章平衡 劉 健 縱瑞凱 黃 旦 萬(wàn) 磊

(安徽中醫(yī)藥大學(xué)，合肥230038)

類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis,RA)是以關(guān)節(jié)滑膜的慢性炎癥為基礎(chǔ)病理變化的一種自身免疫性慢性疾病，隨著疾病的逐漸進(jìn)展，會(huì)導(dǎo)致血管翳形成以及軟骨和軟骨下骨破壞[1]。RA如不積極正規(guī)的診治，將會(huì)慢慢發(fā)展侵蝕，導(dǎo)致骨及關(guān)節(jié)的不可逆轉(zhuǎn)的破壞和畸形，最終導(dǎo)致功能的喪失。該病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程相當(dāng)復(fù)雜，至今病因病機(jī)尚不明確，但其炎癥發(fā)生過(guò)程系與細(xì)胞因子、趨化因子等多因素密切相關(guān)[2，3]。目前有研究發(fā)現(xiàn)血小板活化，釋放大量活性顆粒，如P-選擇素、血小板活化因子(Platelet activating factor，PAF)，血小板α顆粒膜糖蛋白-140(Granule membrane protein 140，GMP-140)、血小板分化抗原40配體(Cluster of differentiation 40 ligand，CD40L)，與RA疾病相關(guān)。它們?cè)隗w內(nèi)發(fā)揮著多重生物學(xué)效應(yīng)，并且在RA炎癥發(fā)生與發(fā)展過(guò)程中相當(dāng)重要[4-7]。黏附斑激酶(Focal adhesion kinase，F(xiàn)AK)是一種胞質(zhì)非受體蛋白酪氨酸激酶，黏附斑復(fù)合物家族一員，它在介導(dǎo)細(xì)胞黏附、增殖等過(guò)程中起重要作用[8,9]，并且FAK的黏著斑非激酶區(qū)(Four-ezrin-radixin-moesin，F(xiàn)ERM)同源區(qū)結(jié)構(gòu)域可以和血小板衍生生長(zhǎng)因子受體的酪氨酸激酶相連,從而介導(dǎo)血小板活化及其下游的相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[10]。在血小板活化過(guò)程中會(huì)導(dǎo)致大量Ca2+內(nèi)流，然后結(jié)合鈣蛋白酶(Calpain)，進(jìn)而水解蛋白激酶、激活蛋白磷酸酶增強(qiáng)去磷酸化作用從而抑制血小板活化[11]。因此，F(xiàn)AK/Calpain信號(hào)通路在血小板的活化過(guò)程中起著重要作用。為了探討血小板活化在類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎發(fā)病中的作用機(jī)制，本研究觀察佐劑關(guān)節(jié)炎大鼠血小板及FAK/Calpain信號(hào)通路的影響,現(xiàn)將研究結(jié)果作簡(jiǎn)要闡述。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 40只雄性SD大鼠，體重(170±10)g。在保持陰暗、安靜的清潔級(jí)動(dòng)物房飼養(yǎng)，溫度17～25℃，相對(duì)濕度45%～75%，通風(fēng)換氣每小時(shí)8～12次。

1.1.2藥品及試劑 弗氏完全佐劑(FCA)由美國(guó)Sigma公司出品；IL-6、IL-8、MMP-9檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)R&D公司；CD40L、CD147、GPⅡb/Ⅲa試劑盒購(gòu)自美國(guó)eBioscience公司； PCR 試劑盒(No：208054)購(gòu)自Qiagen公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號(hào)：K1622)購(gòu)自Thermo Scientific公司；引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成；兔抗FAK、p-FAK、Calpain1、Calpain2單克隆抗體購(gòu)自Bioworld公司；β-actin鼠抗單克隆抗體購(gòu)自北京中杉公司。

1.2方法

1.2.1模型復(fù)制分組 將40只SD雄性大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,隨機(jī)分為正常對(duì)照組(Normal control,NC,20只)和模型組(Model control,MC,20只),除正常對(duì)照組外,向每只大鼠右足跖皮內(nèi)注射FCA 0.1 ml致炎,復(fù)制成佐劑關(guān)節(jié)炎(Adjuvant arthritis,AA)大鼠模型[12]。

1.2.2大鼠足跖腫脹度、關(guān)節(jié)炎指數(shù)的測(cè)算 造模前1 d、致炎后第48天測(cè)量各組大鼠后足跖的容積,計(jì)算各組大鼠足跖腫脹度[13]。腫脹度E(%)=(Vt-Vn)/Vn×100%(Vn、Vt分別代表造模前后的容積)。關(guān)節(jié)炎指數(shù)(Arthritis index,AI)的計(jì)算，按5級(jí)評(píng)分法評(píng)價(jià),0分:無(wú)紅腫;1分:小趾關(guān)節(jié)紅腫；2分:趾關(guān)節(jié)和足跖腫脹；3分:踝關(guān)節(jié)以下的足爪腫脹;4分:包括踝關(guān)節(jié)在內(nèi)的全部足爪腫脹。根據(jù)未注射佐劑的其余3只肢體的病變程度累積計(jì)分,計(jì)算出AI[14]。

1.2.3IL-6、IL-8、MMP-9測(cè)定 大鼠血清中IL-6、IL-8、MMP-9的測(cè)定：嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)操作測(cè)定IL-6、IL-8、MMP-9的含量。

1.2.4全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀檢測(cè)外周血血小板參數(shù)的表達(dá) 采用Sysmex XT-2000i全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀檢測(cè)外周血血小板參數(shù)PLT、MPV、PCT、PDW。

1.2.5流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)大鼠外周血CD40L、CD147、GPⅡb/Ⅲa的表達(dá) 取大鼠新鮮血液800 μl，按每106個(gè)細(xì)胞/管分別加入抗-鼠CD40L-FITC、CD147-FITC、GPⅡb/Ⅲa-FITC 20、1、1 μl，避光20～30 min；流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD40L、CD147和GPⅡb/Ⅲa 表達(dá)頻率。

1.2.6大鼠滑膜組織FAK/Calpain通路mRNA及蛋白的表達(dá)水平 大鼠滑膜組織FAK、Calpain1、Calpain2 mRNA表達(dá)的測(cè)定：根據(jù)美國(guó)加利福尼亞州Invitrogen公司提供的引物序列號(hào)，使用Primer Primer 5軟件設(shè)計(jì)并分析引物(見(jiàn)表1)。用Trizol提取大鼠滑膜組織中的總RNA，并按照Thermo反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)提供方法進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。熒光實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)體系為10 μl：正、反引物各1 μl及SYBR Green染料5 μl，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2 μl，水補(bǔ)至10 μl。每一組樣品進(jìn)行PCR反應(yīng)時(shí)，用β-actin作為內(nèi)參照，用同一樣品的cDNA和同樣的PCR反應(yīng)條件進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為95℃預(yù)變性5 min,然后按下列循環(huán)條件進(jìn)行擴(kuò)增，95℃變性10 s，退火60℃30 s，循環(huán)40次。

表1半定量PCR引物序列及擴(kuò)增長(zhǎng)度

Tab.1Semi-quantitativePCR-primersequenceandamplificationlength

GenePrimer sequenceLength(bp)β-actinForward:5′-CCCATCTATGAGGGTTACGC-3′150Reverse: 5′-TTTAATGTCACGCACGATTTC-3′FAKForward: 5′-ACACATACACCATGCCCTCA-3′136Reverse: 5′-GCCAAAGCTGGATTCTCTGG-3′Calpain1Forward: 5′-TCGAGTTGTGCCTCTAGACC-3′91Reverse: 5′-GTATTCCAGTTCCGGAGGGT-3′Calpain2Forward: 5′-TCGAGTTGTGCCTCTAGACC-3′121Reverse: 5′-GTCCTTAGTGGGCAGTCTGT-3′

1.2.7大鼠滑膜組織FAK、p-FAK、Calpain1、Calpain2蛋白的表達(dá) 滑膜組織中蛋白質(zhì)，用蛋白裂解液(RIPA液)提取,提取的蛋白質(zhì),用蛋白測(cè)定試劑盒，測(cè)定蛋白濃度，并將濃度調(diào)成2 μg/μl,取出16 μl提取的蛋白液加入4 μl上樣緩沖液(5×),進(jìn)行凝膠電泳,其中分離膠10%,濃縮膠5%。恒壓80 V電泳至分離膠上部，恒壓120 V電泳至分離膠底部；在恒流300 mA，50 min轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上,用5%的脫脂奶粉封閉2 h后,加入FAK抗體屬性為兔抗1∶1 000稀釋?zhuān)籶-FAK抗體屬性為兔抗1∶500 稀釋?zhuān)籆alpain1抗體屬性為兔抗1∶1 000稀釋?zhuān)籆alpain2抗體屬性為兔抗1∶500稀釋,搖床上振搖 2 h 或4℃過(guò)夜,用磷酸鹽緩沖液(PBST)洗滌3次,每次15 min。再加入1∶15 000羊抗鼠IgG-HRP,搖床上振搖1 h，PBST洗滌3次,每次15 min。電化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑顯色、曝光,并用掃描儀進(jìn)行掃描。BANDSCAN軟件對(duì)條帶分析,計(jì)算條帶灰度值,以FAK、p-FAK、Calpain1、Calpain2/β-actin灰度值比值作為滑膜組織FAK、p-FAK、Calpain1、Calpain2蛋白表達(dá)的相對(duì)含量。

2 結(jié)果

2.1大鼠體重(M)、足跖腫脹度(E)、關(guān)節(jié)炎指數(shù)(AI)的變化 在造模前兩組大鼠的體重差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；造模后，與NC組比較，MC組大鼠致炎48 d體重下降明顯；致炎第48天MC組大鼠E、AI顯著升高，見(jiàn)表2。正常組大鼠關(guān)節(jié)滑膜僅有少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，關(guān)節(jié)滑膜表面光滑無(wú)凸起；MC組大鼠關(guān)節(jié)滑膜有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，少量新生血管形成，關(guān)節(jié)滑膜表面有凸起，見(jiàn)圖1、2。

2.2AA大鼠外周血血小板參數(shù)的變化 與NC組相比，MC組大鼠PLT、PCT顯著升高(P<0.01)，PDW、MPV差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表3。

2.3大鼠外周血血小板相關(guān)指標(biāo)CD40L、CD147、GPⅡb/Ⅲa的變化 兩組各檢測(cè)5只大鼠的外周血血小板相關(guān)指標(biāo)變化，與NC組相比,MC組CD40L、CD147、GPⅡb/Ⅲa表達(dá)升高(P<0.01)，見(jiàn)表4、圖3。

2.4大鼠滑膜組織FAK/Calpain1信號(hào)通路的變化 兩組各檢測(cè)6只大鼠的滑膜組織FAK/Calpain1信號(hào)通路的變化，與NC組相比,MC組FAK mRNA表達(dá)升高，Calpain1、Calpain2 mRNA表達(dá)降低(P<0.05,P<0.01)；MC組FAK、p-FAK蛋白表達(dá)升高，Calpain1、Calpain2蛋白表達(dá)降低(P<0.05,P<0.01)。見(jiàn)表5、圖4。

圖1 大鼠關(guān)節(jié)腫脹對(duì)比

圖2 大鼠關(guān)節(jié)病理切片觀察

GroupsPLT(109)PCT(%)PDW(%)MPV(fl)NC1 005.71±20.810.86±0.1210.15±0.908.42±0.49MC1 434.00±160.511)1.09±0.161)10.20±0.748.40±0.38

Note：Compared with NC group，1)P<0.01.

GroupsM(g)Before theinflammatory 0 dBefore theinflammatory 48 dE(%)Before theinflammatory 18 dBefore theinflammatory 48 dAI(score)Before theinflammatory 12 dBefore theinflammatory 48 dNC179±13.0302±8.881.44±0.107.54±1.700.08±0.280.17±0.38MC184±15.5 254±11.61)29.20±8.461)17.50±4.891) 1.08±0.661) 7.08±0.791)

Note：Compared with NC group，1)P<0.01.

2.5大鼠外周血IL-6、IL-8、MMP-9的變化 與NC組相比,MC組IL-6、IL-8、MMP-9表達(dá)升高(P<0.05,P<0.01)。見(jiàn)表6。

2.6FAK/Calpain1信號(hào)通路指標(biāo)與細(xì)胞因子、血小板活化指標(biāo)及大鼠體重、足跖腫脹度、關(guān)節(jié)炎指數(shù)的相關(guān)性分析 分別檢測(cè)了6只大鼠的FAK/Calpain1信號(hào)通路指標(biāo)與細(xì)胞因子、血小板活化指標(biāo)及大鼠體重、足跖腫脹度、關(guān)節(jié)炎指數(shù)等相關(guān)指標(biāo)，并進(jìn)行了相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)FAK蛋白與CD147、GPⅡb/Ⅲa呈正相關(guān)，p-FAK蛋白與CD40L呈正相關(guān)，Calpain1蛋白與IL-6呈負(fù)相關(guān)，Calpain2蛋白與E呈負(fù)相關(guān)，F(xiàn)AK mRNA與IL-6呈正相關(guān)(P<0.01,或P<0.05)。見(jiàn)表7。

GroupsCD40L(%)CD147(%)GPⅡb/Ⅲa(%)NC47.66±1.2857.51±1.8149.99±2.61MC86.34±0.711)89.23±5.781) 79.01±10.761)

Note：Compared with NC group，1)P<0.01.

圖3 大鼠血小板相關(guān)指標(biāo)CD40L、CD147、GPⅡb/Ⅲa表達(dá)量的流式圖

GroupsmRNAFAKCalpain1Calpain2ProteinFAKp-FAKCalpain1Calpain2NC1.00±0.421.00±0.131.00±0.130.16±0.020.20±0.061.29±0.361.58±0.04MC9.91±0.731)0.23±0.041)0.12±0.021)1.09±0.111)0.80±0.021)0.69±0.071)0.76±0.051)

Note：Compared with NC group，1)P<0.01.

GroupsIL-6IL-8MMP-9NC149.08±10.14138.52±15.7275.96±8.32MC211.36±24.781)235.77±45.391)161.30±27.321)

Note：Compared with NC group，1)P<0.01.

表7FAK/Calpain1信號(hào)通路指標(biāo)與細(xì)胞因子、血小板活化指標(biāo)及大鼠體重、足跖腫脹度、關(guān)節(jié)炎指數(shù)的相關(guān)性分析(r)

Tab.7CorelationanalysisbetweenFAK/Calpain1andcytokinesplaletetactivitionaswellasM,EandAI(r)

IndexmRNAFAKCalpain1Calpain2ProteinsFAKp-FAKCalpain1Calpain2AI0.2960.6920.236-0.366-0.5670.214-0.169E-0.3320.0990.533-0.0280.1670.329-0.9681)IL-60.8192)0.309-0.655-0.3130.164-0.8902)0.646IL-80.1070.3630.021-0.385-0.5120.3720.053MMP-9-0.5750.1940.432-0.559-0.2600.733-0.364CD40L0.0020.4150.5990.1660.8812)0.541-0.096CD147-0.758-0.6490.6630.9331)-0.1830.588-0.176GPⅡb/Ⅲa-0.732-0.4820.7710.9042)-0.2010.578-0.310

Note：1)P<0.01,2)P<0.05.

3 討論

FAK是一種胞質(zhì)非受體蛋白酪氨酸激酶，是黏附斑復(fù)合物家族成員之一，它主要介導(dǎo)細(xì)胞增殖、黏附、遷移及調(diào)控細(xì)胞周期等[15]。Calpain則是鈣激活中性蛋白酶，屬于半胱氨酸蛋白水解酶超家族成員之一。它的表達(dá)水平與重塑細(xì)胞骨架、細(xì)胞凋亡以及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)密切相關(guān)，并在很多自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用。

血小板膜糖蛋白分子(GPⅡb/Ⅲa),在血小板活化的過(guò)程中起著關(guān)鍵的作用[16]。當(dāng)其受某些因素刺激后，導(dǎo)致空間構(gòu)型的變化，會(huì)引起纖維蛋白結(jié)合位點(diǎn)的暴露，則會(huì)誘導(dǎo)血小板膜“內(nèi)-外”的雙向信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，致使FAK發(fā)磷酸化，活化后FAK酪氨酸位點(diǎn)的PKC發(fā)生磷酸化，引起胞內(nèi)骨架蛋白的重排，然后在第二信使或蛋白激酶等介導(dǎo)作用下，不斷整合放大，最終實(shí)現(xiàn)血小板的活化[17-22]。當(dāng)FAK磷酸化活化導(dǎo)致PKC活化后，Ca2+內(nèi)流增加，正常情況下，鈣蛋白酶Calpain會(huì)與大量?jī)?nèi)流的Ca2+相結(jié)合后活化，進(jìn)而水解活化的FAK，發(fā)生一系列的活化磷酸化，從而抑制血小板活化。當(dāng)在機(jī)體功能紊亂的情況下，上述動(dòng)態(tài)平衡被打破，會(huì)導(dǎo)致持續(xù)的血小板活化，產(chǎn)生大量的可溶性CD40L[23]，經(jīng)過(guò)血液循環(huán)，進(jìn)入增生滑膜組織中，促進(jìn)局部炎癥細(xì)胞因子IL-8、IL-6等大量生成，導(dǎo)致RA滑膜炎癥的形成、發(fā)展，甚至引起關(guān)節(jié)軟骨的破壞[24]。另外，當(dāng)血小板被激活，表達(dá)于血小板膜表面CD147的表達(dá)亦會(huì)增多[25-27]。CD147 能夠刺激基質(zhì)成纖維細(xì)胞，產(chǎn)生多種基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)，并且能夠通過(guò)血液循環(huán)，進(jìn)入關(guān)節(jié)滑膜，形成關(guān)節(jié)滑膜炎癥[28]。

本研究結(jié)果顯示，AA大鼠E、AI比正常組明顯升高，血小板活化后表達(dá)產(chǎn)物CD40L、CD147、GPⅡb/Ⅲa表達(dá)水平升高，同時(shí)細(xì)胞因子(IL-6、IL-8、MMP-9)表達(dá)亦明顯升高，表明AA大鼠在關(guān)節(jié)出現(xiàn)炎癥反應(yīng)同時(shí)其體內(nèi)還存在著血小板的活化，表現(xiàn)為血小板活化產(chǎn)物CD40L的大量分泌，以及血小板表面受體CD147和血小板表面膜糖蛋白分子GPⅡb/Ⅲa的高表達(dá)。并且FAK通路活化及Calpain通路抑制的同時(shí)，血小板相關(guān)指標(biāo)(CD40L、CD147、GPⅡb/Ⅲa)、細(xì)胞因子(IL-6、IL-8及MMP-9)的表達(dá)升高，且相關(guān)性分析顯示FAK蛋白與CD147、GPⅡb/Ⅲa呈正相關(guān)，p-FAK蛋白與CD40L呈正相關(guān)，Calpain1蛋白與IL-6呈負(fù)相關(guān)，Calpain2蛋白與E呈負(fù)相關(guān)，F(xiàn)AK mRNA與IL-6呈正相關(guān)。說(shuō)明FAK/Calpain信號(hào)通路的改變，能夠促進(jìn)血小板的活化，增加CD40L、CD147、GPⅡb/Ⅲa的分泌，從而促進(jìn)炎癥細(xì)胞因子IL-6、IL-8及MMP-9的分泌，最終導(dǎo)致滑膜炎癥的發(fā)生發(fā)展。

RA血小板活化的發(fā)病機(jī)制至今還不完全明確，而FAK/Calpain信號(hào)傳導(dǎo)通路的作用環(huán)節(jié)復(fù)雜，在本研究中結(jié)果顯示，抑制FAK的活化,抑制血小板活化產(chǎn)物的分泌，可能會(huì)減輕滑膜炎癥的發(fā)生。為進(jìn)一步明確FAK/Calpain信號(hào)傳導(dǎo)通路的作用靶點(diǎn)，我們將從體外實(shí)驗(yàn)角度深入研究，以更加準(zhǔn)確地闡述其作用機(jī)制。