徐瑞金 秦 苗 高俊杰 葛云潔

(青島市市立醫(yī)院干部保健一科，青島266071)

冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病(冠心病)是目前發(fā)達(dá)國(guó)家首位致死性病因。我國(guó)隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和人們生活方式的改變，冠心病的發(fā)病率和死亡率也逐年升高，已成為嚴(yán)重的社會(huì)公共衛(wèi)生問(wèn)題。micro RNA是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一類內(nèi)源性單鏈非編碼RNA，其通過(guò)調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)，廣泛參與機(jī)體細(xì)胞的分化、增殖、凋亡等生理病理過(guò)程。mir-142-5p作為mir-142家族的一員，最早發(fā)現(xiàn)其與系統(tǒng)性紅斑狼瘡、肺癌、胃黏膜相關(guān)淋巴組織瘤等多種疾病的發(fā)病相關(guān)[1-3]，近年來(lái)有研究報(bào)道，冠心病患者循環(huán)中mir-142-5p也明顯升高[4]，提示其可能和冠脈病變有著密切關(guān)系。前期我們通過(guò)miRanda靶基因預(yù)測(cè)軟件(www.microrna.org/microrna/home.do)預(yù)測(cè)mir-142-5p可能的靶基因?yàn)橐葝u素樣生長(zhǎng)因子1受體(Insulin-like growth factor 1 receptor，IGF-1R)基因。本文通過(guò)對(duì)冠心病患者血漿mir-142-5p濃度的測(cè)定，分析其與冠脈病變程度之間的關(guān)系，并進(jìn)一步研究其對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞IGF-1R表達(dá)的影響，探討mir-142-5p對(duì)冠狀動(dòng)脈粥樣硬化的影響及作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1資料

1.1.1研究對(duì)象 所有研究對(duì)象均為相互間無(wú)血緣關(guān)系的青島地區(qū)漢族居民，分為健康對(duì)照組(N)和冠心病組(CHD)。其中冠心病組42例，為2016年2月至2017年5月在青島市市立醫(yī)院心內(nèi)科住院患者，所有患者均經(jīng)冠狀動(dòng)脈造影檢查，且至少有1只主要冠脈血管狹窄>50%；對(duì)照組45例，均為健康志愿者，排除心血管、肝、腎和代謝性疾病。所有參加本研究者均簽署知情同意書。健康對(duì)照組年齡(51.54±16.51歲)和冠心病組年齡(52.21±14.31歲)差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.15,P>0.05)；健康對(duì)照組性別(男25例，女20例)和冠心病組(男23例，女19例)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.12,P>0.05)，提示兩組間具有可比性。本試驗(yàn)符合1983年頒布的赫爾辛基宣言，獲青島市市立醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.1.2人血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng) 人血管內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞株均購(gòu)自美國(guó)ATCC公司。細(xì)胞復(fù)蘇后傳代至3～5代備用。

1.2方法

1.2.1冠心病組均進(jìn)行冠脈造影檢查，采用Gensini評(píng)分系統(tǒng)進(jìn)行評(píng)分[1]：狹窄程度≤25%計(jì)1分，26%～50%計(jì)2分，51%～75%計(jì)4分，76%～90%計(jì)8分，91%～99%計(jì)16分，100%計(jì)32分。根據(jù)不同冠狀動(dòng)脈分支將以上得分乘以相應(yīng)系數(shù)，左主干病變：得分×5；左前降支病變：近段×2.5，中段×1.5，遠(yuǎn)段×1；左回旋支病變：近段×2.5，中段×1，遠(yuǎn)段×1；右冠狀動(dòng)脈病變：近、中、遠(yuǎn)段均×1；其他分支病變：得分×0.5。各病變支數(shù)得分總和即為該患者的冠狀動(dòng)脈狹窄嚴(yán)重程度評(píng)分。

1.2.2標(biāo)本采集 所有入選者過(guò)夜禁食12 h，次晨空腹抽取4 ml外周靜脈血EDTA-Na抗凝，離心后分離血漿，應(yīng)用美國(guó)MRC Gene公司TRI Reagent BD試劑盒，提取血漿總RNA，應(yīng)用NanoVue超微量分光光度計(jì)檢測(cè)A260/A280吸收率為1.8～2.1的標(biāo)本為合格樣本，置-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PCR)檢測(cè)血漿中mir-142-5p 應(yīng)用Quantscript RT cDNA第一鏈合成試劑盒(TIANGEN，中國(guó))將血漿總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA備用。每個(gè)樣品均取3個(gè)重復(fù)，選擇U6作為內(nèi)參，應(yīng)用miScript SYBR Green PCR Kit試劑盒檢測(cè)血漿mir-142-5p和U6。mir-142-5p上游引物：5′-CGCGCGCATAAAGTAGAAAGCAC-3′，下游引物：5′-CCAGTGCAGGGTCCGAGGTA-3′。U6上游引物：5′-GCAAGGATGACACGCAAAT-3′，下游引物5′-ATGGAACGCTTCACGAAT-3′。實(shí)時(shí)熒光定量PCR總反應(yīng)體系20 μl，包括2.5×Realmastermix 9 μl，cDNA模板2 μl，上下游引物(10 μmol/L)各0.5 μl，以滅菌雙蒸水補(bǔ)足至20 μl。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性2 min，95℃變性20 s，60℃退火30 s，68℃延伸40 s，共循環(huán)40次。

1.2.4mir-142-5p對(duì)人血管內(nèi)皮細(xì)胞IGF-1R表達(dá)及NO釋放的影響 人血管內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞株購(gòu)自美國(guó)ACTT公司，使用80%DMEM高糖培養(yǎng)基+20%胎牛血清傳代培養(yǎng)。為研究IGF-1R在內(nèi)皮細(xì)胞模擬動(dòng)脈粥樣硬化環(huán)境中表達(dá)情況，我們將細(xì)胞分為兩大組：對(duì)照組和轉(zhuǎn)染組。對(duì)照組分為正常對(duì)照組(C)和ox-LDL處理組(C+ox-LDL)兩個(gè)亞組，其中C+ox-LDL在試驗(yàn)前應(yīng)用50 mg/ml的ox-LDL刺激24 h；轉(zhuǎn)染組在試驗(yàn)前均應(yīng)用50 mg/ml的ox-LDL刺激24 h，并分為三個(gè)亞組：mir-142-5p minics(應(yīng)用mir-142-5p minics進(jìn)行轉(zhuǎn)染)、mir-142-5p inhibitor組(應(yīng)用mir-142-5p小干擾RNA進(jìn)行轉(zhuǎn)染)和CN組(應(yīng)用陰性對(duì)照進(jìn)行轉(zhuǎn)染),其中mir-142-5p minics、小干擾RNA和陰性對(duì)照均由上海吉瑪公司構(gòu)建生產(chǎn)。轉(zhuǎn)染過(guò)程嚴(yán)格按照LipofectamineTM2000說(shuō)明書進(jìn)行。孵育48 h后，應(yīng)用Western blot法(試劑盒由上海生工生物工程公司提供)檢測(cè)各組IGF-1R蛋白表達(dá)情況，采用EPSON掃描儀掃描膠片并用Photoshop 軟件測(cè)定灰度值。應(yīng)用Trizol試劑盒提取各組細(xì)胞總RNA，應(yīng)用RT-PCR檢測(cè)IGF-1R mRNA的相對(duì)表達(dá)量：選擇β-actin作為內(nèi)參， IGF-1R上游引物：5′-GGAGGCTGAATACCG-3′，下游引物：5′-AAAGACGAAGTTGGAGGCGCT-3′。β-actin上游引物：5′-TCCTCCCTGCTGCTCCGATTCCG-3′，下游引物5′-TGATCTCCTTCTGCATCCTG-3′。RT-PCR具體操作步驟及實(shí)驗(yàn)條件同1.2.3。分離細(xì)胞培養(yǎng)上清液，通過(guò)測(cè)定上清液中NO3-的濃度間接反映NO的濃度(采用硝酸鹽還原酶法，試劑盒由南京建成生物工程研究所提供)。

2 結(jié)果

2.1血漿mir-142-5p測(cè)定 本實(shí)驗(yàn)重復(fù)樣品擴(kuò)增曲線重疊性好，溶解曲線呈單峰，提示引物設(shè)計(jì)合理，無(wú)非特異性擴(kuò)增。取3個(gè)重復(fù)樣品的平均Ct值作為此樣品待測(cè)基因的Ct值，各組血漿mir-142-5p相對(duì)表達(dá)量以2-ΔΔCt表示，其中ΔCt=Ctmir-142-5p-CtU6。經(jīng)計(jì)算，健康組血漿mir-142-5p相對(duì)表達(dá)量為0.11±0.037，冠心病組mir-142-5p相對(duì)表達(dá)量為0.13±0.027(見圖1)，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.496，P<0.05)。

2.2冠心病組血漿mir-142-5p水平和Gensini評(píng)分相關(guān)性分析 冠心病組血漿mir-142-5p水平和Gensini評(píng)分采用二元變量相關(guān)分析，Pearson相關(guān)系數(shù)為0.499，P<0.01，提示兩者具有相關(guān)性(見圖2)。

2.3Western blot法檢測(cè)mir-142-5p對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞 IGF-1R蛋白水平的影響 各組IGF-1R的相對(duì)表達(dá)量以IGF-1R/β-actin表示(見圖3A、B)。

圖1 健康組和冠心病組血漿mir-142-5p水平

圖2 冠心病組血漿mir-142-5p水平和Gensini評(píng)分的相關(guān)性分析

C+ox-LDL組IGF-1R蛋白表達(dá)較C組升高(t=40.02，P<0.01)；mir-142-5p inhibitor組IGF-1R蛋白表達(dá)較C+ox-LDL組和CN組明顯升高(t=14.85、46.22，P均<0.01)，而mir-142-5p minics組IGF-1R蛋白表達(dá)明顯低于C+ox-LDL組和CN組(t=20.49、22.16，P均<0.01)；C+ox-LDL組和CN組的蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.13，P>0.05)。

2.4PT-PCR法檢測(cè)mir-142-5p對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞IGF-1R mRNA表達(dá)水平的影響 各組IGF-1R相對(duì)表達(dá)量以2-ΔΔCt表示，其中ΔCt=CtIGF-1R-Ctβ-actin(見圖3C)。C+ox-LDL組IGF-1R mRNA的表達(dá)較C組升高(t=35.37，P<0.01)；mir-142-5p inhibitor組IGF-1R mRNA的表達(dá)較C+ox-LDL組和CN組明顯升高(t=17.63、40.32，P均<0.01)，而mir-142-5p minics組IGF-1R mRNA表達(dá)明顯低于C+ox-LDL組和CN組(t=19.65、21.93，P均<0.01)；C+ox-LDL組和CN組的mRNA表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.15，P>0.05)。

圖3 各組內(nèi)皮細(xì)胞IGF-1R表達(dá)情況

圖4 各組內(nèi)皮細(xì)胞NO合成情況

2.6各組內(nèi)皮細(xì)胞NO合成情況 根據(jù)各組內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)液NO濃度檢測(cè)結(jié)果(見圖4)，C+ox-LDL組培養(yǎng)液中NO水平的表達(dá)較C組升高(t=10.79，P<0.01)；mir-142-5p inhibitor組NO濃度較C+ox-LDL組和CN組明顯升高(t=6.87、8.61，P均<0.05)，而mir-142-5p minics組明顯低于C+ox-LDL組和CN組(t=7.19、6.95，P均<0.05)；C+ox-LDL組和CN組的NO濃度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.69，P>0.05)。

3 討論

microRNAs是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一類體內(nèi)自然存在、內(nèi)源性高度保守的非編碼單鏈小分子RNA，大約由18～25個(gè)核苷酸構(gòu)成。研究發(fā)現(xiàn)，microRNAs可以通過(guò)與信使RNA的3′UTR堿基互補(bǔ)配對(duì)而與目標(biāo)信使RNA特異性結(jié)合，干擾或促進(jìn)信使RNA的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而調(diào)節(jié)靶蛋白的表達(dá)[5，6]。作為一種新型的基因調(diào)控因子，microRNAs廣泛參與到多種基本生物學(xué)過(guò)程，在生命活動(dòng)中發(fā)揮了重要調(diào)控作用。在心血管系統(tǒng)疾病中，異常表達(dá)的microRNAs參與了包括血管平滑肌細(xì)胞增殖和遷移、內(nèi)皮功能變化以及巨噬細(xì)胞功能變化和凋亡等病理過(guò)程[7-9]。microRNA性質(zhì)穩(wěn)定，在體內(nèi)和體外環(huán)境中可穩(wěn)定存在，可以作為心腦血管或其他疾病的標(biāo)志物。本研究發(fā)現(xiàn)，冠心病患者血漿mir-142-5p水平明顯高于健康志愿者，提示mir-142-5p可能參與了冠狀動(dòng)脈粥樣硬化的病變過(guò)程。值得注意的是，我們研究發(fā)現(xiàn)冠心病組血漿mir-142-5p升高程度和Gensini評(píng)分相關(guān)，提示血漿mir-142-5p升高程度可反應(yīng)冠脈病變的程度。前期也有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)[10]發(fā)現(xiàn)，mir-142-5p在小鼠動(dòng)脈不穩(wěn)定斑塊中的表達(dá)升高，推測(cè)其可能和動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的穩(wěn)定性有關(guān)。因此在臨床工作中，血漿mir-142-5p水平可以作為一種新的標(biāo)志物協(xié)助我們判斷冠狀動(dòng)脈病變程度。

血管內(nèi)皮細(xì)胞是循環(huán)血液和血管平滑肌之間的機(jī)械屏障，也是重要的內(nèi)分泌器官。正常的血管內(nèi)皮功能對(duì)維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、調(diào)節(jié)血液循環(huán)有著重要作用，血管內(nèi)皮損傷是動(dòng)脈粥樣硬化的始動(dòng)因素[11]。胰島素樣生長(zhǎng)因子1(Insulin-like growth factor 1，IGF-1)是一種由70個(gè)氨基酸組成的多肽類激素，是肌體細(xì)胞生長(zhǎng)、分化和凋亡的重要調(diào)節(jié)因子。IGF-1主要在肝臟內(nèi)合成，通過(guò)和細(xì)胞表面的IGF-1R結(jié)合發(fā)揮其生物學(xué)作用。IGF-1R在肌體大多數(shù)組織中都有表達(dá)，血管內(nèi)皮細(xì)胞表面也有IGF-1R的表達(dá)。近年來(lái)研究表明，IGF-1可以通過(guò)和內(nèi)皮細(xì)胞IGF-1R高親和力的結(jié)合，提高內(nèi)皮型NO合酶活性，促進(jìn)NO釋放。NO可以通過(guò)擴(kuò)張血管、清除氧自由基、抗炎、抗血小板聚集、促進(jìn)鉀通道開放等作用，從而起到調(diào)節(jié)內(nèi)皮功能、促進(jìn)內(nèi)皮修復(fù)、保護(hù)心血管的作用[12]。我們前期應(yīng)用數(shù)據(jù)庫(kù)及預(yù)測(cè)軟件發(fā)現(xiàn)，IGF-1R基因可能為mir-142-5p的靶基因。我們應(yīng)用ox-LDL刺激內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，內(nèi)皮細(xì)胞IGF-1R蛋白和mRNA的表達(dá)量升高、NO的釋放增加，提示在高脂環(huán)境下內(nèi)皮細(xì)胞IGF-1R的表達(dá)增高，這可能是內(nèi)皮細(xì)胞針對(duì)高脂損傷的一種自我保護(hù)機(jī)制，損傷的內(nèi)皮細(xì)胞通過(guò)過(guò)表達(dá)IGF-1R而釋放更多的NO，從而進(jìn)行自我功能調(diào)節(jié)和修復(fù)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染mir-142-5p minics的內(nèi)皮細(xì)胞的IGF-1R蛋白和mRNA表達(dá)量下降，而轉(zhuǎn)染mir-142-5p inhibitor的內(nèi)皮細(xì)胞IGF-1R蛋白和mRNA表達(dá)量均升高，提示mir-142-5p可以抑制IGF-1R基因的表達(dá)，IGF-1R可能是mir-142-5p的靶基因之一。冠心病患者血漿mir-142-5p的升高可以通過(guò)抑制內(nèi)皮細(xì)胞IGF-1R的表達(dá)而阻礙受損內(nèi)皮細(xì)胞的修復(fù)和功能調(diào)節(jié)，從而促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)展。

綜上所述，mir-142-5p通過(guò)靶定IGF-1R基因損傷血管內(nèi)皮功能，并且其血漿濃度和冠脈病變程度呈正相關(guān)，提示mir-142-5p血漿濃度可以作為一種新的標(biāo)志物來(lái)協(xié)助我們判斷冠脈病變程度。動(dòng)脈粥樣硬化機(jī)制復(fù)雜，涉及血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等多種細(xì)胞的共同作用，下一步我們將進(jìn)一步研究mir-142-5p對(duì)其他各種與動(dòng)脈粥樣硬化有關(guān)組織和細(xì)胞的影響，并繼續(xù)尋找其他可能的靶基因，探討和驗(yàn)證mir-142-5p在動(dòng)脈粥樣硬化中發(fā)揮的作用，為動(dòng)脈粥樣硬化的預(yù)防和治療提供新的思路和治療靶點(diǎn)。