崔 瑜 樊秦娥 李 晶 校林姣 李春義

(十堰市太和醫(yī)院(湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院)，十堰442000)

宮頸癌作為一種常見的惡性腫瘤，在早期并沒有任何癥狀和體征，直到中晚期，患者可因陰道接觸性出血等癥狀就診，從而嚴重影響患者的身心健康[1]。人乳頭狀瘤病毒(Human papillomavirus，HPV)會誘發(fā)慢性炎癥，最終造成宮頸上皮增殖過量，這就會引起宮頸癌，不過患有該疾病的患者不一定都會變成浸潤癌[2,3]。c-Met(cellular-mesenchy-mal to epithelial transition factor)是一種編碼肝細胞生長因子受體(Hepatocyte growth factor receptor,HGFR)的原癌基因，在多種惡性腫瘤中高表達并促進腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移，c-Met的編碼產(chǎn)物刺激細胞入侵、增殖、組織血管生成及防止細胞凋亡[4-6]?，F(xiàn)代研究表明炎癥與趨化因子能提高細胞生長的效率，限制突變細胞的凋亡，對惡性腫瘤的蔓延起到促進作用，因此通過抑制炎癥可能為將來治療宮頸癌提供新的方法[7]。脂氧素(Lipoxins，LXs)是很早以前就被發(fā)現(xiàn)的一種內(nèi)源性抗炎物質(zhì)， 其中BML-111(Lipoxygenin analogues)為脂氧素的一種，具有性質(zhì)穩(wěn)定的特點，可通過抑制NF-κB信號通路途徑而發(fā)揮對細胞增殖調(diào)控的作用，但是對細胞遷移與侵襲的影響還無相關(guān)報道[8,9]。因此,本文研究了BML-111下調(diào)c-Met抑制Hela細胞遷移和侵襲的影響，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1研究材料 人宮頸癌Hela 細胞株購自上海中科院細胞典藏館，胎牛血清為浙江天杭生物科技有限公司產(chǎn)品，DMEM高糖培養(yǎng)基為美國Hyclone公司制造的產(chǎn)品，鼠抗β-Actin為美國Santa Cruz公司產(chǎn)品，熒光二抗(羊抗兔)為武漢博士德公司產(chǎn)品，c-Met 為Genscript公司產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 用含血清濃度15%的高糖培養(yǎng)基DMEM培養(yǎng) Hela 細胞，細胞放入 37°C、 5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，當(dāng)細胞生長至貼壁達80%以上時進行傳代1∶3 操作。在轉(zhuǎn)染中，取對數(shù)生長期的細胞，用0.25%胰酶消化、傳代。將Hela細胞分為3組：空白組、BML-111組、BML-111+Boc-2(c-Met 特異性阻斷劑)組。轉(zhuǎn)染前1 d將Hela細胞接種于4孔板中，細胞融合達到50.0%左右進行轉(zhuǎn)染，按脂質(zhì)體2000TM說明書的步驟進行轉(zhuǎn)染。

1.2.2MTT實驗 細胞經(jīng)胰酶消化后，按每孔104個細胞的量將細胞懸液接種到 96 孔板中，每孔100 μl。培養(yǎng)24 h加入100 μg/L的BML-111、100 μg/L 的BML-111和100 μg/L的Boc-2，一組復(fù)孔數(shù)量為3個，對照組是沒有血清的培養(yǎng)基。培養(yǎng)時間為 24 h，之后將5 μg/L 3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT)添加到各組當(dāng)中，再培養(yǎng)4 h，通過酶聯(lián)免疫檢測儀對所有孔的光密度值進行測量，算出細胞存活率。細胞存活率=(實驗組OD-空白組OD)/(對照組OD-空白組OD)×100%。

1.2.3細胞侵襲與轉(zhuǎn)移實驗 采用基底膠檢測細胞侵襲能力，采用轉(zhuǎn)移小室檢測細胞轉(zhuǎn)移能力，溶解基底膠(1∶9 稀釋)，侵襲與轉(zhuǎn)移小室上層每孔加入50 μl 膠。細胞轉(zhuǎn)染48 h后進行消化，取5×104個細胞進行離心，去上清，將200 μl無血清培養(yǎng)基重懸細胞，在上層小室內(nèi)添加侵襲與轉(zhuǎn)移小室。下層小室加入完全培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h，進行固定染色。在轉(zhuǎn)移檢測中，轉(zhuǎn)移小室不鋪基底膠，其余步驟參照基底膠檢檢測。

1.2.4Western blot 實驗 采用Western blot 免疫印跡法檢測 NF-κB、c-Met、P53的蛋白水平。細胞刺激完畢后，經(jīng)裂解液裂解提取全細胞蛋白，計算上樣量，保持各組上樣蛋白質(zhì)量的一致。經(jīng)SDS-PAGE膠分離后，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，選擇 50 g/L脫脂奶粉緩沖封閉液封閉1 h，再將上文提到的蛋白的一抗4℃孵育過夜，洗膜后加入二抗，37℃孵育1 h，洗膜后用增強化學(xué)發(fā)光試劑洗片曝光。以目的蛋白與β-actin的相對比值代表目的蛋白的表達水平。

2 結(jié)果

2.1細胞存活率對比 BML-111組的細胞存活率(0.32±0.11)顯著低于空白組(0.86±0.23，P<0.05)，而BML-111+Boc-2組的細胞存活率(0.45±0.22)高于BML-111組(P<0.05)。

2.2Hela細胞遷移與侵襲能力對比 Hela細胞轉(zhuǎn)染48 h 后，BML-111的加入能抑制Hela細胞的遷移與侵襲能力(P<0.05)，而Boc-2的加入也能抵抗BML-111的抑制作用(P<0.05)，見表1。

2.3NF-κB、c-Met、P53表達對比 我們采用Western blot 技術(shù)檢測各組間蛋白表達的差異，BML-111的加入能促進P53的表達，抑制NF-κB、c-Met 的表達(P<0.05)；而加入Boc-2處理后， NF-κB、c-Met、P53表達較BML-111組對比也有明顯差異(P<0.05)，見圖1。

GroupsMigration abilityInvasive abilityBlank group6.23±1.487.81±1.30BML-111 group1.89±1.111)2)2.11±1.741)2)BML-111+Boc-2 group2.81±1.411)3.81±1.611)

Note：Compared with blank group，1)P<0.05;compared with BML-111+Boc-2 group，2)P<0.05.

圖1 三組 Hela 細胞的NF-κB、c-Met、P53蛋白表達量

3 討論

宮頸癌是女性最常見的婦科腫瘤，占女性腫瘤發(fā)病率的前3位之列。目前宮頸癌的治療主要是采用手術(shù)和放化療綜合治療的方法，但是很難降低患者的預(yù)后5年死亡率，為此如何改進治療方法具有重要意義[10]。當(dāng)前慢性炎癥與腫瘤密切的相關(guān)性得到了臨床關(guān)注，機體受到慢性炎癥的刺激后，腫瘤易感性會提高，長時間通過抗炎藥治療，部分腫瘤的發(fā)病幾率會減小[11]。從機制上分析，感染造成的慢性炎癥會導(dǎo)致宮頸上皮和宮頸管內(nèi)膜的微小潰瘍，DNA受損的自由基就會出現(xiàn)，對細胞分化與增殖起到誘導(dǎo)作用，誘發(fā)腫瘤的形成[12]。

脂氧素是第一個被發(fā)現(xiàn)的內(nèi)源性抗炎物質(zhì)，脂氧素在許多感染性疾病中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用，可減輕炎性損傷，降低死亡率[13]。基礎(chǔ)研究表明脂氧素能夠抑制人臍靜脈內(nèi)皮細的血管生成[14]。以往因脂氧素的半衰期較短、容易降解等特點，當(dāng)前在臨床上應(yīng)用比較多見的為脂氧素類似物BML-111，其能使荷瘤小鼠腫瘤組織中的巨噬細胞和白細胞的浸潤受到限制，肝癌發(fā)病速度會減緩[15]。還有研究發(fā)現(xiàn)脂氧素 A4能通過抑制 G0/G1 期巨噬細胞來抑制 LPS 誘導(dǎo)的細胞增殖，其抑制作用可能依賴于 NF-κB 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[16]。本研究表明BML-111添加后，會對Hela細胞的增殖、遷移和侵襲水平產(chǎn)生顯著的限制效果(P<0.05)，而Boc-2的加入有利于抵抗BML-111的抑制作用(P<0.05)，也說明BML-111具有抑癌作用。 脂氧素是花生四烯酸在脂加氧酶的作用下，合成于機體內(nèi)部的產(chǎn)物，在炎癥發(fā)病階段，它利用跨細胞的方式出現(xiàn)[17]。在靜息環(huán)境中，NF-κB和κB抑制蛋白(IκB)在細胞漿內(nèi)結(jié)合，細胞遭遇炎癥、缺氧等刺激之后，IκB磷酸化降解，NF-κB和它的分離、轉(zhuǎn)位機制就會發(fā)生，并在細胞核內(nèi)被激活，然后使它下游各種腫瘤基因的表達水平被提升，如P53[18]。癌細胞可通過受體依賴和非依賴機制觸發(fā)異常的c-Met信號，c-Met受體編碼基因c-Met是一個新的不同于已知癌基因RAS家族的轉(zhuǎn)化基因，c-Met 在上皮起源的細胞內(nèi)正常表達，但是在乳腺癌、胰腺癌、甲狀腺癌、腎細胞癌、卵巢癌等癌組織中過度表達[19]。c-Met的過度表達促使宮頸組織發(fā)生上皮內(nèi)瘤變，能誘發(fā)宮頸癌的發(fā)生；并且c-Met可激發(fā)腫瘤細胞間相互作用、基質(zhì)黏附、細胞遷移、侵襲和血管生成[20,21]。本研究顯示BML-111的加入能促進P53的表達，抑制NF-κB、c-Met的表達(P<0.05)；而加入Boc-2處理后， NF-κB、c-Met、P53表達較BML-111組也有明顯差異(P<0.05)，顯示出脂氧素受體激動劑BML-111可以負調(diào)節(jié)c-Met誘導(dǎo)的反應(yīng)，降低c-Met的表達，能抑制細胞遷移與侵襲。

總之，BML-111可以對Hela細胞遷移、增殖與侵襲進行有效抑制，其機制可能是通過下調(diào)NF-κB、c-Met的表達來實現(xiàn)的。