高勇強(qiáng) 黎 麗 胡 麗 梁 瑜 曹勁松 肖建華

(特殊病原體防控湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南華大學(xué)病原生物學(xué)研究所,衡陽(yáng)421001)

血吸蟲病(Schistosomiasis)是一種呈世界性分布、嚴(yán)重危害人類健康的人獸共患寄生蟲病[1]。在血吸蟲感染小鼠模型中，既有以Th1細(xì)胞為主的保護(hù)性免疫應(yīng)答，又有以Th2細(xì)胞為主的病理性免疫應(yīng)答，兩者之間維持著動(dòng)態(tài)的免疫平衡[2,3]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，在荷瘤小鼠骨髓、脾臟、血液和腫瘤組織,以及腫瘤患者外周血和腫瘤組織中，廣泛存在著一群髓系來源抑制細(xì)胞(Myeloid-derived suppressor cells，MDSCs)，這些細(xì)胞來源于骨髓祖細(xì)胞和未成熟髓細(xì)胞，形態(tài)幼稚，以幼稚粒細(xì)胞(MDSC-G)和幼稚單核細(xì)胞(MDSC-M)為主，其共同的表面標(biāo)志為Gr-1+CD11b+，具有強(qiáng)大的免疫抑制和廣泛的免疫調(diào)節(jié)功能，如抑制CD4+T細(xì)胞增殖和抗原特異性CD8+T細(xì)胞分泌IFN-γ等，與腫瘤免疫逃逸和免疫耐受密切相關(guān)[4,5]。在寄生蟲感染中，有關(guān) MDSCs 的研究，近幾年也有少量報(bào)道[6,7]。例如弓形蟲、克氏錐蟲、碩大利什曼原蟲和牛帶絳蟲感染宿主后，宿主體內(nèi) MDSCs 大量增殖，肺部、外周血液和腹腔積液中 MDSCs 細(xì)胞數(shù)量也明顯增多，且呈現(xiàn)抑制宿主的免疫應(yīng)答的作用。為了研究在日本血吸蟲感染小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生的 MDSCs 細(xì)胞是否具有免疫抑制功能及其作用機(jī)制，我們通過構(gòu)建血吸蟲感染小鼠模型來研究MDSCs對(duì)血吸蟲感染的免疫抑制作用和探討可能的作用機(jī)制，為血吸蟲防治探索新的作用靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料 60只6～8周，18～22 g，SPF級(jí)飼養(yǎng)的健康BALB/c小鼠，購(gòu)自長(zhǎng)沙史萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。血吸蟲尾蚴陽(yáng)性釘螺購(gòu)自岳陽(yáng)市血吸蟲病防治研究所。Percp-Cy 5.5 conjugated Rat Anti-Mouse CD11b antibody、APC conjugated Rat Anti-Mouse Gr1 antibody、PE conjugated Rat Anti-Mouse Gr1 antibody，以上抗體購(gòu)自美國(guó)BD Bioscience公司。Anti-biotin-APC、CD4+T cell isolation kit(mouse)、CD11b+cell isolation kit(mouse)、CD8+T cell isolation kit(mouse)，以上試劑盒購(gòu)自德國(guó)Miltenyi Biotec公司。Dynabeads Mouse T-Activator CD3/28購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。BD FACSLysing Solution購(gòu)自美國(guó)BD Biosciences公司。TaqMan?IL-10、IL-4、精氨酸酶Ⅰ(Arginase Ⅰ,AngⅠ)、NOS2、IL-13、IFN-γ、TNF-α molecule probe均購(gòu)自美國(guó)Applied Biosystems公司。

1.2方法

1.2.1日本血吸蟲感染小鼠模型的構(gòu)建 60只BALB/c小鼠隨機(jī)分為安慰劑組(無尾蚴的生理鹽水，10只)，正常對(duì)照組(10只小鼠)和感染組(尾蚴感染組40只)；采用尾蚴腹部敷貼法構(gòu)建日本血吸蟲病小鼠模型。

1.2.2流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)模型小鼠體內(nèi)各個(gè)時(shí)間點(diǎn)MDSCs的動(dòng)態(tài)比例變化 感染組小鼠分別在第2、4、8、12、16、20周等6個(gè)時(shí)間點(diǎn)，采用乙醚吸入麻醉，無菌操作摘取小鼠眼球采血，拉頸處死小鼠，分別取骨髓、肝臟和脾臟組織，研磨過濾制備單細(xì)胞懸液，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠體內(nèi)MDSCs的比例變化。

1.2.3模型小鼠骨髓MDSCs粒系和單核系亞群的免疫磁珠分選及形態(tài)學(xué)分析 將模型小鼠處死后，無菌操作游離小鼠的股骨和脛骨，剪斷兩端骨骺，用staining buffer 沖洗出骨髓，制備單細(xì)胞懸液。取100 ml staining buffer 重懸106單細(xì)胞，加入CD11b抗體和Gr1抗體，然后用流式細(xì)胞儀分析和分選。將流式細(xì)胞儀(BD FACS Aira)分選出的骨髓初始MDSCs亞群分別取50 000個(gè)細(xì)胞進(jìn)行離心涂片，用Wright-Giemsa染色進(jìn)行形態(tài)學(xué)分析。

1.2.4模型小鼠骨髓MDSCs亞群對(duì)CD4+或CD8+T細(xì)胞增殖的影響 流式細(xì)胞儀分選出正常小鼠脾臟的CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞，CFSE法標(biāo)記，將從模型小鼠骨髓MDSCs細(xì)胞中分選出的粒系和單核系亞群細(xì)胞分別與其共培養(yǎng)72 h，流式細(xì)胞儀檢測(cè)CFSE染色的增殖峰，以評(píng)價(jià)粒系和單核系兩個(gè)亞群分別抑制T淋巴細(xì)胞增殖的能力。

1.2.5Real-time PCR檢測(cè)模型小鼠骨髓MDSCs亞群相關(guān)細(xì)胞因子及ArgⅠ、NOS2 mRNA的表達(dá) 用實(shí)時(shí)定量PCR法(Real-time PCR)，檢測(cè)IL-4、IL-10、IL-13、IFN-γ、TNF-α、TGF-β1等細(xì)胞因子以及ArgⅠ、NOS2兩種酶在骨髓MDSCs亞群細(xì)胞中的mRNA表達(dá)水平。以GAPDH mRNA的表達(dá)為內(nèi)參照。Real-time PCR引物由上海生工合成，Mouse IL-4：sense 5′-CATGGAGCTGCAGAGACTCTTT-3′，antis-ense 5′-TGCATGATGCTCTTTAGGCTTTC-3′；Mouse IL-10：sense 5′-ATTTGAATTCCCTGGGTGA-GAAG-3′，antisense 5′-CACAGGGGAGAAATCGATGACA-3′； Mouse IL-13：sense 5′-GTCCCTGGTGTTCTTCCT-GATAC-3′，antisense 5′-CAGCACTACAGAGTCGG-TTTCC-3′；Mouse TGF-β：sense 5′-TGATACGCCTGAGTGGCTGTCT-3′，antisense 5′-TTTGCTGTCACA-AGAGCAGTGA-3′；Mouse IFN-γ：sense 5′-GGCACAGTCATTGAAAGCCTAGA-3′，antis-ense 5′-GTCACCATCCTTTTGCCAGTTC-3′；Mouse ArgⅠ：sense 5′-TGTGGTGGCAGAGGT-3′，antisense 5′-GAGGGACGTATAGACG-3′；Mouse NOS2：sense 5′-TCCATGC-TAATGCGAAAG-3′，antisense 5′-ATGCGGAAGTTGTGG-3′；Mouse GAPDH：sense 5′-TGGAGAAACCTGCCAA-GTATGA-3′，antisense 5′-CTGTTGAAGTCGCAGGAG-ACAA-3′。

2 結(jié)果

2.1流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠體內(nèi)MDSCs 正常對(duì)照組小鼠與安慰劑組相比，MDSCs累積無顯著差異，表明外界飼養(yǎng)環(huán)境及安慰劑處理不會(huì)導(dǎo)致小鼠的MDSCs累積(圖1)。而連續(xù)監(jiān)測(cè)日本血吸蟲感染小鼠在第2、4、8、12和16周骨髓、脾臟、肝臟和外周血的MDSCs，可見比例不斷增加，在第8周達(dá)到高峰，至第20周時(shí)仍維持在較高水平(圖2)。

圖1 正常組和安慰劑組小鼠不同組織器官M(fèi)DSCs的比例

2.2日本血吸蟲感染模型小鼠骨髓MDSCs粒系(G)和單核系(M)亞群的免疫磁珠分選 通過磁珠分選法從小鼠骨髓MDSCs中分離純化CD11b細(xì)胞后，并運(yùn)用流式細(xì)胞技術(shù)分析純化細(xì)胞中CD11b和Gr1細(xì)胞含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)所分離的細(xì)胞中MDSCs細(xì)胞含量約為99%，其中CD11b+Gr1+雙陽(yáng)性細(xì)胞占比94.5%。進(jìn)一步通過ly6C抗體分選出CD11b+Gr1+亞群中單核系MDSCs(CD11b+Gr1+Ly6C+)亞群(M亞群)和粒系MDSCs(CD11b+Gr1+Ly6C-)亞群(G亞群)(圖3)。

圖3 小鼠骨髓MDSCs粒系(G)和單核系(M)亞群的磁珠分選

圖2 日本血吸蟲感染模型小鼠體內(nèi)MDSCs的動(dòng)態(tài)比例變化

圖4 模型小鼠骨髓MDSCs亞群細(xì)胞的形態(tài)學(xué)分析(Bar=50 μm)

圖5 不同濃度MDSCs亞群對(duì)CD4+T和CD8+T細(xì)胞的增殖抑制作用

圖6 血吸蟲感染模型小鼠中相關(guān)細(xì)胞因子和酶基因的mRNA表達(dá)

2.3日本血吸蟲感染模型小鼠骨髓MDSCs粒系和單核系亞群細(xì)胞的形態(tài)學(xué)鑒定 將分離純化的模型小鼠骨髓MDSCs亞群用Wright-Giemsa染色，鏡下顯示G亞群細(xì)胞體積較大，表現(xiàn)為環(huán)形核和分葉核的幼稚粒細(xì)胞，核質(zhì)較大；M亞群細(xì)胞體積較小，表現(xiàn)為圓形核和橢圓形核的幼稚單核細(xì)胞，核質(zhì)較大。見圖4。

2.4血吸蟲感染模型小鼠在第8周時(shí)骨髓MDSCs粒系和單核系亞群對(duì)CD4+T和CD8+T細(xì)胞的增殖抑制 采用細(xì)胞內(nèi)熒光染料CFSE標(biāo)記正常小鼠脾CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞，預(yù)先用Dynabeads CD3/28-T-Activator 活化CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞，取血吸蟲感染模型小鼠體內(nèi)MDSCs在第8周時(shí)的累積高峰，與骨髓MDSCs粒系(BM-G)和單核系(BM-M)亞群共培養(yǎng)，72 h后，流式檢測(cè)CFSE染色的增殖峰，發(fā)現(xiàn)骨髓MDSCs細(xì)胞中G亞群和M亞群均能不同程度地抑制CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞的增殖；并且隨著共培養(yǎng)體系中G細(xì)胞和M細(xì)胞數(shù)量比例增加而抑制作用逐漸增強(qiáng)(圖5)。

2.5血吸蟲感染模型小鼠在第8周時(shí)骨髓MDSCs的相關(guān)細(xì)胞因子及ArgⅠ、NOS2兩種酶的實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè) Real-time PCR方法檢測(cè)模型小鼠在第8周時(shí)骨髓MDSCs 細(xì)胞的抑制性細(xì)胞因子及NOS2、ArgⅠ的基因表達(dá)水平。與正常組對(duì)照，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖6)。

3 討論

在各種不同的腫瘤或感染動(dòng)物模型中，骨髓、血液、脾臟及腫瘤部位均會(huì)有MDSCs的增加[8，9]，在寄生蟲感染中，有關(guān) MDSCs 的研究，近幾年也有少量報(bào)道[6，7]。為此本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了日本血吸蟲感染BALB/c 小鼠模型，來研究MDSCs在寄生蟲感染中的免疫抑制作用。本研究分離制備出模型小鼠骨髓、脾、肝、血4種組織的單細(xì)胞懸液，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)MDSCs在第2、4、6、8、12、16、20周的動(dòng)態(tài)比例變化，與對(duì)照組正常小鼠骨髓、脾、肝、血液等組織中的CD11b+Gr-1+表型的MDSCs細(xì)胞相比較；發(fā)現(xiàn)在4種組織中MDSCs細(xì)胞均有不同比例的升高，尤其在血吸蟲病的慢性期(肉芽腫病變期)升高顯著。表明在血吸蟲感染病程中，骨髓MDSCs大量積聚到外周器官參與抑制機(jī)體免疫反應(yīng)，避免過度免疫反應(yīng)對(duì)重要臟器的損害，以實(shí)現(xiàn)對(duì)機(jī)體的保護(hù)。

為了進(jìn)一步認(rèn)識(shí)MDSCs細(xì)胞，本研究對(duì)分選出的MDSCs細(xì)胞進(jìn)行了形態(tài)學(xué)分析，通過免疫磁珠分離方法分離出的CD11b+細(xì)胞中約有97%共表達(dá)CD11b和Gr-1表型(圖1)。形態(tài)學(xué)上可看到這些細(xì)胞形態(tài)大小不一，胞質(zhì)呈淡藍(lán)色，細(xì)胞核呈分葉形、環(huán)形、橢圓形和多形核(圖2)。再根據(jù)Ly6G的表達(dá)不同分選出單核系MDSCs(CD11b+Gr1+Ly6G-)亞群(M亞群)和粒系MDSCs(CD11b+Gr1+Ly6G+)亞群(G亞群)。采用流式細(xì)胞儀分選分離出模型小鼠骨髓MDSCs的兩個(gè)亞群，分別將其與CD4+T或CD8+T細(xì)胞共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)G細(xì)胞亞群與M細(xì)胞亞群均可以抑制CD4+T或CD8+T淋巴細(xì)胞增殖，且抑制作用呈劑量依賴性，以G細(xì)胞亞群的抑制作用更強(qiáng)大，表明因感染因素刺激導(dǎo)致體內(nèi)增加的骨髓MDSCs在體外也具有免疫抑制作用。

既往研究顯示，病理?xiàng)l件下MDSCs發(fā)揮免疫抑制作用的機(jī)制是其能夠分泌和產(chǎn)生大量TGF-β、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(Inducible nitric oxide synthase,iNOS)和ArgⅠ，以及通過細(xì)胞間相互作用促進(jìn)T細(xì)胞凋亡和CD3ζ的表達(dá)，妨礙T細(xì)胞活化增殖等功能[10-12]。此外，MDSCs還可以分泌IFN-γ、IL-4、IL-13和IL-10等細(xì)胞因子，這些細(xì)胞因子可以調(diào)節(jié)機(jī)體Th1細(xì)胞向Th2分化從而輔助MDSCs營(yíng)造抑制性環(huán)境，另外還可增加NOS2、ArgⅠ和血紅素氧化酶1(HO-1)的表達(dá)，從而消耗機(jī)體內(nèi)環(huán)境的精氨酸并產(chǎn)生NO及其他代謝產(chǎn)物，最終抑制T細(xì)胞的功能[13-15]。為此本研究也檢測(cè)了血吸蟲感染模型小鼠體內(nèi)的骨髓MDSCs的相關(guān)細(xì)胞因子IL-4、IL-10、IL-13、IFN-γ及TGF-β1的mRNA表達(dá)水平，同時(shí)檢測(cè)了NOS2和ArgⅠ的mRNA表達(dá)水平。Real-time PCR檢測(cè)結(jié)果顯示各個(gè)細(xì)胞因子及兩種酶均較對(duì)照組的正常小鼠有不同程度的升高，其差異有顯著性，表明上述因素參與了模型小鼠骨髓MDSCs的免疫抑制作用。

本研究通過構(gòu)建日本血吸蟲感染小鼠模型，研究了MDSCs在寄生蟲感染領(lǐng)域中的作用。MDSCs是維持機(jī)體免疫平衡的因素之一，了解其亞群的分化和作用機(jī)制將有助于制定寄生蟲感染的防治策略。