王勤志，徐立軍，李名武，周 聰

(鄂東醫(yī)療集團市中心醫(yī)院創(chuàng)傷外科，湖北 黃石 435000)

骨肉瘤(osteosarcoma，OS)作為常見的骨科惡性腫瘤，好發(fā)于20歲以下人群，由于該腫瘤惡性程度高，侵襲能力強，多數(shù)患者臨床確診時已出現(xiàn)局部或遠處轉(zhuǎn)移[1]。隨著診療手段的提高，OS患者5 a生存率顯著提高[2]，但易發(fā)生復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移，仍有較高的致死、致殘率[3]。OS發(fā)生機制較為復(fù)雜，目前尚未完全清楚。因此，積極探討OS相關(guān)發(fā)生機制對早期預(yù)防及臨床治療具有重要意義。磷脂酰肌醇3-激酶(phosphoinositide 3-kinase，PI3K)信號通路與細胞增殖、分化、生長、凋亡等過程密切相關(guān)，在多種惡性腫瘤的發(fā)生及進展過程中發(fā)揮關(guān)鍵性作用[4-5]，磷脂酰肌醇3-激酶催化亞基α(phosphatidylinositol 3-kinase catalytic subunit alpha，PIK3CA)作為PI3K基因的P110α催化亞單位，是調(diào)控PI3K活化的重要基因，其異常表達可導(dǎo)致PI3K活化異常，與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切[6]。本研究利用小分子干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)技術(shù)下調(diào)人OS Saos-2細胞中PIK3CA基因表達，觀察其對Saos-2細胞生物學行為的影響。

1 材料與方法

1.1細胞、試劑和儀器人OS Saos-2細胞購自美國ATCC公司，RPMI-1640培養(yǎng)基、體積分數(shù)10%胎牛血清均購自美國Gibico公司，TRIzol總RNA提取試劑盒、細胞裂解液、LipofectamineTM2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑均購自美國Invitrogen公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒和聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)試劑盒均購自日本TaKaRa公司，PIK3CA和內(nèi)參引物均由上海生工生物公司設(shè)計合成，siRNA-PIK3CA、siRNA對照序列均由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司設(shè)計合成，四甲基偶氮唑鹽(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)細胞增殖試劑盒購自上海哈靈生物試劑檢測中心，膜聯(lián)蛋白A5-異硫氰酸熒光素(annexin A5-fluorescein isothiocyanate，Annexin V-FITC)標記/碘化丙啶(propidium iodide，PI)細胞凋亡檢測試劑盒、流式細胞儀購自美國BD公司，Transwell小室購自美國Corning Costar公司，鼠抗人PIK3CA單克隆抗體購自臺灣Abnova公司，鼠抗人PI3K 單克隆抗體、兔抗大鼠磷酸化-mTOR(phosphorylation-mTOR，p-mTOR)多克隆抗體購自美國Abcam公司，兔抗鼠磷酸化-PI3K(phosphorylation-PI3K，p-PI3K)多克隆抗體購自美國Santa Cruz公司，兔抗鼠蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)、磷酸化-Akt(phosphorylation-Akt，p-Akt)、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin protein，mTOR)多克隆抗體均購自美國CST公司；酶標儀購自奧地利DIALAB公司，凝膠電泳系統(tǒng)購自美國Bio-Rad公司。

1.2實驗方法

1.2.1細胞培養(yǎng)及分組處理將細胞置于含體積分數(shù)10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，于含體積分數(shù)5%CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞生長至約80%融合時，胰蛋白酶消化后傳代培養(yǎng)，取傳 3～6代細胞進行實驗。取對數(shù)生長期細胞，計數(shù)后接種于96孔板，隨機將細胞分為siRNA-PIK3CA組、siRNA對照組和空白對照組。siRNA-PIK3CA組細胞轉(zhuǎn)染siRNA-PIK3CA序列，正義鏈為5′-GGCUAAAGAAAGCCUUUAUTT-3′，反義鏈為5′-AUAAAGGCUUUCUUUAGCCTT-3′；siRNA對照組細胞轉(zhuǎn)染siRNA對照序列，正義鏈為5′-UUGAUAACTUGAACAGAUAAT-3′，反義鏈為5′-CAUUUGUUCACGCUAUCAGTT-3′；空白對照組細胞不作任何處理。各組細胞轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h完成后續(xù)實驗。

1.2.2實時熒光定量PCR檢測PIK3CAmRNA表達取各組轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h細胞，胰蛋白酶消化后加入細胞裂解液，提取細胞中總RNA，紫外分光光度法檢測總RNA純度。利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄為模板單鏈cDNA，以cDNA為模板，每組設(shè)3個平行復(fù)孔進行PCR，操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。PIK3CA上游引物序列為5′-CTCGAG-AAAGATAACTGAGAAAATGAAAGCTC-3′，下游引物序列為5′-TCTAGACCTTCTCCATCATTTCTATATA-TTTTGG-3′；甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)上游引物序列為5′-GTGGACCTGACCT-GCCGTCT-3′，下游引物序列為5′-GGAGGAGTGG-GTGTCGCTGT-3′。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 1 min，92 ℃ 30 s，92 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，75 ℃ 30 s，重復(fù)循環(huán)36次。采用2-△△Ct法計算各組細胞中PIK3CA mRNA相對表達量[7]。

1.2.3MTT法檢測細胞增殖能力取各組轉(zhuǎn)染細胞，胰蛋白酶消化后接種于96孔板，調(diào)整細胞密度為每孔2×103個，分別于培養(yǎng)24、48、72、96 h時，將MTT液加入各孔，繼續(xù)培養(yǎng)4 h；取出培養(yǎng)板，棄培養(yǎng)液，加入二甲基亞砜，震蕩15 min，使用酶標儀在450 nm波長處對各孔吸光度值進行檢測，以吸光度值表示細胞增殖能力，吸光度值越大，細胞增殖能力越強。每孔各測3次，取均值[8]。

1.2.4流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡取各組轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h細胞，胰蛋白酶消化，800 r·min-1離心 5 min，磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)洗滌3次，用100 μL結(jié)合緩沖液重懸細胞，調(diào)整細胞密度為1×109L-1，加入5 μL Annexin V-FITC，再加入5 μL PI，搖勻后避光放置15 min，加入400 μL結(jié)合緩沖液，于60 min內(nèi)上機進行檢測。

1.2.5Transwell法檢測細胞遷移能力取各組轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h細胞沉淀，使用無血清培養(yǎng)基制成單細胞懸液，調(diào)整細胞密度為1×109L-1；取細胞懸液200 μL加入Transwell小室上室，將含體積分數(shù)10%胎牛血清的培養(yǎng)基加入小室下室，于含體積分數(shù)5% CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；取出小室，PBS洗滌3次，用棉簽將小室上室細胞小心擦去，體積分數(shù)95%乙醇固定15 min，結(jié)晶紫染色，倒置顯微鏡下觀察，隨機選取10個視野，計數(shù)穿膜細胞數(shù)。實驗重復(fù)3次，取均值[9-10]。

1.2.6Transwell法檢測細胞侵襲能力將Matrigel膠預(yù)先鋪于Transwell小室內(nèi)，其余操作步驟同“1.2.5”項。

1.2.7Westernblot法檢測PIK3CA、PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、mTOR和p-mTOR蛋白表達取各組轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h細胞，胰蛋白酶消化，細胞裂解液裂解，使用總蛋白提取試劑盒提取細胞中總蛋白，使用二喹啉甲酸蛋白濃度檢測試劑盒檢測總蛋白濃度。取30 μg總蛋白，進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，電轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯PVDF膜上，脫脂奶粉封閉2 h，加入一抗鼠抗人PIK3CA、PI3K單克隆抗體、兔抗鼠p-PI3K、Akt、p-Akt、mTOR多克隆抗體和兔抗大鼠p-mTOR多克隆抗體(稀釋比例分別為1300、1800、1500、11 000、12 000、1500、11 000)，4 ℃孵育過夜，含體積分數(shù)0.1%吐溫-20的Tris緩沖生理鹽水(Tris-buffered saline and 0.1% Tween-20，TBST)洗滌3次，加入電化學發(fā)光顯色液顯色，曝光、拍照，利用Image J圖像分析軟件進行分析，獲得各轉(zhuǎn)染組細胞中PIK3CA、PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、mTOR和p-mTOR蛋白相對表達量[11-12]。

2 結(jié)果

2.13組細胞中PIK3CAmRNA和蛋白相對表達量比較結(jié)果見表1、圖1和圖2。siRNA-PIK3CA組細胞中PIK3CA mRNA和蛋白相對表達量均低于siRNA對照組和空白對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；siRNA對照組與空白對照組細胞中PIK3CA mRNA和蛋白相對表達量比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

表13組細胞中PIK3CAmRNA和蛋白相對表達量比較

組別PIK3CA mRNAPIK3CA蛋白空白對照組1.85±0.180.67±0.13siRNA對照組1.82±0.170.65±0.11siRNA-PIK3CA組1.27±0.15ab0.31±0.09abF24.44446.301P0.0000.000

注：與空白對照組比較aP<0.05；與siRNA對照組比較bP<0.05。

1：siRNA-PIK3CA組；2：siRNA對照組；3：空白對照組。

圖13組細胞中PIK3CAmRNA表達

Fig.1ExpressionofPIK3CAmRNAincellsofthethreegroups

1：siRNA-PIK3CA組；2：siRNA對照組；3：空白對照組。

圖23組細胞中PIK3CA蛋白表達(Westernblot)

Fig.2ExpressionofPIK3CAproteinincellsofthethreegroups(Westernblot)

2.23組細胞增殖能力比較結(jié)果見表2。siRNA-PIK3CA組細胞轉(zhuǎn)染后24、48、72、96 h時吸光度值均低于siRNA對照組和空白對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；siRNA對照組與空白對照組細胞轉(zhuǎn)染后24、48、72、96 h時吸光度值比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

表23組細胞增殖能力比較

組別細胞增殖能力(吸光度值)24 h48 h72 h96 h空白對照組0.33±0.070.36±0.050.45±0.040.75±0.05siRNA對照組0.31±0.080.41±0.030.55±0.050.73±0.14siRNA-PIK3CA組0.19±0.06ab0.25±0.06ab0.35±0.04ab0.53±0.08abF6.38825.46027.7009.146P0.0100.0000.0000.003

注：與空白對照組比較aP<0.05；與siRNA對照組比較bP<0.05。

2.33組細胞凋亡率比較結(jié)果見圖3。siRNA-PIK3CA組、siRNA對照組和空白對照組細胞凋亡率分別為(16.3±4.8)%、(6.9±2.1)%和(7.2±2.4)%，siRNA-PIK3CA組細胞凋亡率高于siRNA對照組和空白對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；siRNA對照組與空白對照組細胞凋亡率比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

A：siRNA-PIK3CA組；B：siRNA對照組；C：空白對照組。

圖3流式細胞術(shù)檢測3組細胞凋亡情況

Fig.3Cellapoptosisdetectedbyflowcytometryinthethreegroups

2.43組細胞遷移和侵襲能力比較結(jié)果見表3和圖4。siRNA-PIK3CA組遷移細胞數(shù)和侵襲細胞數(shù)均少于siRNA對照組和空白對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；siRNA對照組與空白對照組遷移細胞數(shù)和侵襲細胞數(shù)比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.53組細胞中PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、mTOR和p-mTOR蛋白相對表達量比較結(jié)果見表4和圖5。siRNA-PIK3CA組細胞中PI3K、Akt、mTOR蛋白相對表達量均高于siRNA對照組和空白對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而p-PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白相對表達量均低于siRNA對照組和空白對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；siRNA對照組與空白對照組細胞中PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、mTOR和p-mTOR蛋白相對表達量比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

表33組遷移細胞數(shù)和侵襲細胞數(shù)比較

組別遷移細胞數(shù)侵襲細胞數(shù)空白對照組110.4±8.3123.4±7.5siRNA對照組107.6±7.8127.6±8.1siRNA-PIK3CA組76.8±5.9ab45.2±6.2abF19.41785.380P0.0000.000

注：與空白對照組比較aP<0.05；與siRNA對照組比較bP<0.05。

A、A1：siRNA-PIK3CA組；B、B1：siRNA對照組；C、C1：空白對照組。

圖43組細胞遷移和侵襲能力(結(jié)晶紫染色，×200)

Fig.4Cellmigrationandinvasionabilityinthethreegroups(crystalvioletstaining，×200)

表43組細胞中PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、mTOR和p-mTOR蛋白相對表達量比較

組別PI3K蛋白p-PI3K蛋白Akt蛋白p-Akt蛋白mTOR蛋白p-mTOR蛋白空白對照組0.57±0.090.70±0.090.45±0.080.63±0.110.51±0.040.89±0.14siRNA對照組0.58±0.100.72±0.110.46±0.100.61±0.090.52±0.050.87±0.12siRNA-PIK3CA組0.78±0.07ab0.32±0.08ab0.69±0.11ab0.28±0.07ab0.72±0.06ab0.41±0.08abF28.24440.55414.37746.15248.41512.530P0.0000.0000.0000.0000.0000.000

注：與空白對照組比較aP<0.05；與siRNA對照組比較bP<0.05。

1：siRNA-PIK3CA組；2：siRNA對照組；3：空白對照組。

圖53組細胞中PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、mTOR和p-mTOR蛋白表達(Westernblot)

Fig.5ExpressionsofPI3K，p-PI3K，Akt，p-Akt，mTORandp-mTORproteinincellsofthethreegroups(Westernblot)

3 討論

OS作為預(yù)后較差的惡性腫瘤，早期轉(zhuǎn)移及術(shù)后復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致患者死亡的主要因素[13]。PI3K作為生長因子受體超家族信號通路中的關(guān)鍵性調(diào)控因子，不僅在細胞生長、分化、凋亡、遷移等正常生理功能中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用，而且在腫瘤細胞異常增殖、凋亡、遷移、侵襲及耐藥、放射治療耐受等過程中也發(fā)揮重要作用[14]，PIK3CA作為調(diào)控PI3K活性的p110α催化亞基的編碼基因，可通過異常高表達或基因突變而異?；罨疨I3K信號通路[15]，在乳腺癌[16]、胃癌[17]、膠質(zhì)瘤[18]等多種惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。本研究利用siRNA技術(shù)特異性將人OS Saos-2細胞中PIK3CA基因沉默，結(jié)果顯示，siRNA-PIK3CA組細胞中PIK3CA mRNA和蛋白相對表達量均低于siRNA對照組和空白對照組，說明Saos-2細胞中PIK3CA基因被特異性沉默。

本研究結(jié)果顯示，siRNA-PIK3CA組細胞轉(zhuǎn)染后24、48、72、96 h時吸光度值均低于siRNA對照組和空白對照組，說明特異性抑制PIK3CA基因表達可顯著抑制Saos-2細胞增殖能力，提示PIK3CA基因與Saos-2細胞增殖能力密切相關(guān)。siRNA-PIK3CA組細胞凋亡率高于siRNA對照組和空白對照組，說明特異性沉默PIK3CA基因表達可促進Saos-2細胞凋亡。siRNA-PIK3CA組遷移細胞數(shù)和侵襲細胞數(shù)均少于siRNA對照組和空白對照組，說明特異性沉默PIK3CA基因表達可抑制Saos-2細胞遷移和侵襲能力。這些結(jié)果說明了PIK3CA基因異常表達與Saos-2細胞異常增殖、凋亡、遷移及侵襲密切相關(guān)，可能在OS發(fā)生及進展中發(fā)揮重要作用。有研究指出，PI3K/Akt/mTOR信號通路作為機體內(nèi)重要的信號通路，在調(diào)控細胞增殖、生長、代謝、凋亡等過程中發(fā)揮重要作用[19-20]。本研究結(jié)果顯示，siRNA-PIK3CA組細胞中PI3K、Akt、mTOR蛋白相對表達量均高于siRNA對照組和空白對照組，而p-PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白相對表達量均低于siRNA對照組和空白對照組，說明特異性沉默PIK3CA基因可能通過抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路而減少細胞增殖、遷移、侵襲，增加細胞凋亡發(fā)生。

綜上所述，下調(diào)PIK3CA基因可減少人OS細胞增殖，抑制細胞遷移及侵襲能力，增加細胞凋亡，其機制可能與抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路有關(guān)。