張峰波 員 靜 朱玥潔 龐楠楠 安夢婷 閆 芳 丁劍冰

(新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，烏魯木齊830011)

棘球蚴病(echinococcosis) 是一種經(jīng)消化道感染棘球絳蟲的蟲卵以及幼蟲后導(dǎo)致的一種慢性寄生蟲病[1-3]。泡球蚴(E.multilocularis)主要寄生在人體的肝臟，其對肝組織的損害主要是機(jī)械性擠壓、毒素刺激反應(yīng)以及對肝的直接侵蝕，對肝組織有嚴(yán)重的破壞性，且對肝組織的破壞范圍廣[4]。泡球蚴感染晚期可引起宿主肝衰竭、肝昏迷、門靜脈高壓并發(fā)消化道大出血甚至導(dǎo)致宿主死亡，對宿主危害極大[5]。E.multilocularis幼蟲在肝內(nèi)像腫瘤一樣，以多泡性出芽方式浸潤生長，感染者出現(xiàn)癥狀已是晚期，常常無法手術(shù)治療，感染者病死率高達(dá)95%，因此泡球蚴病(Alveolar echinococcosis，AE)被認(rèn)為是最致命的蠕蟲感染之一，又被稱為“蟲癌”[6]。

泡球蚴在感染人或動物后，在宿主體內(nèi)長期生存，造成一系列免疫應(yīng)答改變[7,8]。這需要主動的對宿主免疫系統(tǒng)進(jìn)行調(diào)節(jié)，以逃避不利于其生存的免疫應(yīng)答反應(yīng)[9,10]。泡球蚴和宿主之間能夠互相識別對方的免疫調(diào)節(jié)信號。一方面宿主會針對泡球蚴釋出的大量蛋白產(chǎn)生免疫應(yīng)答，來限制泡球蚴的生長。另一方面泡球蚴也會通過一系列的調(diào)節(jié)機(jī)制來逃避宿主對其有效的免疫應(yīng)答，使之既不被宿主免疫系統(tǒng)清除，又能讓宿主的免疫病理反應(yīng)降到最低的程度，在這些調(diào)節(jié)機(jī)制中免疫調(diào)節(jié)占據(jù)重要地位[11]。

Tim-3(T cell immunoglobulin and mucin domain containing molecule 3,Tim-3)是Tim家族激活誘導(dǎo)的抑制性受體，主要表達(dá)在分化成熟的Th1細(xì)胞上[12]。近期發(fā)現(xiàn)在血吸蟲感染中，Tim-3高表達(dá)于Th1細(xì)胞，可導(dǎo)致Th1細(xì)胞凋亡，負(fù)性調(diào)節(jié)Th1/Th2細(xì)胞，導(dǎo)致血吸蟲長期寄生于宿主[13,14]。近年來，研究人員同樣發(fā)現(xiàn)，瘧疾的慢性化也與Tim-3密切相關(guān)[15]。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，Tim-3在細(xì)粒棘球蚴感染患者中高表達(dá)[16,17]，但是Tim-3在泡球蚴感染免疫中的作用還不是太清楚，在泡球蚴感染中尚未見相關(guān)報道。因此本研究建立了泡球蚴感染動物模型，檢測Tim-3 與Th1、Th2相關(guān)細(xì)胞因子為泡球蚴感染后機(jī)體的免疫狀態(tài)及相關(guān)機(jī)制研究提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動物 選取30只SPF級BALB/c小鼠，所有小鼠均為6周齡雌性小鼠、體重約(20±2)g，購于新疆醫(yī)科大學(xué)動物中心，動物模型制作及飼養(yǎng)在新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物科學(xué)研究部。本研究所涉及的所有實(shí)驗(yàn)內(nèi)容均已通過新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會審查(20160222-11)。

1.1.2試劑 流式抗體抗鼠CD3-PE-Cy7、抗鼠CD4-PE-Cy5和抗鼠Tim-3-PE抗體、淋巴細(xì)胞分離液購自Solarbio公司。RPMI1640培養(yǎng)液購自Thermo Fishers公司。CBA試劑盒購自BD公司。

1.2方法

1.2.1泡球蚴感染動物模型的建立 泡球蚴感染的長爪沙鼠感染90 d后，頸椎脫臼處死小鼠，用無菌鑷子剪刀開腹，分離泡球蚴組織，將泡球蚴組織剪碎，經(jīng)篩網(wǎng)研磨過濾，用生理鹽水反復(fù)漂洗，直到洗液清亮，棄去上清取原頭蚴沉淀物，加入含雙抗的生理鹽水，顯微鏡下計數(shù)，調(diào)整原頭蚴懸液濃度至2 000個原頭蚴/ml懸液，用于注射動物。實(shí)驗(yàn)組小鼠左下腹腔注射200 μl原頭蚴懸液，對照組小鼠相同部位注射等量生理鹽水，接種后普通飼養(yǎng)。

1.2.2脾臟淋巴細(xì)胞分離 在無菌培養(yǎng)皿中加入RPMI1640約4 ml，將小鼠脾臟取出后用研磨棒充分研磨，用200目濾網(wǎng)過濾混懸液并收集到15 ml的離心管中；另一15 ml的離心管中加入3～4 ml淋巴細(xì)胞分離液(Ficoll)，將上一15 ml離心管中的脾細(xì)胞懸液緩慢疊加于Ficoll上；水平離心機(jī)室溫離心，2 500 r/min，10 min；取出離心管觀察分層，用移液器緩慢吸出中間呈現(xiàn)白色云霧狀的淋巴細(xì)胞層(旋轉(zhuǎn)吸取)至新15 ml試管中，然后用無菌PBS液或RPMI1640稀釋至10 ml，將細(xì)胞懸起，洗滌，3 000 r/min，5 min，棄上清；加入1 ml PBS，重懸細(xì)胞后移至1.5 ml Ep管中；混勻后吸取2 μl細(xì)胞懸液加入98 μl PBS，計數(shù)儀計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×107個/ml。

1.2.3流式細(xì)胞技術(shù)檢測Tim-3的表達(dá)水平 取100 μl 細(xì)胞懸液放入流式管中，加入抗CD3-PE-Cy7、抗CD4-PE-Cy5和抗Tim-3-PE抗體各5 μl，4℃避光 20 min；然后，加入2 ml PBS洗滌，1 000 r/min，5 min，棄上清；加入400 μl PBS重懸細(xì)胞，上機(jī)檢測。首先用前向角散射(Forward Scatter， FS)和側(cè)向角散射(Side Scatter，SS)分選淋巴細(xì)胞，然后用SS和CD3-PE-Cy7分選T淋巴細(xì)胞，最后標(biāo)記CD4-PE-Cy5和Tim-3-PE選出CD4+Tim-3+T細(xì)胞，加入破膜劑，室溫下避光孵育15 min。加入Mouse-IFN-γ-APC抗體，Mouse-IL-4-FIFC抗體，并且設(shè)立Mouse-IgG-PE抗體作為同型對照管，用Flowjo軟件分析數(shù)據(jù)。

1.2.4CBA試劑盒血清樣本中細(xì)胞因子水平的檢測 制備細(xì)胞因子標(biāo)準(zhǔn)品：將標(biāo)準(zhǔn)品小球移到15 ml離心管中，并標(biāo)記該管為最高濃度標(biāo)準(zhǔn)品；用2 ml實(shí)驗(yàn)稀釋液重懸標(biāo)準(zhǔn)品，重懸后的標(biāo)準(zhǔn)品溶液需室溫下平衡15 min；取9根12×75 mm流式上樣管，梯度稀釋的倍數(shù)1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128、1∶256；每管各加300 μl實(shí)驗(yàn)稀釋液，從最高濃度標(biāo)準(zhǔn)品管取300 μl液體到1∶2 管吹打混勻，從1∶2 管取300 μl液體到1∶4管，依此類推，直到1∶256 管；僅可用槍吹打混勻，不可渦旋；混合捕獲微球，充分渦旋混勻，每個實(shí)驗(yàn)管都加入50 μl；稀釋樣本，樣本管中每管加入50 μl待測樣本；標(biāo)準(zhǔn)品管中每管加入50 μl梯度稀釋好的標(biāo)準(zhǔn)品；所有實(shí)驗(yàn)管中都加入50 μl人細(xì)胞因子PE檢測試劑，室溫避光孵育3 h；加入1 ml洗液，200 r/min離心5 min，小心吸去上清；加300 μl洗液，重懸微球，上機(jī)檢測。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，以均數(shù)P表示，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)、單因素方差分析和相關(guān)性分析對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行比較分析，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1泡球蚴感染小鼠血清IFN-γ和IL-4水平 為研究不同時期正常小鼠和泡球蚴感染小鼠血清IFN-γ水平的變化，本實(shí)驗(yàn)通過制備細(xì)胞因子標(biāo)準(zhǔn)品，檢測小鼠樣本IFN-γ的濃度。結(jié)果顯示感染小鼠血清IFN-γ水平(9.81±2.17)pg/ml， 明顯高于正常對照組(2.51±0.76)pg/ml，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

圖1 各組血清中IFN-γ和IL-4水平及IFN-γ/IL-4比值

圖2 各組小鼠脾細(xì)胞CD4+Tim-3+T細(xì)胞的水平

同樣的方法檢測泡球蚴感染小鼠血清中IL-4水平，正常對照組IL-4水平為(2.27±0.81)pg/ml，泡球蚴感染小鼠血清IL-4水平為(28.44±7.45)pg/ml。泡球蚴感染小鼠血清中IL-4水平高于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見圖1。

2.2FCM檢測Tim-3在泡球蚴感染小鼠脾臟中表達(dá) 脾細(xì)胞懸液經(jīng)勻漿，密度梯度法分離出單個核細(xì)胞，用FCM檢測，先在FS、SS設(shè)門選出淋巴細(xì)胞，再以SS和CD3陽性設(shè)門選出T淋巴細(xì)胞，進(jìn)一步選擇CD4+Tim-3+T細(xì)胞，分析CD4+Tim-3+T細(xì)胞百分率。FCM結(jié)果顯示：泡球蚴感染小鼠脾CD4+Tim-3+T細(xì)胞水平為(40.19±6.31)%，對照組為(2.52±0.77)%。泡球蚴感染小鼠脾CD4+Tim-3+T細(xì)胞水平明顯高于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，見圖2。泡球蚴感染小鼠脾中Th1細(xì)胞Tim-3的表達(dá)水平高于正常對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，與正常對照組相比，泡球蚴感染小鼠脾中Th2細(xì)胞Tim-3的表達(dá)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見圖3。

圖3 各組小鼠脾細(xì)胞Tim-3+Th1、Tim-3+Th2細(xì)胞的水平

圖4 Th1和Th2細(xì)胞上表達(dá)Tim-3在與IFN-γ和IL-4相關(guān)性分析

2.3泡球蚴感染小鼠脾臟Tim-3對Th1和Th2細(xì)胞功能的影響 為了發(fā)現(xiàn)Th1和Th2細(xì)胞上Tim-3對Th1和Th2細(xì)胞功能的關(guān)系，本研究進(jìn)一步對Th1和Th2細(xì)胞上Tim-3與IFN-γ、IL-4進(jìn)行了相關(guān)分析。研究發(fā)現(xiàn)，Th1細(xì)胞上Tim-3與IL-4呈負(fù)相關(guān)，而Th2細(xì)胞上Tim-3表達(dá)量極低，并且與IL-4不相關(guān)。見圖5。

3 討論

泡球蚴在宿主體內(nèi)的發(fā)育、繁殖和長期生存均有賴于有效的免疫逃避機(jī)制[18]。本研究發(fā)現(xiàn)泡球蚴感染小鼠IL-4水平明顯增加。泡球蚴感染小鼠脾臟淋巴細(xì)胞Tim-3水平明顯增高，并與IFN-γ呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)，與IL-4成正相關(guān)。

泡球蚴感染小鼠IL-4水平明顯增加，IFN-γ輕度增加。IL-4對于B細(xì)胞、T細(xì)胞、肥大細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和造血細(xì)胞都有免疫調(diào)節(jié)作用[19]。IL-4是T細(xì)胞自身分泌的生長因子，如HT-2細(xì)胞系是一種IL-2依賴細(xì)胞系，IL-4可單獨(dú)維持Th2細(xì)胞的增殖，同時伴有CTL、NK和LAK功能的降低?？梢种艻FN-γ mRNA的轉(zhuǎn)錄和抑制IFN-γ誘導(dǎo)B細(xì)胞產(chǎn)生IgG2a[20]。本研究發(fā)現(xiàn)泡球蚴感染小鼠IFN-γ/IL-4下降，表明泡球蚴感染導(dǎo)致了Th1/Th2免疫平衡的改變，而Th1/Th2平衡改變可能與泡球蚴的免疫逃避有關(guān)。

泡球蚴感染小鼠脾臟淋巴細(xì)胞Tim-3水平明顯增高。最近在MS患者的研究中發(fā)現(xiàn)[21]，通過體外實(shí)驗(yàn)用Tim-3 siRNA來降低CD4+T細(xì)胞Tim-3的表達(dá)，可以促使IFN-γ產(chǎn)生，表明Tim-3的表達(dá)可以下調(diào)IFN-γ的水平，證實(shí)了人Th細(xì)胞Tim-3的表達(dá)可以調(diào)控IFN-γ的分泌。近年來一些寄生蟲感染的研究發(fā)現(xiàn)Tim-3/Galectin-9參與其中的免疫調(diào)控。血吸蟲感染的小鼠中檢測到大量的Tim-3+T細(xì)胞，且Tim-3+T細(xì)胞的數(shù)量與瘧原蟲在宿主體內(nèi)的蟲荷呈正相關(guān)。隨著體內(nèi)寄生蟲的清除，Tim-3+T細(xì)胞的數(shù)量出現(xiàn)相應(yīng)減少，提示Tim-3在血吸蟲感染引起的宿主病理改變中有很重要的作用。為了探討Tim-3蛋白是否與泡球蚴病發(fā)病相關(guān)，本研究檢測了Tim-3蛋白在正常小鼠和泡球蚴感染小鼠脾臟淋巴細(xì)胞的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)泡球蚴感染組Tim-3表達(dá)水平明顯增高，提示Tim-3在泡球蚴感染的發(fā)生發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用。

為了探討Tim-3 與Th1和Th2的關(guān)系，本研究檢測了Th1和Th2細(xì)胞表面Tim-3的表達(dá)，同時檢測小鼠外周血IFN-γ和IL-4水平，同時進(jìn)行了Th1、Th2細(xì)胞表面Tim-3表達(dá)分別與IFN-γ和IL-4的Pearson相關(guān)分析。開展Th1和Th2細(xì)胞表面Tim-3的表達(dá)與相關(guān)細(xì)胞因子分析，發(fā)現(xiàn)Th1上Tim-3表達(dá)與IFN-γ具有更好的負(fù)性相關(guān)性，而Th2細(xì)胞表面Tim-3與IL-4不相關(guān)。據(jù)此推測，在泡球蚴感染過程中，Tim-3可能參與了Th1/Th2平衡改變，這種平衡的改變可能是通過下調(diào)Th1免疫應(yīng)答，影響Th1/Th2免疫應(yīng)答平衡，抑制免疫應(yīng)答，促使泡球蚴的免疫逃避。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)泡球蚴感染小鼠脾臟淋巴細(xì)胞Tim-3以及外周血IL-4水平增高，IFN-γ增高不明顯，可能是Tim-3參與Th1/Th2免疫失衡，促進(jìn)了泡球蚴感染的發(fā)展，有效地控制Tim-3的水平可能成為治療泡球蚴感染的一個新靶點(diǎn)。