周雋敏 胡水清 文坤明

(遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院胃腸外科，遵義563003)

結(jié)直腸癌(Colorectal cancer,CRC)是常見的惡性腫瘤，2018年美國最新統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，CRC發(fā)病率在男女患者中均位列第三位，病死率居第二位[1]?；熓寝D(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)性CRC最常用的治療方法，而對化療藥物多藥耐藥(Multidrug resistance，MDR)是CRC治療失敗的主要原因之一[2]。因此研究耐藥機(jī)制并尋求治療策略，對改善患者的預(yù)后具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。Twist1 是一種堿性螺旋-環(huán)-螺旋(bHLH)轉(zhuǎn)錄因子。研究發(fā)現(xiàn)，Twist1在多種惡性腫瘤中表達(dá)上調(diào)，在對化療藥物MDR、腫瘤細(xì)胞干性的獲得、抗細(xì)胞凋亡等方面起著重要的作用[3]。有報(bào)道Twist1在結(jié)直腸癌組織中高表達(dá)，與患者的預(yù)后差密切相關(guān)[4]。但目前Twist1在結(jié)直腸癌中是否能促進(jìn)化療藥物MDR的獲得及機(jī)制仍不清楚。本實(shí)驗(yàn)研究過表達(dá)Twist1對結(jié)直腸癌SW620細(xì)胞MDR的影響及機(jī)制是否與促進(jìn)干性獲得有關(guān)。

1 材料與方法

1.1材料 人結(jié)直腸癌SW620細(xì)胞株購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫；L-15培養(yǎng)基購自北京邁晨科技有限公司；胎牛血清(FBS)、胰酶購自美國Hyclone公司；過表達(dá)慢病毒(Twist1-GFP-PURO病毒)和陰性對照病毒(HBLV-GFP-PURO病毒)委托上海漢恒生物科技有限公司構(gòu)建；奧沙利鉑(OXA)、5-氟尿嘧啶(5-Fu)及CCK8試劑均購自美國Sigma公司； RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒購于大連TaKaRa公司；兔抗人Twist1、ABCB1、ABCG2、CD133、CD44、β-tubulin一抗，HRP標(biāo)記山羊抗兔二抗、PE標(biāo)記的山羊抗兔二抗均購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司。

1.2方法

1.2.1SW620-Twist1組和SW620-NC組細(xì)胞株的構(gòu)建 將SW620細(xì)胞用含有10%胎牛血清的L-15培養(yǎng)基在37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)；按預(yù)實(shí)驗(yàn)獲得的最佳轉(zhuǎn)染條件(L-15+10%FBS+Polybrne 2 mg/ml，MOI為40)配制好病毒感染液，轉(zhuǎn)染相應(yīng)數(shù)量、生長狀態(tài)良好的SW620細(xì)胞，48 h后更換新鮮完全培養(yǎng)基，72 h倒置熒光顯微鏡下檢測感染效率，并拍照。

1.2.2轉(zhuǎn)染后 SW620 細(xì)胞Twist1過表達(dá)效果檢測 在轉(zhuǎn)染后72 h，采用RT-qPCR技術(shù)檢測兩組細(xì)胞Twsit1 mRNA的表達(dá)(具體方法見1.2.4)，采用Western blot技術(shù)檢測兩組細(xì)胞中Twsit1 蛋白的表達(dá)(具體方法見1.2.5)，從mRNA和蛋白水平確定Twist1過表達(dá)效果。

1.2.3CCK8檢測兩種藥物(5-FU、OXA)對細(xì)胞增殖的影響 SW620細(xì)胞按每孔1×104/100 μl接種于96孔板中，加入0、1、2、4、8、16、32、64、128 μg/ml梯度濃度的5-FU與OXA，藥物作用72 h后每孔加入10 μl CCK8，在37℃孵育2 h后酶標(biāo)儀檢測在450 nm處的吸光度(OD)值，采用GraphPad Prism5.0軟件計(jì)算出72 h時的半數(shù)抑制濃度IC50；將兩組細(xì)胞同上接種貼壁后加入72 h的IC50的5-FU、OXA；分別在藥物處理24、48、72 h時每孔加入10 μl CCK8，37℃孵育2 h，用酶標(biāo)儀測定在450 nm處的OD值，每組設(shè)置3個復(fù)孔，重復(fù)3次，增殖抑制率(%)=(對照組的OD值-實(shí)驗(yàn)組的OD值)/對照組的OD值×100%。

1.2.4RT-qPCR檢測Twist1、ABCB1、ABCG2 mRNA的表達(dá)水平 按RNA提取試劑盒說明書提取兩組細(xì)胞的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后以 SYBR Green 染料法進(jìn)行實(shí)時定量PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件：95℃ 30 s,95℃ 5 s，60℃ 34 s，40個循環(huán)；95℃ 15 s，60℃ 60 s，90℃ 15 s。每次檢測設(shè)置3個復(fù)孔，重復(fù)3次。選擇GAPDH基因?yàn)閮?nèi)參，運(yùn)用2-ΔΔCt方法確定目的基因mRNA表達(dá)的相對水平。引物由大連寶生物設(shè)計(jì)并合成，引物序列見表1。

1.2.5Western blot 檢測Twist1、ABCB1、ABCG2蛋白表達(dá)水平 按全蛋白試劑盒說明書提取兩組細(xì)胞總蛋白， BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白的濃度；根據(jù)目的蛋白的分子量配置相應(yīng)濃度的SDS-PAGE膠，每孔上樣量均為40 μg，恒壓電泳分離蛋白，采用半干法恒流轉(zhuǎn)膜1 h(2 mA/cm2)使凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，加入一抗(目的蛋白及內(nèi)參β-tubulin稀釋比例均為1∶1 000)，4℃過夜。次日TBST洗膜后分別加入HRP標(biāo)記山羊抗兔 IgG抗體(稀釋比均為1∶5 000)， 37℃孵育1 h后TBST洗膜，用ECL發(fā)光并拍照。采用Image-Pro Plus軟件對條帶的吸光度值進(jìn)行半定量分析。

表1引物系列

Tab.1Primersequence

GeneFORWARD REVERSETwist15′CAAGAAGTCTGCGGGCTGTGGCG 3′5′TGTCCGAGGGCAGCGTGGGGAT 3′ABCB15′TGTGAGTTGGTTTGATGACCCTAA 3′5′TTATTCCTGTCCCAAGATTTGCTAT 3′ABCG25′CAGCTACACCACCTCCTTCTGTC 3′5′AGCCCAAAGTAAATGGCACCTAT 3′GAPDH5′AGGGTTCAGCACCTTCACCATTA 3′5′GCGTCAAAGGTGGAGGAGTGGGT 3′

1.2.6流式間接法檢測兩組細(xì)胞CSCs標(biāo)記物的表達(dá) 將兩組細(xì)胞用0.25%胰酶消化下來，PBE液洗后用98 μl預(yù)冷的PBE液重懸細(xì)胞(細(xì)胞數(shù)為1×106個)；分別加入CD133和CD44一抗(稀釋比例1∶50)，37℃孵育1 h；PBE液洗后用99 μl PBE液重懸細(xì)胞，加入對應(yīng)的PE標(biāo)記的二抗(稀釋比例1∶100)，室溫避光孵育30 min；PBE液洗后400 μl PBE液重懸，流式細(xì)胞儀檢測。

2 結(jié)果

2.1慢病毒成功轉(zhuǎn)染SW620細(xì)胞 實(shí)驗(yàn)組(SW620-Twist1)和對照組(SW620-NC)分別轉(zhuǎn)染Twist1-GFP-PURO病毒和HBLV-GFP-PURO病毒，72 h后兩組細(xì)胞在熒光顯微鏡下均可見綠色熒光(見圖1)，提示轉(zhuǎn)染成功。

圖1 轉(zhuǎn)染后72 h的明視野及熒光視野圖像(×100)

圖2 RT-qPCR檢測兩組細(xì)胞Twist1 mRNA表達(dá)水平

2.2RT-qPCR檢測兩組細(xì)胞Twist1 mRNA相對表達(dá)量 RT-qPCR檢測結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組和對照組Twist1 mRNA相對表達(dá)水平分別為(2.54±0.18)和(0.97±0.02)。與對照組對比，實(shí)驗(yàn)組Twist1 mRNA相對表達(dá)顯著增高(P<0.01)(見圖2)。

2.3Western blot檢測兩組細(xì)胞Twist1蛋白表達(dá)量 Western blot檢測實(shí)驗(yàn)組與對照組Twist1蛋白的相對表達(dá)量分別為(1.12±0.03)及(0.53±0.02)。與對照組相比，實(shí)驗(yàn)組Twist1蛋白表達(dá)顯著增高(P<0.01)(見圖3)。提示Twist1過表達(dá)細(xì)胞株建立成功。

2.4CCK-8法檢測兩組細(xì)胞對5-FU與OXA敏感性結(jié)果 5-FU和OXA兩種藥物對SW620細(xì)胞72 h時IC50分別為 41.62 μg/ml 和 14.33 μg/ml(見圖4)。在24、48、72 h三個時間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組和對照組細(xì)胞抑制率結(jié)果：5-FU分別為(7.96±1.85)%和(13.80±3.61)%、(13.18±1.32)%和(19.10±2.26)%、(37.86±4.04)% 和(60.93±4.17)%；Oxa分別為(5.66±2.29)%和(7.92±2.54)%、(10.78±2.05)%和(15.20±3.31)%、(24.75±2.52)% 和(44.77±2.03) %。 結(jié)果表明過表達(dá)Twist1后 SW620細(xì)胞分別對5-FU、OXA兩種化療藥物的敏感性隨作用時間延長而降低,在48、72 h兩時間段對5-FU、OXA均產(chǎn)生了耐藥(48 h，P<0.05；72 h，P<0.01)(見圖5)，提示實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞具有MDR。

圖3 Western blot檢測兩組Twist1蛋白表達(dá)

圖4 不同藥物濃度作用于SW620細(xì)胞所測得的增殖抑制率(72 h)

圖5 不同時間點(diǎn)(24、48、72 h)5-FU和OXA兩種藥物在兩組細(xì)胞中增殖抑制率結(jié)果

圖6 RT-qPCR檢測兩組細(xì)胞ABCB1、ABCG2 mRNA相對表達(dá)水平

2.5兩組細(xì)胞中耐藥基因ABCB1、ABCG2 mRNA相對表達(dá)結(jié)果 以GAPDH為內(nèi)參，采用RT-qPCR檢測兩組細(xì)胞中ABCB1、ABCG2 mRNA相對表達(dá)水平。結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組與對照組ABCB1 mRNA相對表達(dá)水平分別為(2.02±0.12)及(0.94±0.23)；ABCG2 mRNA相對表達(dá)水平分別為(2.45±0.38)及(0.91±0.22)。與對照組相比，實(shí)驗(yàn)組中ABCB1、ABCG2 mRNA相對表達(dá)增高約2倍,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)(見圖6)。

2.6兩組細(xì)胞中耐藥基因ABCB1、ABCG2蛋白表達(dá)結(jié)果 Western blot檢測實(shí)驗(yàn)組與對照組蛋白的相對表達(dá)量分別為ABCB1(0.70±0.03)及(0.35±0.05)，ABCG2(0.75±0.12)及(0.29±0.08)。實(shí)驗(yàn)組ABCB1、ABCG2蛋白表達(dá)顯著高于對照組(P<0.01)(見圖7)。

圖7 Western blot檢測SW620-Twist1、SW620-NC組ABCB1、ABCG2蛋白表達(dá)

圖8 流式細(xì)胞技術(shù)檢測CD133+、 CD44+細(xì)胞百分比

2.7兩組細(xì)胞中CSCs標(biāo)志物CD133、CD44表達(dá)結(jié)果 在實(shí)驗(yàn)組和對照組細(xì)胞中，CD133的陽性率分別為(36.62±1.8)%、(5.67±1.2)%；CD44的陽性率分別為(85.18±2.9)%、(74.52±2.6)%，與對照組對比,SW620-Twist1組CD133、CD44表達(dá)量均顯著增高(P<0.01)(見圖8)。

3 討論

MDR是導(dǎo)致CRC患者治療失敗的主要原因之一[2]。目前，腫瘤細(xì)胞發(fā)生MDR的機(jī)制尚不完全清楚，研究腫瘤MDR機(jī)制，尋求針對性治療靶點(diǎn)，對改善CRC患者的預(yù)后具有重要的研究意義。研究發(fā)現(xiàn)[5]，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-mesenchymal transition，EMT)及腫瘤干細(xì)胞(Cancer stem cells，CSCs)均可導(dǎo)致MDR，而腫瘤細(xì)胞可以通過EMT過程獲得CSCs特性[6]；Twist1是調(diào)控腫瘤EMT重要的轉(zhuǎn)錄因子，我們采用慢病毒介導(dǎo)的基因過表達(dá)技術(shù)研究Twsit1能否促進(jìn)結(jié)直腸癌SW620細(xì)胞獲得MDR及其機(jī)制是否與促進(jìn)CSCs特性獲得有關(guān)。

5-FU和OXA是目前CRC一線化療方案(FOLFOX4)中重要組成部分[7]，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)5-FU、OXA 兩種化療藥物對實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖率均明顯下降(48 h，P<0.05；72 h，P<0.01)，過表達(dá)Twist1的SW620細(xì)胞對5-FU、OXA均產(chǎn)生耐藥，提示Twist1過表達(dá)能促進(jìn)SW620細(xì)胞對化療藥物MDR特性的獲得。腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生MDR現(xiàn)象與ABC(ATP-bindingcassette transporter)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族介導(dǎo)的藥物轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的改變有關(guān)。ABC轉(zhuǎn)運(yùn)超蛋白家族成員ABCB1和ABCG2是MDR的主要參與者,其主要功能是維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)：在血漿和細(xì)胞之間依賴ATP轉(zhuǎn)運(yùn)代謝產(chǎn)物、外源性毒性物質(zhì)及脂類，降低細(xì)胞內(nèi)抗腫瘤藥物濃度[8]。實(shí)驗(yàn)組中的ABCB1和ABCG2 mRNA及蛋白表達(dá)顯著增高(P<0.01)(圖6、7)，提示過表達(dá)Twist1后SW620細(xì)胞出現(xiàn)MDR，與其增強(qiáng)耐藥指標(biāo)ABCB1和ABCG2表達(dá)有關(guān)。

研究發(fā)現(xiàn)[9,10]，多種腫瘤細(xì)胞中過表達(dá)Twist1后CSCs干性表達(dá)增強(qiáng)。Morel等[9]在乳腺癌細(xì)胞中過度表達(dá)Twist1，通過克隆形成能力，CSCs標(biāo)記物CD24陽性細(xì)胞比例，體內(nèi)致瘤能力等方面促進(jìn)干性的獲得；Yang等[10]在頭頸部鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞中過表達(dá)Twist1，細(xì)胞發(fā)生EMT后CSCs干性增強(qiáng)。我們進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組中的CD133、CD44的表達(dá)量較對照組明顯增高(P<0.01)，結(jié)合文獻(xiàn)提示過表達(dá)Twist1可促進(jìn)結(jié)直腸癌SW620細(xì)胞干性的獲得。

研究發(fā)現(xiàn)[11-13]，腫瘤細(xì)胞通過“干性”的獲得的同時可促進(jìn)其對化療藥物MDR的產(chǎn)生。Huang等[11]在人肺腺癌PC9細(xì)胞中以ALDH1A1為CSCs標(biāo)記，流式分選出CSCs與非CSCs，發(fā)現(xiàn)CSCs對順鉑、5-FU等多種化療藥物具有MDR。Bourguignon等[12]發(fā)現(xiàn)透明質(zhì)酸能誘導(dǎo)乳腺癌MCF-7細(xì)胞株增加CSCs標(biāo)記物CD44、Nanog的表達(dá)，刺激STAT-3依賴性耐藥基因MDR1的表達(dá)，并對化療藥物MDR。Haraguchi等[13]發(fā)現(xiàn)CD13表達(dá)的人肝癌CSCs可通過降低活性氧含量對5-FU及多柔霉素等藥物MDR。

綜上所述，過表達(dá)Twist1的SW620細(xì)胞對5-FU、OXA均產(chǎn)生耐藥，可促進(jìn)直腸癌SW620細(xì)胞耐藥指標(biāo)ABCB1、ABCG2表達(dá)，使腫瘤細(xì)胞獲得MDR，該現(xiàn)象可能與促進(jìn)干性獲得有關(guān)。