夏 莉 齊 紅 狄 娜 魏天雪 遲艷飛 牟正華 魏本杰 劉玉俠④

(吉林省人民醫(yī)院，長春130021)

胃癌是世界第二大癌癥死亡原因[1]。我國胃癌的發(fā)病率和死亡率均位居惡性腫瘤的第2位[2]。目前胃癌的治療以傳統(tǒng)手術(shù)和化療為主，盡管胃癌綜合治療的療效得以提高，但傳統(tǒng)方法治療胃癌已處于發(fā)展瓶頸期，而胃癌的遺傳復雜性和異質(zhì)性也很大程度上影響了經(jīng)典靶向治療的有效性[3，4]。所以開發(fā)新療法成為亟待解決的問題。γ9δ2 T淋巴細胞(γ9δ2 T細胞)是近年來日益受到重視的T細胞亞群，具有很強的細胞毒功能，在機體抗腫瘤免疫中具有重要作用。本研究采用焦磷酸溴代醇(Bromohydrin pyrophosphate,BrHPP)聯(lián)合白細胞介素2(IL-2)誘導γ9δ2 T細胞產(chǎn)生的方法，探討γ9δ2 T細胞對胃癌的治療作用。建立新的腫瘤生物治療方法，為胃癌的治療提供一種有效的免疫治療方法和手段。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1儀器 生物倒置顯微鏡(Olympus，Japan)；低溫低速離心機(SORVALL RTT，USA),全自動酶標儀(Labsystems Dragon),超凈工作臺(蘇州凈化設(shè)備廠),流式細胞儀(BD公司)。

1.1.2試劑 RPMI1640培養(yǎng)基：Gibco公司； BrHPP：法國Inserm研究所的Mary Poupot博士饋贈；IL-2：北京四環(huán)生物制藥有限公司；高效離心管、淋巴細胞分離液：天津灝洋生物技術(shù)有限公司； MTT(噻唑藍)、DMSO(二甲基亞砜)：Sigma公司；胎牛血清：天津康源生物技術(shù)有限公司；anti-human TCRγ/δ、Human TNF-α ELISA Kit、Human IL-2 ELISA Kit、Human IFN-γ ELISA Kit、FITC anti-human CD3：Biolegend公司；FITC Mouse Anti-human Vγ9TCR、PE Mouse Anti-human Vδ2 TCR：BD公司。

1.1.3瘤株 胃癌細胞株SGC-7901由吉林省腫瘤防治研究所提供。

1.2方法

1.2.1γ9δ2T細胞的制備及鑒定 取健康志愿者外周血40 ml，用TBD高效離心管分離單核細胞(PBMC)并計數(shù)，調(diào)細胞數(shù)為1×107ml-1,放入25 ml培養(yǎng)瓶內(nèi)進行培養(yǎng)，共3瓶，每瓶10 ml。培養(yǎng)液為含有10%胎牛血清的RPMI1640，培養(yǎng)2 h后，向培養(yǎng)瓶內(nèi)加入以下物質(zhì)：第1瓶加入IL-2 1 000 U/ml；第2瓶加入BrHPP 3 μmol/L、IL-2 1 000 U/ml；第3瓶加入anti-human TCRγ/δ 0.4 μg/ml、IL-2 1 000 U/ml 進行體外誘導擴增，每3 d半量換液，并補加IL-2，將兩種方法培養(yǎng)10 d的細胞分別用FITC-γ9TCR、PE-δ2TCR及FITC-γ9PE-δ2TCR標記后，用流式細胞儀進行檢測。

1.2.2培養(yǎng)細胞的上清細胞因子檢測 我們對兩種方法培養(yǎng)10 d的細胞培養(yǎng)上清進行了TNF-α、IL-2、IFN-γ等細胞因子的檢測，同時設(shè)未加任何成分的培養(yǎng)上清作為陰性對照。方法簡述如下：按照試劑盒說明，將TNF-α、IL-2、IFN-γ等的標準品倍比稀釋成6個濃度，然后將稀釋好的標準品和樣品(留取的培養(yǎng)上清)以及陰性對照加入到已包被好抗體并經(jīng)過洗滌的微孔板內(nèi)，標準品和樣品各做3復孔，按照步驟操作，最后在酶標儀450 nm處測OD值，根據(jù)OD值做出標準曲線，根據(jù)標準曲線計算樣品濃度。

1.2.3培養(yǎng)細胞對胃癌細胞株SGC-7901的殺傷活性實驗

1.2.3.1培養(yǎng)胃癌細胞株SGC-7901 從液氮中取出SGC-7901細胞，37℃快速復溫，用生理鹽水洗滌后，加入到含10%胎牛血清IMDM培養(yǎng)基的25 ml培養(yǎng)瓶進行培養(yǎng)。待長到指數(shù)生長期，細胞活性大于95%，用胰酶消化后離心，計數(shù)，使細胞濃度為5×104ml-1，加到96孔細胞培養(yǎng)板，0.1 ml/孔，待用。

1.2.3.2兩種方法培養(yǎng)細胞對SGC-7901的殺傷活性 將培養(yǎng)10 d并鑒定的γ9δ2T細胞計數(shù)為2.5×106ml-1，按以下設(shè)計加入到已經(jīng)接種SGC-7901的96孔細胞培養(yǎng)板。第1組： anti-human TCRγ/δ+IL-2;第2組： anti-human TCRγ/δ+IL-2+SGC-7901;第3組：BrHPP+IL-2;第4組：BrHPP+IL-2+SGC-7901;第5組：SGC-7901。每組設(shè)6復孔，放入37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)結(jié)束前4 h，每孔加20 μl MTT，培養(yǎng)結(jié)束后，小心吸去上清，每孔加DMSO 150 μl，振蕩混勻后，用酶標儀在492 nm處測定OD值。根據(jù)以下公式計算殺傷活性。殺傷活性=(1-實驗組OD值-效應細胞OD值/靶細胞OD值)×100%。

2 結(jié)果

2.1anti-human TCRγ/δ聯(lián)合IL-2誘導細胞γ9TCR、δ2TCR及γ9δ2TCR的表達 從圖1可以看出，anti-human TCRγ/δ聯(lián)合IL-2培養(yǎng)的細胞γ9TCR表達較高，為98.10%，δ2TCR表達較低，為10.60%，而γ9δ2TCR共同表達較低，為10.70%。

2.2BrHPP聯(lián)合IL-2培養(yǎng)細胞的γ9TCR、 δ2TCR及γ9δ2TCR表達 從圖2可以看出，BrHPP聯(lián)合IL-2培養(yǎng)的細胞γ9TCR和δ2TCR表達都較高，分別為65.10%和64.10%，γ9δ2TCR共同表達也較高，為61.60%。

圖1 Anti-human TCRγ/δ聯(lián)合IL-2誘導細胞γ9TCR、δ2TCR及γ9δ2TCR的表達

圖2 BrHPP聯(lián)合IL-2培養(yǎng)細胞γ9TCR、δ2TCR及γ9δ2TCR表達

GroupsContent(pg/ml)IL-2TNF-αIFN-γControl group100.67±0.00762.91±0.00658.73±0.005anti-human TCRγ/δ3 157.44±0.0981)170.53±0.0111)1 749.98±0.0661)BrHPP3 237.54±0.1621)2)158.91±0.0051)2)1 851.40±0.0951)2)

Note：1)P<0.01，compared with control group；2)P>0.05，compared with anti-human TCRγ/δ group.

表2兩種方法誘導細胞對SGC-7901體外殺傷活性

Tab.2KillingactivityoftwomethodsinducedcellstoSGC-7901

GroupsOD(x±s,n=6)Killing activity(%)anti-human TCRγ/δ+IL-21.073±0.21878.80anti-human TCRγ/δ+IL-2+SGC-79011.227±0.055BrHPP+IL-21.237±0.09277.06BrHPP+IL-2+SGC-79011.404±0.055SGC-79011.476±0.116

2.3兩種方法培養(yǎng)細胞上清的細胞因子檢測結(jié)果 從表1可以看出，兩種方法誘導的細胞培養(yǎng)上清IL-2、TNF-α、IFN-γ的細胞因子表達與對照組比較有明顯差異(P<0.01)；但兩實驗組之間比較沒有差異(P>0.05)。

2.4兩種方法誘導細胞對SGC-7901體外殺傷活性實驗結(jié)果 從表2可以看出，兩種方法誘導的細胞對SGC-7901的殺傷活性沒有明顯差別。

3 討論

依據(jù)GLOBOCAN-2012數(shù)據(jù)，胃癌在全球惡性腫瘤中，發(fā)病率位居第6位， 死亡率位居第4位，超過70%的病例發(fā)生在亞洲[5]。中國胃癌的總體發(fā)病人數(shù)約占全世界的42%，并且有明顯的地區(qū)和城鄉(xiāng)差異，城市為15.3/10萬，農(nóng)村為24.4/10萬，是城市的1.6倍[1]。因為早期胃癌無明顯癥狀，所以60%以上的患者在就診時已達進展期，5年生存率僅為2%～15%[5]。盡管部分早期胃癌可以通過綜合治療治愈，但是術(shù)后復發(fā)率高，且多數(shù)患者初診時已是晚期。國內(nèi)外研究顯示抗HER2治療聯(lián)合化療顯著改善了晚期HER2陽性患者的預后。但是中國胃癌患者HER2陽性率為12%～13%，對于HER2陰性患者的預后改善仍刻不容緩。為了尋找新的胃癌治療方法，本實驗選用BrHPP聯(lián)合IL-2誘導產(chǎn)生γ9δ2T細胞的方法，探討γ9δ2T細胞對胃癌的治療作用。

T細胞可根據(jù)表面抗原受體(TCR)的不同表達而分成兩類T細胞：TCRαβT細胞和TCRγδT細胞。γδT細胞是近年來逐漸認識的一種T細胞亞群，根據(jù)其TCRγ、δ鏈的不同組合分為多個亞群。TCRγδ分子結(jié)構(gòu)中的γ鏈、δ鏈和CD3分子共同構(gòu)成γδT 細胞的抗原識別受體。由于Vγ和Vδ配對的有限性和N區(qū)插入較少，使得TCRγδ的CDR3變化較小，這也決定了TCRγδ的生物學功能不同于TCRαβ。γδT 細胞是分布于機體的第一道屏障，通過直接識別入侵生物表面的抗原，發(fā)揮其毒性T細胞作用[8]。γδT 細胞通過穿孔素-顆粒酶途徑、抗體依賴性細胞毒作用(Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC)等方式裂解腫瘤細胞發(fā)揮直接抗腫瘤作用[9,10]。

γδT細胞的誘導方法主要有磷酸抗原如唑來膦酸、HMBPP(4-羥基-3甲基2-烯基焦磷酸)及抗TCRγ/δ單抗(anti-human TCRγ/δ)等[11-13]。

BrHPP是一種新的人工合成的磷酸抗原，能與IL-2一起特異性地誘導單核細胞向γ9δ2T細胞分化。為了探討其對γ9δ2T細胞的誘導分化作用，本研究采用BrHPP聯(lián)合IL-2的方法誘導γ9δ2T細胞的生成，并與anti-human TCRγ/δ聯(lián)合IL-2的方法作為比較，從培養(yǎng)10 d的檢測結(jié)果看，BrHPP聯(lián)合IL-2培養(yǎng)誘導的細胞γ9δ2TCR有較高的表達，為61.60%，其中γ9TCR為65.10%，δ2TCR為64.10%；anti-human TCRγ/δ聯(lián)合IL-2培養(yǎng)誘導的細胞γ9δ2TCR表達率較低，為10.70%，但是其中的γ9TCR表達較高，為98.10%，δ2TCR表達較低，為10.60%。我們同時對培養(yǎng)細胞上清進行了IL-2、TNF-α、IFN-γ等細胞因子的檢測，從檢測結(jié)果看，兩種方法誘導的細胞培養(yǎng)上清三種細胞因子表達均較高，與對照組比較有明顯差異(P<0.01)，但兩實驗組之間比較沒有差異(P>0.05)。在此基礎(chǔ)上，我們用兩種方法培養(yǎng)的細胞對胃癌細胞株SGC-7901的殺傷作用進行比較研究，結(jié)果證明兩種方法誘導的γ9δ2T細胞對SGC-7901均具有較強的殺傷效果，分別達到77.06%和78.80%。

γ9δ2T細胞對腫瘤的作用主要是以非MHC分子限制性的方式直接識別和殺傷腫瘤細胞[14,15]γ9δ2T細胞是γδT細胞的亞群，它包含有γ9TCR和δ2TCR，它們在γδT細胞的功能中起重要作用，雖然本實驗中anti-human TCRγ/δ+IL-2誘導的γ9δ2T細胞總體表達較低，但是其中的γ9TCR表達非常高，對γ9δ2T細胞的功能發(fā)揮起了非常重要的作用。另外γ9δ2T細胞還可以通過分泌細胞因子如IL-2、TNF-α、IFN-γ等發(fā)揮抗腫瘤功能[16,17]。TNF-α是一種小分子蛋白。它可以與腫瘤細胞質(zhì)膜特異性受體結(jié)合，導致溶酶體破裂，釋放出溶酶體酶而促使細胞自溶。已有研究證實TNF-α對多種腫瘤具有細胞毒和抑制生長作用[18]。IL-2是一種具有多重生物學功能的細胞生長因子，它可以促進T細胞生長、增殖及分化[19]，調(diào)節(jié)NK細胞并保持它的自然殺傷力[20]，誘導細胞毒性T細胞的增殖和產(chǎn)生，與其他細胞因子協(xié)同作用等[17]。目前IL-2已被廣泛應用于腫瘤的治療。IFN-γ是一種多功能細胞因子，除了具有抗病毒活性外，還能抑制腫瘤細胞增殖和參與調(diào)節(jié)免疫應答作用[21]，因而在腫瘤治療中也起著重要作用。本實驗通過檢測培養(yǎng)細胞上清中的IL-2、TNF-α、IFN-γ等細胞因子的表達以及對SGC-7901的殺傷實驗結(jié)果證明了γ9δ2T細胞對腫瘤細胞的作用。

目前，磷酸化合物作為誘導γδT細胞的誘導劑，已被廣泛認同和應用。本實驗為了尋找新的γ9δ2T細胞的誘導劑而選擇了BrHPP，從實驗結(jié)果看，BrHPP聯(lián)合IL-2誘導的γ9δ2T細胞無論從表面標志、細胞因子表達還是對胃癌細胞的殺傷活性都取得了理想的效果。

本實驗選擇了anti-human TCRγ/δ聯(lián)合IL-2作為比較研究，從結(jié)果看此方法也取得了較好的結(jié)果，而且在我們之前的研究中也證實了它的作用[22]。因為anti-human TCRγ/δ的費用較高，我們就想尋找一種能夠與其起到同樣效果，價格低廉的產(chǎn)品替代它，使γ9δ2T細胞的研究和應用能廣泛開展。通過我們的努力，最終找到了這種經(jīng)濟實用而且有效的化合物，為γ9δ2T細胞的培養(yǎng)擴增和應用提供了經(jīng)濟可行的方法。此研究結(jié)果初步證明了用BrHPP聯(lián)合IL-2誘導的γ9δ2T細胞的抗腫瘤功能，為胃癌的治療提供一種有效的免疫治療方法和手段。