(xiàn)提取、凈化的效果較好，并使用Agilent SB C18色譜柱、紫外檢測器同時對6種四環(huán)素殘留進行分析，具有良好的精密度和準確度。對于抗生素的分離，色譜柱一般都選用C18反相色譜柱，對于分離效果不好的可選擇其他填充物的色譜柱。蔡玉娥等[14]在分析尿液和牛奶中頭孢類抗生素時，使用碳鏈較短的并嵌有的極性較大的磺酰胺基團的新型親水性較強的C16硅膠色譜柱(4.6mm×150mm, 5μm)進行分離，紫外/可見光(UV/VIS) 檢測器進行分析，檢測限達5.60μg/L，回收率高。周殿芳等[15]等在檢測魚用飼料中8種常用磺胺類藥物時，使用超高效液相色譜檢測法(UPLC)，飼料經(jīng)2%乙酸浸潤，4℃預冷的乙腈提取，堿性氧化鋁柱凈化，用SymmetryC18色譜柱(5μm，4.6mm×150mm)進行分離，Symmetry C18柱采用waters的極性官能團嵌入技術(shù)，阻止了堿性化合物與硅膠表面殘留硅羥基間的作用，對堿性化合物具有更短的保留時間，2%乙酸-甲醇梯度洗脫，紫外檢測，8種磺胺類藥物的平均回收率范圍為70%～100%，該法簡單、準確，可用于魚用飼料中磺胺類藥物殘留的監(jiān)測。

3 高效液相熒光檢測器

高效液相色譜法-熒光檢測器(HPLC-FLD )具有較高的靈敏度，具有熒光特性的抗生素可直接用HPLC-FLD檢測。對于不具有熒光性或者熒光性差的抗生素，也可通過衍生化提高目標物的熒光性后進行檢測[7]。如《GB29692-2013食品安全國家標準牛奶中喹諾酮類藥物多殘留的測定高效液相色譜法》中采用液相-熒光檢測器檢測牛奶中喹諾酮類藥物殘留[16]。吳海燕等[17]在檢測水產(chǎn)品中鯉魚、鰻鱺、對蝦和海參中四環(huán)素、土霉素、金霉素和鹽酸多西環(huán)素殘留時同樣使用HPLC-FLD法，樣品溶液經(jīng)HLB固相萃取柱進行除雜凈化，再經(jīng)C18反相色譜柱分離后用熒光檢測器測定，方法定量限為達20μg/Kg，4種抗生素的回收率均在70.5%～100%。錢疆[18]建立了HPLC-FLD法檢測乳制品中的9種氨基糖苷類抗生素殘留的方法，樣品用10%三氯乙酸提取，采用MCX固相萃取小柱凈化，C18色譜分離，柱后用次氯酸鈉溶液氧化，鄰苯二醛(OPA)衍生，熒光檢測。9種氨基糖苷類藥物加標回收率在69.8%～110.2%之間。Irina等[19]用二氯甲烷和丙烯酸作萃取溶劑進行液-液萃取對樣品進行提取純化，并用液相色譜熒光檢測器(HPLC-FLD)對雞肉樣品中氧氟沙星(OFLX)的含量進行測定，該方法簡單易行有效。磺胺類化合(sulfanilamides)不具有熒光特性，常采用HPLC柱前或注后化學衍生法[20-23]。Huertas-Pérez等[24]用HPLCFLD法測定雞肌肉和蛋類中8種磺胺類抗生素的含量時，將光化學反應器與色譜柱連接，磺胺類藥物經(jīng)紫外輻射發(fā)生光化學衍生反應，可增加熒光強度。該法回收率為65.9%～88.1%，靈敏度高，符合歐洲現(xiàn)行要求。許旭等[25]同樣采用改良QuEChERS-高效液相色譜-光化學在線衍生熒光檢測方法，對豬肉中18種磺胺類藥物殘留進行檢測，該法前處理快速簡便，選擇性強。Du等[26]采用固相萃取結(jié)合高效液相色譜和熒光技術(shù)測定環(huán)境水樣中的土霉素、四環(huán)素、強力霉素和氯四環(huán)素，檢測限為51pg/mL～137pg/mL，回收率為78.1%～119.3%。

4 高效液相蒸發(fā)光檢測器

蒸發(fā)光散射檢測器(evaporative light-scattering detector，ELSD)是近年來發(fā)展的新型準質(zhì)量型檢測器，其響應不依賴于樣品的光學性質(zhì)，僅與樣品的質(zhì)量有關(guān)[27]。氨基糖苷類抗生素由氨基糖分子和非糖部分的苷元結(jié)合而成，種類結(jié)構(gòu)類似，極性強，多易溶于水，水溶液中以多聚離子形式存在，性質(zhì)穩(wěn)定，多無發(fā)光團，沒有特征的紫外吸收，難以選用紫外檢測器檢測，在2015版《中國藥典》中，氨基糖苷類抗生素品種多采用蒸發(fā)光散射檢測器測定含量、有關(guān)物質(zhì)或組分，氨基糖苷類抗生素檢測時，親水性色譜條件檢測效果更好，檢測限更低。江勇等[28]將高效液相色譜儀與ELSD檢測器聯(lián)用，用C18柱實現(xiàn)了肉產(chǎn)品中3種四環(huán)素類抗生素和己烯雌酚的同時檢測。Song等[29]建立了動物飼料中8種多肽類抗生素蒸發(fā)光散射檢測器液相(HPLC-ELSD)檢測法，樣品經(jīng)甲醇-2%甲酸溶液提取HLB固相萃取柱除雜，Phenomenex Kinetex苯基短柱(50mm×4.6mm,5μm)上分離出目標化合物，蒸發(fā)光檢測器檢測，回收率在72.0%～105.4%，成功地應用了該方法分析飼料中的多肽類抗生素。

5 高效液相-質(zhì)譜檢測器

在與HPLC 聯(lián)用的各種檢測器中，串聯(lián)質(zhì)譜(MS/MS)具有高靈敏度和高選擇性的特點，抗干擾能力強，能夠檢測痕量藥物殘留，且可以實現(xiàn)多種化合物同時檢測，在抗生素殘留檢測方面得到了廣泛的應用[30]。李曉晶[31]等在檢測土壤中獸用抗生素喹諾酮類、大環(huán)內(nèi)酯類、林可霉素時，將超高效液相色譜與串聯(lián)質(zhì)譜進行聯(lián)用(UPLC-MS/MS)，將分析時間縮短在7min內(nèi)，實現(xiàn)了土壤樣品中不同種類抗生素的快速、準確、靈敏的檢測。國明[32]在檢測環(huán)境水樣時，在水樣中，加入磁性材料進行固相萃取，然后用pH11的氨水水溶液洗脫后，經(jīng)ZORBAX Eclipse PlusC18柱分離，用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜在多反應監(jiān)測(MRM)模式下同時進行檢測6種四環(huán)素類抗生素，該方法靈敏度高、背景干擾低。Qin[33]開發(fā)了一種液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)方法檢測動物樣本中磺胺類、替米考星和阿維菌素殘留量的方法，該方法使用超聲輔助提取，正己烷除脂，和快速濾過凈化柱除雜，C18色譜柱分離，經(jīng)LC-MS/MS分析。所有抗生素的回收率在82%到107%之間。該方法成功地用于分析當?shù)厥袌龅膭游飿颖镜墨F藥殘留。Chiesa[34]開發(fā)了一種HPLC-MS/MS方法，對42頭豬的尿液和肉中殘留的29種抗生素進行分析，發(fā)現(xiàn)尿液中抗生素檢出頻率與濃度要高于肌肉。李曉東等[35]建立了一種同時測定畜禽肉中18 種喹諾酮類獸藥殘留的方法，方法使用QuEChERS分散固相萃取試劑盒去除樣品中極性有機酸、某些糖類、脂類等干擾雜質(zhì)，采用C18色譜柱(100mm×2.1mm,1.7μm)分離，以0.2%甲酸水溶液和0.2%甲酸乙腈溶液作為流動相進行梯度洗脫，UPLC-MS/MS多反應監(jiān)測(MRM)模式下進行檢測，18種喹諾酮類獸藥的平均回收率在60.5%～97.0%。C18反相色譜柱在抗生素殘留檢測時較為常用，但對于某些樣品，苯基柱、T3柱等其他反相色譜柱也是較好的選擇。陳瑞春等[36]在檢測牛奶和奶粉中9種青霉素類藥物殘留量時，樣品經(jīng)HLB固相萃取柱凈化后，使用Thermo公司苯基柱分離，用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測，通過多反應監(jiān)測(MRM)模式下進行地定性定量分析，具有更好的分離效果和準確度。呂佳等[37]建立飲用水中35種抗生素類藥物的UPLC-MS-MS測定方法，采用HLB固相萃取柱對水樣進行除雜，對抗生素進行富集，選擇Acquity UPLC HSS T3色譜柱(2.1mm×100mm, 1.8μm)進行分離，質(zhì)譜采用正離子掃描多反應監(jiān)測(MRM)模式，結(jié)論該方法操作簡單、快速，準確度和精密度均較高，適用于飲用水中35種抗生素的同時檢測。BassSofia建立了一種同時測定歐洲鱸魚中20種獸藥殘留的超高液相-四級桿飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-Q-TOF-MS)方法。樣品經(jīng)UPLCC18(50mm×2.1mm，1.7μm)分離，10min完成檢測，抗生素回收率在93.8%到107.5%，檢測限和定量限分別為2.22g/kg～15.00g/kg，6.67g/kg～45.46g/kg[38]。

6 小結(jié)

抗生素殘留是影響動物性食品安全的重要因素之一，威脅著人們的生命安全，將高效液相色譜法應用于獸用抗生素殘留的分析，可以較為精確地檢測出水、土壤、各種畜禽以及畜禽衍生出來的食品中的抗生素種類和含量，對于環(huán)境中抗生素的遷移以及食品安全性評判發(fā)揮了巨大作用。從上述內(nèi)容來看HPLC-UV、HPLC-FLD、HPLC-ELSD雖然是相對簡單和便宜的選擇，但他們的靈敏度略差于HPLC-MS/MS。而HPLC-MS/MS和UPLC-MS/MS雖然具有快速同時鑒別和檢測各種試樣中的抗多種生素種類和含量，具有更高的精密度和準確度，但是儀器成本高，對試劑和操作人員要求極高，因此很難用于大批量的檢測，在多數(shù)基層食品安全檢測部門使用仍然較難。在未來，抗生素殘留檢測更迫切地需要樣品前處理簡便、檢出限低、選擇性高、分析自動化程度高、周期短，以及高通量、多殘留的樣品分析方法。