尹 芳 胡月圓 易 娟 李貴南

(湖南省兒童醫(yī)院新生兒二科，長(zhǎng)沙410007)

單核細(xì)胞增生李斯特菌(Listeria monocyto-genes，LM)是一種常見(jiàn)的革蘭陽(yáng)性致病菌，其主要以食物為媒介通過(guò)消化道傳播。感染人和動(dòng)物可引起腦膜炎、敗血癥、流產(chǎn)等癥狀，病死率高達(dá)30%[1]。由于LM耐受性強(qiáng)、在輕度感染的情況下易被忽視等特點(diǎn)，使得LM成為目前世界范圍內(nèi)感染最為嚴(yán)重的致病菌之一。目前研究發(fā)現(xiàn)LM入侵人體是否引起致病與菌體含量和宿主的年齡及免疫狀態(tài)有關(guān)。LM是一種胞內(nèi)寄生的致病菌，宿主對(duì)其清除作用只能依靠細(xì)胞免疫功能[2]。因此，易感者以新生兒、孕婦以及免疫功能缺陷者為主。近年來(lái)，新生兒感染LM引發(fā)肺炎的病例逐年上升，其主要通過(guò)孕婦的胎盤(pán)傳播。LM感染后可使新生兒出現(xiàn)發(fā)熱、呼吸急促、呼吸困難、窒息等顯著的呼吸道癥狀。

李斯特菌溶血素(Listeriolysin O，LLO)是LM的關(guān)鍵毒力因子，主要由hly基因編碼，是膽固醇依賴(lài)性細(xì)胞溶素家族成員之一。研究發(fā)現(xiàn)hly基因敲除菌株并不具有體外溶血活性，對(duì)小鼠也不能產(chǎn)生感染癥狀[3]。LLO能與膽固醇共同作用于細(xì)胞膜，并在細(xì)胞膜上形成孔狀結(jié)構(gòu)，進(jìn)而使LM從液泡中釋放以逃避巨噬細(xì)胞的免疫攻擊。此外，LLO還能誘導(dǎo)T細(xì)胞發(fā)生凋亡從而減弱機(jī)體的免疫功能[4,5]?？紤]到LLO的多種功能及其對(duì)于LM致病的重要性，深入研究LLO作用的分子機(jī)制對(duì)于預(yù)防控制LM感染意義重大。本研究通過(guò)探討LLO引起的宿主細(xì)胞炎癥反應(yīng)以及MUC5AC表達(dá)與磷酯酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(Phosphatidylinositol-3-kinsae/protein kinase B,PI3K/Akt)信號(hào)通路的關(guān)系，希望能為闡明LM致病的分子機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料 人呼吸道上皮細(xì)胞株(16-HEB)購(gòu)自美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù)國(guó)內(nèi)代理商；LLO由本實(shí)驗(yàn)室原核表達(dá)純化制備；RNA提取液、Trizol試劑盒購(gòu)自北京奧維亞生物公司；cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自上海斯信生物科技有限公司；p-Akt抗體、Akt抗體、β-actin抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司；IL-6、IL-1β檢測(cè)試劑盒購(gòu)自eBioscience公司；MUC5AC試劑盒購(gòu)自武漢優(yōu)爾生科技股份有限公司；RT-PCR引物設(shè)計(jì)合成均由上海生物工程有限公司完成；細(xì)胞培養(yǎng)試劑、耗材均購(gòu)自Sigma公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及細(xì)胞處理 凍存的16-HEB細(xì)胞株37℃快速溶解后加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基(含1%的青霉素-鏈霉素混合液)，于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞密度達(dá)85%以上進(jìn)行細(xì)胞傳代。將細(xì)胞按相應(yīng)比例稀釋后置于24孔板或者新的細(xì)胞瓶中，分別用濃度為15、30、45 μg/ml的LLO刺激細(xì)胞，24 h后收集細(xì)胞及上清待用。用20、40 μmol/L的PI3K抑制劑LY294002預(yù)處理細(xì)胞后，再用45 μg/ml的LLO刺激細(xì)胞24 h后收集細(xì)胞及上清待用。

1.2.2qRT-PCR 將上述收集的細(xì)胞使用Trizol試劑盒提取總RNA，純化后按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)使其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，隨后按照qRT-PCR反應(yīng)體系進(jìn)行引物擴(kuò)增。擴(kuò)增完畢后，使用2-ΔΔCt法計(jì)算IL-6、IL-1β以及MUC5AC mRNA的轉(zhuǎn)錄水平。PCR引物設(shè)計(jì)如下：MUC5AC上下游引物：5′-CCATAGTACAGTGGTCGATGC-3′、5′-GATCGATACATGGGTA-GACTT-3′；IL-6上下游引物：5′-GCCTTCGGTCCA-GTTGCC-3′、5′-GCGCAGAATGAGATGAGTTGTCATG-3′；IL-1β上下游引物：5′-ACTACAGCAAGGGCTT-ACAGG-3′、5′-TCTTTCAACACGCAGGACAG-3′。

1.2.3Western blot檢測(cè) 收集上述處理后的細(xì)胞，超聲破碎后得到細(xì)胞總蛋白。采用BCA法進(jìn)行蛋白定量。將各樣本濃度調(diào)整一致后，按照Western blot說(shuō)明書(shū)進(jìn)行配膠、加樣、跑膠、轉(zhuǎn)膜，用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，隨后加入稀釋好的一抗4℃孵育過(guò)夜。第二天洗膜后再加入稀釋好的二抗室溫孵育2 h。最后將配制好的ECL發(fā)光液均勻滴加在膜上，置于顯影儀中顯影，隨后以β-actin為內(nèi)參采用 Image J2X軟件進(jìn)行灰度值掃描，計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

1.2.4ELISA檢測(cè) 收集上述處理后得到的細(xì)胞上清，采用雙抗體夾心ELISA法檢測(cè)IL-6、IL-1β以及MUC5AC，并于酶標(biāo)儀450 nm處測(cè)定OD值。最后按照相應(yīng)的ELISA檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)計(jì)算IL-6、IL-1β的含量以及MUC5AC的濃度。

2 結(jié)果

2.1LLO誘導(dǎo)MUC5AC表達(dá) 為了觀察LLO對(duì)MUC5AC表達(dá)的影響，我們采用濃度為15、30、45 μg/ml 的LLO刺激16-HEB細(xì)胞株24 h后，qRT-PCR以及ELISA檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)MUC5AC mRNA轉(zhuǎn)錄水平和細(xì)胞上清中MUC5AC濃度。結(jié)果如圖1所示，隨著LLO濃度的增加，MUC5AC mRNA轉(zhuǎn)錄水平以及MUC5AC濃度都呈遞增趨勢(shì)，且均顯著高于未處理的對(duì)照組(P<0.05)，表明LLO能夠刺激16-HEB細(xì)胞株中的MUC5AC表達(dá)。

2.2LLO刺激產(chǎn)生IL-6與IL-1β 為了檢測(cè)LLO刺激產(chǎn)生炎癥反應(yīng)的情況，我們采用濃度為15、30、45 μg/ml的LLO刺激16-HEB細(xì)胞株24 h后，qRT-PCR以及ELISA檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)炎性因子IL-6與IL-1β mRNA轉(zhuǎn)錄水平以及細(xì)胞上清中IL-6與IL-1β的含量。結(jié)果如圖2所示，隨著LLO濃度的增加，IL-6與IL-1β mRNA轉(zhuǎn)錄水平以及含量均顯著增加，且高于對(duì)照組(P<0.05)，表明LLO能夠刺激16-HEB細(xì)胞株產(chǎn)生炎癥反應(yīng)。通過(guò)Pearson直線相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)IL-6與IL-1β mRNA的相關(guān)系數(shù)為0.94，濃度相關(guān)系數(shù)為0.96，表明IL-6與IL-1β的產(chǎn)生具有顯著的相關(guān)性。

2.3LLO能夠激活PI3K/Akt信號(hào)通路 為了檢測(cè)LLO對(duì)PI3K/Akt信號(hào)通路的影響，我們按照上述處理后收集細(xì)胞提取總蛋白，Western blot檢測(cè)細(xì)胞中p-Akt的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，p-Akt的表達(dá)隨LLO濃度的增加而遞增，且較對(duì)照組差異顯著(P<0.05)，提示LLO能夠激活PI3K/Akt信號(hào)通路(圖3)。

圖1 不同濃度LLO對(duì)MUC5AC表達(dá)的影響

圖2 不同濃度LLO對(duì)IL-6與IL-1β產(chǎn)生的影響

2.4PI3K抑制劑LY294002抑制p-Akt的表達(dá) 為了檢測(cè)PI3K/Akt信號(hào)通路與LLO刺激細(xì)胞產(chǎn)生炎癥反應(yīng)以及MUC5AC表達(dá)的關(guān)系，我們先用PI3K抑制劑LY294002處理細(xì)胞，并通過(guò)檢測(cè)p-Akt的表達(dá)情況來(lái)驗(yàn)證對(duì)PI3K/Akt信號(hào)通路的抑制效果。結(jié)果顯示，不同濃度抑制劑LY294002均能有效抑制p-Akt的表達(dá)(P<0.05)，但抑制劑濃度20 μmol/L與40 μmol/L對(duì)p-Akt表達(dá)的抑制作用并無(wú)顯著差異(圖4)。

2.5抑制PI3K/Akt信號(hào)通路對(duì)MUC5AC表達(dá)的影響 為了確定PI3K/Akt信號(hào)通路與MUC5AC表達(dá)的關(guān)系，我們使用抑制劑LY294002預(yù)處理細(xì)胞后再用45 μg/ml的LLO刺激細(xì)胞，并檢測(cè)細(xì)胞中MUC5AC的表達(dá)情況。結(jié)果如圖5所示，抑制p-Akt表達(dá)后能夠顯著降低細(xì)胞中MUC5AC mRNA轉(zhuǎn)錄水平以及MUC5AC濃度(P<0.05)，提示抑制PI3K/Akt信號(hào)通路能夠降低LLO刺激引起的MUC5AC表達(dá)。

圖3 不同濃度LLO對(duì)p-Akt表達(dá)的影響

圖4 抑制劑LY294002對(duì)16-HEB細(xì)胞株中p-Akt表達(dá)的影響

圖5 抑制PI3K/Akt信號(hào)通路對(duì)細(xì)胞中MUC5AC表達(dá)的影響

圖6 抑制PI3K/Akt信號(hào)通路對(duì)細(xì)胞中炎性因子產(chǎn)生的影響

2.6抑制PI3K/Akt信號(hào)通路對(duì)IL-6、IL-1β產(chǎn)生的影響 為了確定PI3K/Akt信號(hào)通路與炎癥反應(yīng)發(fā)生的關(guān)系，我們使用抑制劑LY294002預(yù)處理細(xì)胞后再用45 μg/ml的LLO刺激細(xì)胞，并檢測(cè)細(xì)胞中炎性因子IL-6、IL-1β的產(chǎn)生情況。結(jié)果如圖6所示，抑制p-Akt表達(dá)后能夠顯著降低細(xì)胞中IL-6、IL-1β mRNA的轉(zhuǎn)錄水平以及含量(P<0.05)。提示抑制PI3K/Akt信號(hào)通路能夠減輕LLO刺激引起的炎癥反應(yīng)。

3 討論

LLO是由LM分泌的一種重要的成孔毒素，其能在LM感染的早期和晚期裂解吞噬泡，從而使LM在感染入侵宿主細(xì)胞時(shí)能夠逃避宿主靶細(xì)胞的清除[6]。盡管已有研究表明LLO是LM入侵宿主細(xì)胞的關(guān)鍵信號(hào)分子[7]，能夠激活NF-κb、磷脂酰肌醇、鈣信號(hào)通路。但其是否能夠激活PI3K/Akt 信號(hào)通路，并通過(guò)PI3K/Akt信號(hào)通路的活化進(jìn)一步引起致病作用，目前尚不清楚。本研究通過(guò)探討LLO刺激細(xì)胞產(chǎn)生炎癥反應(yīng)以及MUC5AC表達(dá)與PI3K/Akt信號(hào)通路的關(guān)系，旨在進(jìn)一步明確LLO致病的分子機(jī)制。

Akt是真核細(xì)胞中參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵分子，它能夠參與調(diào)控細(xì)胞凋亡、細(xì)胞侵襲等多方面的功能。PI3K家族作為Akt激活過(guò)程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，其在許多呼吸道以及肺組織炎癥反應(yīng)中均發(fā)揮了至關(guān)重要的作用[8]。有研究表明，通過(guò)抑制PI3K/Akt信號(hào)通路來(lái)抑制蛋白激酶C-δ的表達(dá)，能夠減輕過(guò)敏性呼吸道炎癥反應(yīng)[9]。此外，卵清蛋白引起的呼吸道過(guò)敏性反應(yīng)可能也是通過(guò)激活PI3K/Akt信號(hào)通路引起的[10]。本研究通過(guò)Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)LLO能夠刺激16-HEB細(xì)胞株中p-Akt的表達(dá)，有效激活PI3K/Akt信號(hào)通路，提示其可能也與LLO引起的呼吸道炎癥反應(yīng)有關(guān)。

黏蛋白主要是由呼吸道和消化道分泌的一類(lèi)大分子糖蛋白，其在呼吸道中主要發(fā)揮清潔潤(rùn)滑以及保護(hù)作用。目前人類(lèi)已知的黏蛋白已達(dá)18種，MUC5AC作為其中一種重要的膠樣黏蛋白，其表達(dá)水平的變化能直接反映呼吸道感染與炎性病變的發(fā)生情況。當(dāng)人體出現(xiàn)呼吸道的炎性疾病時(shí)，MUC5AC分泌會(huì)明顯增加，進(jìn)而發(fā)揮相關(guān)的保護(hù)作用[11,12]。本研究通過(guò)采用不同濃度的LLO刺激16-HEB細(xì)胞株，發(fā)現(xiàn)MUC5AC的轉(zhuǎn)錄水平及濃度均顯著上升，表明LLO與LM引起的呼吸道病變密切相關(guān)，該結(jié)果與之前的報(bào)道相符。

有研究表明，MUC5AC在呼吸道炎癥反應(yīng)中會(huì)出現(xiàn)過(guò)度分泌的情況，有效控制MUC5AC過(guò)度分泌對(duì)于開(kāi)發(fā)相關(guān)的呼吸道感染藥物至關(guān)重要[13]。本研究采用PI3K抑制劑LY294002處理細(xì)胞后，先通過(guò)Western blot驗(yàn)證抑制效果，再進(jìn)一步檢測(cè)細(xì)胞中MUC5AC轉(zhuǎn)錄水平與濃度的變化情況，發(fā)現(xiàn)抑制PI3K/Akt信號(hào)通路能夠有效降低MUC5AC的表達(dá)，提示LLO刺激MUC5AC表達(dá)與PI3K/Akt信號(hào)通路有關(guān)。該結(jié)果也為尋求控制MUC5AC過(guò)度分泌的分子靶點(diǎn)提供了依據(jù)。

炎癥反應(yīng)是機(jī)體常見(jiàn)的一種病理過(guò)程，其通常由促炎細(xì)胞因子所介導(dǎo)，主要包括IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-8等[14]。促炎細(xì)胞因子是機(jī)體在炎癥早期分泌的一種細(xì)胞因子，它能夠直觀反映機(jī)體炎癥的發(fā)生情況。其中IL-6是由Th2細(xì)胞以及單核細(xì)胞等產(chǎn)生的一種重要的細(xì)胞因子，其致炎作用已經(jīng)得到證實(shí)。IL-1β則是由內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等在應(yīng)答感染時(shí)分泌的細(xì)胞因子，它能夠促進(jìn)B細(xì)胞增殖分泌抗體，進(jìn)而促進(jìn)免疫調(diào)節(jié)[15]。本研究發(fā)現(xiàn)不同濃度的LLO均能有效刺激細(xì)胞產(chǎn)生IL-6、IL-1β，該結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了LLO在呼吸道感染中的致炎作用。隨后我們采用抑制劑抑制PI3K/Akt信號(hào)通路后，同樣發(fā)現(xiàn)LLO刺激產(chǎn)生的IL-6、IL-1β顯著降低，提示LLO刺激產(chǎn)生的炎癥反應(yīng)也與PI3K/Akt信號(hào)通路有關(guān)。

綜上所述，本研究通過(guò)初步探討LLO刺激16-HEB細(xì)胞株產(chǎn)生炎癥反應(yīng)以及MUC5AC表達(dá)的分子機(jī)制。發(fā)現(xiàn)LLO能夠激活PI3K/Akt 信號(hào)通路進(jìn)而誘導(dǎo)16-HEB細(xì)胞株產(chǎn)生炎性因子IL-6、IL-1β，并促進(jìn)細(xì)胞中MUC5AC的表達(dá)。這為進(jìn)一步明確LM的致病機(jī)制，開(kāi)發(fā)有效的預(yù)防治療藥物奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。