劉明強(qiáng), FRANKO Mladen

(1.西南科技大學(xué)理學(xué)院，四川綿陽 621010； 2.新戈里察大學(xué)環(huán)境與生命科學(xué)實(shí)驗(yàn)室，斯洛文尼亞新戈里察 SI-5000)

水體中藻類大量繁殖產(chǎn)生的藍(lán)藻類毒素嚴(yán)重威脅人類健康[1]。LR亞型微囊藻毒素，化學(xué)穩(wěn)定且易溶于水，能抑制蛋白磷酸酶PP1和PP2A活性，導(dǎo)致肝損傷[2]。世界衛(wèi)生組織規(guī)定，飲用水中微囊藻毒素LR限量為1 μg/L。因此，監(jiān)控水體中的微囊藻毒素含量是漁業(yè)和飲用水公司保證食品和飲水安全的前提。

國際標(biāo)準(zhǔn)化組織規(guī)定的微囊藻毒素檢測標(biāo)準(zhǔn)是高效液相色譜法(HPLC)[3 - 5]。HPLC法靈敏度高、特異性好，但其費(fèi)用高、效率較低，不適于實(shí)時(shí)在線現(xiàn)場分析。此外，基于光學(xué)[6 - 11,16 - 19]或電化學(xué)傳感器[12 - 15,20]生化分析法，諸如分子印跡技術(shù)[6]、免疫法[7 - 15]和蛋白質(zhì)磷酸酶抑制法(PPIA)[16 - 20]也被用于微囊藻毒素檢測。一種分子印跡膜修飾表面等離子體共振傳感器，具有較寬檢測范圍(2.1×10-9～1.0×10-6mol/L)和良好特異性，但其單次分析時(shí)間約30 min以上[6]。免疫分析法和PPIA法一般不能區(qū)分特異的毒素同系物，給出的是總毒素含量。從健康風(fēng)險(xiǎn)的評價(jià)角度，總毒素含量是比單一毒素更重要的指標(biāo)。目前，基于PPIA或ELISA的商用試劑盒已可用于毒素檢測。但其分析通常在微量滴定板反應(yīng)阱中進(jìn)行，每個(gè)阱所需試劑量大(～100 微升/阱)且分析時(shí)間較長(≥30 min)。為減少試劑用量，Zhang等人[21]發(fā)展了微流體免疫分析法，具有0～5.0 μg/L的線性響應(yīng)范圍和20 ng/L的檢出限。但其分析程序較復(fù)雜，且分析時(shí)間超過20 min。

最近，我們發(fā)展了一種微流體注入-熱透鏡顯微技術(shù)，用于微空間目標(biāo)物快速檢測，如水體中的Cr(Ⅵ)，或腎損傷標(biāo)記物NGAL等[22 - 23]，與傳統(tǒng)方法相比，該方法可減少分析時(shí)間和試劑用量。因此，本文擬采用微流體注入-熱透鏡顯微系統(tǒng)(μFIA-TLM)快速檢測微囊藻毒素。該系統(tǒng)結(jié)合微空間PPIA和熱透鏡技術(shù)[24]，具有程序簡單、靈敏度高等特點(diǎn)。我們研究了不同因素對微囊藻毒素的影響；給出了最優(yōu)的反應(yīng)參數(shù)和該方法的檢出限，并利用所建立方法評價(jià)了某漁場水體中的毒素水平。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 微流體注入-熱透鏡顯微系統(tǒng)

圖1給出了微流體注入-熱透鏡顯微系統(tǒng)示意圖。

圖1 微流體注入-熱透鏡顯微系統(tǒng)探測微囊藻毒素示意圖(未按比例)Fig.1 Schematic of μFIA-TLM for detection of microcystin(not to scale)

1.1.1微流體注入部分及原理在微流體注入部分，配置有250 μL注射器的兩個(gè)微注射泵(NE-1000,New Era Pump Systems公司，美國)分別用于驅(qū)動樣品和PP2A流動。樣品和PP2A兩支路被一Y型連接頭連接，另一端接一微抑制池(內(nèi)徑500 μm，長度2 cm,容積4 μL)。如果樣品中含有微囊藻毒素，在微抑制池里PP2A的活性將被抑制。為獲得良好混合，酶和樣品以同速率(15 μL/min)被注射入抑制池，持續(xù)30 s。在每次推送后酶支路的電子閥門將關(guān)閉。經(jīng)一定時(shí)間的抑制反應(yīng)后，抑制池中的酶(0.5 μL)以脈沖模式被迅速(80 μL/min)注射入微流控芯片中。微流控芯片為一個(gè)微反應(yīng)芯片(材料：硼玻璃；Micronit Microfluidics公司，荷蘭)，其芯片內(nèi)微通道截面寬220 μm，深50 μm。與傳統(tǒng)反應(yīng)池(～1 cm)相比，此微通道所具有的高比表面積(100 cm-1)及短(分子或離子)擴(kuò)散時(shí)間(在截面內(nèi)約10 s)，可以提高反應(yīng)效率，縮短反應(yīng)時(shí)間；其微小的通道體積(～10 μL)可有效減少分析試劑和樣品用量[22]。第三個(gè)微注射泵(配置5 mL注射器)將驅(qū)動反應(yīng)試劑(p-NPP)以連續(xù)模式流經(jīng)微通道(速率5 μL/min)。這種將一定量的酶以脈沖方式注射入微通道中反應(yīng)試劑連續(xù)流的方式，即為微流體流動注入。

1.1.2熱透鏡顯微檢測方法在熱透鏡顯微檢測部分[23]，一束強(qiáng)度被調(diào)制(調(diào)制頻率1.03 kHz)的泵浦光(Argon激光，413 nm,100 mW,Innova 90,Coherent公司，美國)經(jīng)顯微物鏡(20倍，數(shù)值孔徑0.45,Olympus公司，日本)聚焦于微通道中，用于激勵(lì)微通道中酶與底物所生成的黃色產(chǎn)物對硝基苯酚(p-NP)。p-NP吸收光能量后在微通道激勵(lì)中心周圍引起溫度變化，從而產(chǎn)生折射率梯度(即熱透鏡效應(yīng),尺寸約10 μm)。另用一He-Ne光束(632.8 nm,25-LHP-151-230,Melles Groit公司，美國)經(jīng)同一物鏡后檢測熱透鏡效應(yīng)，經(jīng)該效應(yīng)衍射后檢測光在遠(yuǎn)場(芯片后2～3 cm處)的光強(qiáng)將發(fā)生變化，用光電檢測器(PDA36A,Thorlabs公司，美國)接收光束中心的光強(qiáng)變化，即可獲得熱透鏡信號。該信號經(jīng)鎖相放大器(SR830，時(shí)間常數(shù)0.3 s，Stanford Research Systems公司，美國)提取后，由計(jì)算機(jī)記錄并存儲。

1.2 試劑、材料及溶液的配制

實(shí)驗(yàn)中蛋白磷酸酶PP2A(2.56 mU/μL)來自美國Cayman Chemical公司。反應(yīng)底物對硝基苯磷酸鹽(p-NPP)來自美國Thermo Scientific公司。微囊藻毒素LR(10 μg/mL)來自德國Cyanobiotech公司。牛血清白蛋白(BSA)來自美國Sigma-Aldrich公司。所用試劑均為分析純，水為去離子水。

待測實(shí)際水樣取自于Fonda漁場(SI-6320 Portoro?,斯洛文尼亞)。

不同濃度的PP2A(0.5～8 μU/μL)由pH=7.5的緩沖溶液(20 mmol/L Tris-HCl,100 mmol/L NaCl,1 mmol/L EDTA,1 mmol/L二硫蘇糖醇(DTT),5 mmol/L MgCl2和25%丙三醇)稀釋2.56 mU/μL PP2A制得。不同濃度的反應(yīng)底物(0.1～10 mmol/L)由pH=8.4的緩沖溶液(40 mmol/L Tris-HCl,34 mmol/L MgCl2,4 mmol/L EDTA,0.05 mg/mL BSA和2 mmol/L DTT)稀釋原p-NPP制得。0 ng/L～10 μg/L的微囊藻毒素LR標(biāo)準(zhǔn)液，用去離子水稀釋10 μg/mL毒素溶液獲得。

2 結(jié)果與討論

2.1 底物反應(yīng)時(shí)間的選擇

酶活力是決定反應(yīng)速率及可檢測低濃度毒素的關(guān)鍵因素。為獲得高反應(yīng)速率需要高酶活力單位，但實(shí)現(xiàn)較高的酶抑制率(以獲到更低的毒素檢出限)又需低的酶活力單位。實(shí)驗(yàn)研究了無毒素時(shí)不同活力單位的酶PP2A與反應(yīng)底物p-NPP的反應(yīng)產(chǎn)物(其濃度由熱透鏡信號的大小反映)隨時(shí)間的變化。不同的反應(yīng)時(shí)間可通過改變微通道中的流速或熱透鏡顯微探測相對于微通道Y節(jié)點(diǎn)的位置實(shí)現(xiàn)。圖2(a)顯示當(dāng)酶和底物的反應(yīng)時(shí)間(tR)為4 min時(shí)，在較大的酶活力單位(如8 μU/μL)下熱透鏡信號為其穩(wěn)態(tài)時(shí)(在8 μU/μL時(shí)大于6 min)信號的90%(即90%的反應(yīng)已完成)；而在較小的活力單位(如2 μU/μL)下，4 min 時(shí)的熱透鏡信號約為其穩(wěn)態(tài)信號的70%(即70%的反應(yīng)已完成)。因此，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中我們固定反應(yīng)時(shí)間為4 min。

2.2 底物p -NPP濃度的選擇

底物p-NPP溶液呈淡黃色，吸收激勵(lì)光(413 nm)后產(chǎn)生的背景信號將對目標(biāo)產(chǎn)物檢測帶來干擾。我們研究了底物濃度對檢測信噪比(S/N)的影響。S為酶活力單位不為零(如2 μU/μL)時(shí)產(chǎn)物的熱透鏡信號，N為無酶時(shí)底物的熱透鏡信號的標(biāo)準(zhǔn)差。從圖2(b)可以看出當(dāng)S/N達(dá)到最大時(shí)，對應(yīng)最優(yōu)p-NPP濃度是2 mmol/L。

2.3 酶與樣品間抑制反應(yīng)時(shí)間的選擇

圖2(c)展示了PP2A和樣品間的抑制反應(yīng)時(shí)間(tI)對熱透鏡信號的影響。定義無毒素作用時(shí)產(chǎn)物p-NPP 的熱透鏡信號為S0，毒素作用下p-NPP的信號為S1，則酶抑制率為(S0-S1)/S0。在4 μL的抑制反應(yīng)池里，約80%的酶抑制在2 min內(nèi)完成。因此選擇2 min作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)中的抑制時(shí)間。加上酶和底物的反應(yīng)時(shí)間4 min，可得出每次分析時(shí)間約6 min，僅為傳統(tǒng)微量滴定板反應(yīng)阱中的分析時(shí)間的1/5。

圖2 (a)不同酶活力單位下PP2A-p -NPP反應(yīng)生成物的熱透鏡信號隨時(shí)間變化；(b)不同底物p -NPP濃度下的探測信噪比S/N；(c)抑制反應(yīng)時(shí)間對酶抑制度的影響；(d)不同濃度毒素對四個(gè)酶活力單位的酶抑制效率(圖中誤差棒代表3次實(shí)驗(yàn)結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差)Fig.2 (a) Progress curve for PP2A-p -NPP reaction at different enzymatic units;(b) signal-to-noise ratio(S/N) at different p -NPP concentrations;(c) impact of inhibition time on the level of enzyme inhibition;(d) inhibition rate by different toxin concentrations at four enzymatic units(Error bars denote the standard deviation of three measurement results)

2.4 方法的分析性能

在優(yōu)化的反應(yīng)條件下，研究了PP2A被不同濃度毒素抑制后的產(chǎn)物p-NPP的熱透鏡信號的減小。圖2(d)給出了不同毒素濃度時(shí)的酶抑制率，其結(jié)果整理于表1。從圖2(d)和表1可看出，隨著酶活力單位的減小(直至0.5 μU/μL)，抑制酶的毒素范圍變窄，可檢測的毒素濃度相應(yīng)變小。檢出限定義為S0-S1=3σ時(shí)對應(yīng)的毒素濃度(σ為S0的標(biāo)準(zhǔn)偏差)。在酶活力單位0.5 μU/μL時(shí)測量誤差較大，其檢出限與1 μU/μL時(shí)相當(dāng)。在1 μU/μL的酶活力單位下，抑制酶的毒素范圍為10～1 000 ng/L，檢出限約為20 ng/L。該檢出限是世衛(wèi)組織規(guī)定的水中毒素濃度上限的1/50，以及商用微量滴定板PPIA分析盒(Abraxis公司)的標(biāo)稱檢出限的1/5。

表1 不同酶活力單位下基于PPIA的微流體注入-光熱顯微系統(tǒng)檢測微囊藻毒素的性能

2.5 方法在實(shí)際中的應(yīng)用

圖3 樣品標(biāo)準(zhǔn)加入回收率(n=3)Fig.3 Recovery rate of spiked samples(n=3)

另外，我們評估了來自Fonda漁場的水樣中的毒素水平。該水樣分成三組(每組5個(gè)樣品)進(jìn)行測試：第一組和第二組加入了100 ng/L的標(biāo)準(zhǔn)微囊藻毒素樣品；第三組是未經(jīng)處理的水樣。其中第二組在加入標(biāo)準(zhǔn)樣品前用0.45 μm孔徑的濾膜進(jìn)行了過濾。經(jīng)該微流體注入-光熱顯微系統(tǒng)檢測后，發(fā)現(xiàn)第三組樣品沒有引起明顯的酶抑制反應(yīng)。圖3顯示第一組和第二組中毒素的回收率分別是89.6±13.5%和93.2±11.7%。這意味著在原水樣中雜質(zhì)對PPIA幾乎沒有影響?？梢哉J(rèn)為實(shí)際水樣中的毒素濃度低于該檢測系統(tǒng)的檢出限20 ng/L。

3 結(jié)論

建立了基于蛋白磷酸酶抑制的微流體注入-熱透鏡顯微檢測系統(tǒng)。該系統(tǒng)被證實(shí)適用于高靈敏的快速檢測微囊藻毒素。優(yōu)化了反應(yīng)和檢測條件，獲得了約為20 ng/L的毒素檢出限。受益于微通道內(nèi)高反應(yīng)速率，分析時(shí)間從微量滴定板反應(yīng)阱中的30 min縮短到微流控芯片內(nèi)的約6 min，以及微空間的小尺寸，單次分析酶的用量(～1 μL) 相比微量滴定板中酶的用量減少了一個(gè)數(shù)量級(～50 μL)。檢測來自于Fonda漁場的水樣發(fā)現(xiàn)，水樣中微囊藻毒素含量低于儀器檢出限，水體適于魚類的安全養(yǎng)殖。該分析平臺可用于微囊藻毒素的實(shí)時(shí)現(xiàn)場監(jiān)控，為可能的微囊藻毒素污染提供預(yù)警。