劉鑫 崔茂盛 張丹 唐佩娟 付永利 張學煒 李千軍*

（1，天津市畜牧獸醫(yī)研究所300381；2，天津農(nóng)學院300380；3，天津市動物疾病預防控制中心300402；4，天津市畜牧總站300402）

隨著我國養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展與種豬聯(lián)合育種工作的需要，人工授精的普及，豬精液品質(zhì)的控制及精液保存稀釋劑日趨成為豬人工授精技術(shù)的核心[1]。就鮮精保存而言，我國大、中型養(yǎng)豬企業(yè)人工輸精所用精液大多來自當天采集，或來自17℃存儲1～2d的精液，如此短的精液存儲時間必將給企業(yè)增加人力、物力和財力負擔，而且豬場用的17℃恒溫箱的溫度極不穩(wěn)定，給精液存儲質(zhì)量造成較大影響。隨著我國生豬市場集約化和規(guī)模化發(fā)展，豬精液高效、長期保存技術(shù)越發(fā)重要。目前市場上價格稍低的豬鮮精17℃保存稀釋劑，保存效果大都不穩(wěn)定（2～5d 不等），而質(zhì)量稍高的17℃保存稀釋劑價格都偏高（14～20 元不等），給生豬養(yǎng)殖企業(yè)帶來較重運行成本。因此，探索和研發(fā)成本低的高倍長效精液17℃保存稀釋劑對生豬產(chǎn)業(yè)健康、快速發(fā)展具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

主要試劑：海藻多糖、果糖（上海源葉生物科技有限公司）、葡萄糖（天津市光復精細化工研究所）、青霉素、鏈霉素（山東魯抗舍里樂藥品有限公司）、碳酸氫鈉、EDTA 等（sigma中國有限公司）、精子快速染液（南京建成生物科技有限公司）。

主要儀器設(shè)備：CASA 計算機自動輔助分析系統(tǒng)，相差顯微鏡（英國）、冰箱（河南新飛電器有限公司）、電熱恒溫水槽（上海精宏實驗設(shè)備有限公司）、電子天平（上海菁海儀器有限公司）。

1.2 精液保存劑的配制

試驗組的藥品為本課題組配制，兩個對照組（對照一和對照二） 均為國內(nèi)著名品牌，按照產(chǎn)品要求進行配制豬精液鮮精保存液。

1.3 精液處理方法

1.3.1 精液采集

采用手握法采集精液，將預熱好的集精杯（35～37℃） 用滅菌濾紙蓋好，收集中間段精液，邊采集邊過濾去除膠狀物。在37℃下用顯微鏡檢查常規(guī)品質(zhì)，精子活力在0.7 以上、無異味、色澤為乳白色的精液，放入保溫瓶采精室備用[2]。

1.3.2 精液稀釋與平衡

精液取回采精室（室溫25℃左右），暗處靜置，測量精液和稀釋液的溫度，確保二者的溫差為0.1～0.3℃。將自制常溫精液保存劑（提前配好） 與對照組均按（保存劑：原精） 2：1 的比例緩慢加入到豬精液中，輕輕上下?lián)u晃，使精液與稀釋液充分接觸，室溫23～25℃下暗處靜置平衡1h；然后置于l7℃恒溫箱中保存，每12h 輕輕搖動1 次，防止精子沉淀[3]。

1.3.3 精子質(zhì)量檢測

精子質(zhì)量檢測指為有效保存時間、總存活時間和質(zhì)膜完整性[4]，具體操作參考文獻4，有效保存時間采用計算機輔助系統(tǒng)進行檢測，總存活時間通過目測法進行觀察，質(zhì)膜完整性參考文獻4 進行。

1.4 試驗設(shè)計

本試驗分為3 組，試驗組的稀釋液為課題組研發(fā)，對照組均采用國內(nèi)著名品牌配制稀釋液。每組試驗重復3 次，本試驗中精子活率大于0.7 保存時間為有效保存時間，精子無活性時保存總時長為總存活時間。

1.5 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)先用Excel 進行前期處理，然后用SPSS17.0 進行方差分析和多重比較，數(shù)據(jù)以“平均值±標準差”表示。

2 結(jié)果分析

2.1 豬鮮精17℃常溫保存不同稀釋劑的保存效果

由表1 數(shù)據(jù)可知，課題組研發(fā)的豬精液17℃常溫保存稀釋劑在有效保存時間和精子總存活時間方面均顯著高于對照一組稀釋劑，而相對于對照二組，試驗組顯著提高了大白種豬精液有效保存時間和精子總存活時間（p＜0.05），其余各組差異均不顯著（p＞0.05）。

表1 不同保存劑對豬精液保存時間的影響

2.2 不同稀釋劑對保存過程中精子質(zhì)膜完整性的影響

由表2 可知，在常溫保存過程中，3種不同稀釋劑在前3d對精子質(zhì)膜完整性均有較好保護作用，3 組間差異不顯著（p＞0.05）；保存到第5 天，課題組研發(fā)的保存劑和對照二組中精子質(zhì)膜完整性顯著高于對照一組（p＜0.05），但前2 組之間質(zhì)膜完整性無顯著性差異（＞0.05）；保存至第7 天，對照一、對照二和試驗組中精子質(zhì)膜完整性分別為49.94±3.08，58.83±2.22，72.86±2.62，精子質(zhì)膜完整性在該3 組之間均存在差異顯著性（p＜0.05）。

表2 不同保存劑對精子質(zhì)膜完整率的影響

3 討論

對照二組的稀釋劑是我國17℃常溫保存稀釋劑市場上知名高端品牌，精液保存效果穩(wěn)定，基本在5～10d，市場占有率較高，但價格也較昂貴，每升稀釋劑18～22 元。對照一組選擇了中長期稀釋粉，一般保存時間在5～7d，也具有較高的市場占有率。因此，本試驗選用該2 種市場率占有率較高的豬精液17℃常溫保存稀釋劑作為對照組，試驗結(jié)果更加客觀。研究表明，課題組自制豬精液常溫保存劑，在精液17℃常溫保存過程中精子有效保存時間，精子總存活時間和質(zhì)膜完整性等指標，部分顯著高于對照二組，均顯著高于對照一組。在有效保存時間方面，穩(wěn)定在7～10d，甚至更長，表明本課題研發(fā)的稀釋劑對精子有較好的保護作用，這可能與本稀釋劑中含有特殊質(zhì)膜穩(wěn)定性成分、較強的緩沖能力物質(zhì)和適當?shù)哪芰款愇镔|(zhì)組合有關(guān)。在質(zhì)膜完整性方面，本課題組研發(fā)的稀釋劑對精子質(zhì)膜也具有顯著的穩(wěn)定作用，這可能與本稀釋劑中緩沖物質(zhì)和滲透壓穩(wěn)定性高有關(guān)，避免精子在保存過程中損傷質(zhì)膜，進一步提高精子的有效保存時間和總存活時間。