賀氣志， 唐 亮， 周 吉， 陳珂珂， 陳伶利， 寧 毅*

(1.長沙醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，湖南長沙 410219； 2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖南長沙 410208)

金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)是一種常見的致病性和致死性的病原菌，它可引起局部化膿感染，壞死性肺炎、心包炎、食物中毒等一系列疾病，甚至出現(xiàn)膿毒癥、敗血癥等全身感染[1 - 3]。隨著科技的發(fā)展，目前各種新技術(shù)包括免疫學(xué)方法、電化學(xué)法、PCR等方法已被應(yīng)用于金黃色葡萄球菌的檢測[4 - 7]。但是這些方法存在易污染、選擇性弱、操作繁瑣、所需設(shè)備昂貴等缺點，難以滿足臨床快速診斷治療和食品檢測的需要。因此，建立一種簡單快速，成本低廉，靈敏性高，特異性強的新方法已迫在眉睫。

氧化石墨烯(GO)是一種非常高效的熒光猝滅劑，它具有良好的水溶性以及生物低毒性[8]，并且能保護吸附在其表面的單鏈DNA(ssDNA)不被降解，因此被廣泛應(yīng)用于傳感器、基因診斷等領(lǐng)域[9 - 12]。脫氧核糖核酸酶Ⅰ(DNase Ⅰ)在Mg2+存在時能隨機降解單、雙鏈DNA形成小DNA片段，而對RNA無降解作用，DNase Ⅰ的這一特性為設(shè)計生物傳感器對RNA進行檢測提供了新的思路[13 - 14]。由于細菌的16S rRNA 具有高度的保守性和特異性，以此作為靶標(biāo)設(shè)計探針非常快捷簡便且選擇性高，因此成為檢測病原菌的重要標(biāo)記物[15 - 16]。本研究利用一段特異性識別的金黃色葡萄球菌16S rRNA為靶標(biāo)設(shè)計探針，基于熒光疊加原理構(gòu)建兩個羰基熒光素(FAM)標(biāo)記的探針(TFP)，并與GO形成TFP/GO納米生物傳感器，并利用DNase Ⅰ的特性使RNA靶標(biāo)循環(huán)從而放大熒光信號，提高生物傳感器的靈敏度。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

LS55型熒光分光光度計(美國，PerkinElmer公司)；Milli-Q型純水儀(美國，Millipore公司)； PL203型電子天平和DELTA-320 pH計(瑞士，梅特勒-托利多公司)。

氧化石墨烯(GO)(南京先鋒材料科技有限公司)；DNase Ⅰ(Thermo Fisher Scientific)；UNIQ-10柱式Trizol總RNA提取試劑盒(上海生工生物科技有限公司)；pH=7.4 Tris-HCl緩沖溶液(25 mmol/L Tris-HCl,5 mmol/L MgCl2)(天根生化科技有限公司)。實驗菌種：金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌、大腸桿菌K88、銅綠假單胞菌均由湖南中醫(yī)藥大學(xué)提供。本研究所用的核苷酸均由上海生工生物科技有限公司合成。金黃色葡萄球菌的16S rRNA來自于核糖體數(shù)據(jù)庫項目Ⅱ數(shù)據(jù)庫，取其中25個堿基作為靶標(biāo)序列。設(shè)計新的ssDNA在與靶標(biāo)互補序列兩側(cè)延伸6個堿基分別與探針1、探針2互補。探針1、探針2分別在3′端和5′端用FAM熒光標(biāo)記，如表1。

表1 體系中所用到的核苷酸

Note:the underlines are complementary sequence of probe 1 and probe 2,respectively.

1.2 實驗方法

1.2.1核苷酸序列的設(shè)計從核糖體數(shù)據(jù)庫項目Ⅱ中獲得所有的金黃色葡萄球菌的16S rRNA。這些序列被酶切成多片段并通過多重比對。選取與原始菌匹配度大于90%，而與其他菌的匹配度小于10%的片段連接起來。本研究采用的靶標(biāo)序列如表1所示，根據(jù)標(biāo)靶序列設(shè)計互補的ssDNA探針，該探針包含16S rRNA互補序列(捕捉探針)和羧基熒光素(FAM)標(biāo)記的探針1、探針2(信號探針)，兩者通過堿基互補組裝成雙FAM標(biāo)記的檢測探針TFP。

1.2.2GO溶液和熒光探針的制備稱取100 mg GO，溶于100 mL超純水后，將其置于300 W超聲波破碎儀下冰浴超聲120 min，使其充分均勻分散，制備成1 mg/mL的GO溶液,室溫保存?zhèn)溆?。首先?0 nmol/L的探針1、探針2與ssDNA分別在95 ℃水浴下變性5 min，然后冰浴10 min后，將三者在室溫下混合孵育30 min，組裝成兩個FAM標(biāo)記的探針(TFP)。采用上述相同的方法將50 nmol/L ssDNA分別與探針1、探針2組裝成單熒光探針1(SFP1)、單熒光標(biāo)記探針2(SFP2)。本研究反應(yīng)體積均為100 μL，所有物質(zhì)濃度均為終濃度。

1.2.3檢測條件的優(yōu)化為了優(yōu)化熒光受體GO與熒光供體TFP比例，設(shè)置從0到 0.12 mg/mL的13種不同的GO濃度。將不同體積的1 mg/mL GO溶液分別與TFP溶液混合，用pH=7.4的Tris-HCl緩沖溶液定容至100 μL，TFP終濃度為50 nmol/L，室溫孵育20 min。在激發(fā)波長495 nm，發(fā)射波長520 nm下測定TFP原始熒光值(F0)和TFP/GO混合溶液熒光值(F)。此外,將40 nmol/L靶標(biāo)序列和1 U DNase Ⅰ同時加入到TFP/GO混合體系中室溫孵育，每5 min監(jiān)測一次熒光強度，確定體系的最佳熒光恢復(fù)反應(yīng)時間。此外DNase Ⅰ的濃度也是影響傳感器的重要因素。將DNase Ⅰ從0～1.25 U設(shè)置6個不同濃度梯度，將60 nmol/L靶序列和DNase Ⅰ同時加入TFP/GO混合體系中，總體積為100 μL，室溫孵育50 min后，分別測定各反應(yīng)液的熒光強度。本研究所有實驗都做3次平行實驗。

1.2.4可行性分析為了驗證該生物傳感器的可行性，設(shè)置了以下8組溶液：(1) TFP；(2) TFP+DNase Ⅰ；(3) TFP+GO；(4) TFP+GO+DNase Ⅰ；(5) TFP+GO+target；(6) TFP+GO+DNase Ⅰ+target；(7) SFP1+GO+DNase Ⅰ+target；(8) SFP2+GO+DNase Ⅰ+target。各組溶液均用Tris-HCl緩沖溶液(pH=7.4)定容至100 μL，GO濃度為0.09 mg/mL，熒光探針SFP1、SFP2、TFP的濃度為50 nmol/L，GO分別和3種熒光探針室溫孵育10 min。靶標(biāo)RNA濃度為60 nmol/L，1 U DNase Ⅰ同時加入檢測體系，室溫孵育50 min，充分反應(yīng)后，分別測定各組混合溶液的熒光強度。

1.2.5TFP對16SrRNA靶標(biāo)序列的檢測將TFP/GO復(fù)合物與不同濃度(0、10、20、30、40、50、60 nmol/L)的靶標(biāo)序列室溫孵化50 min，充分反應(yīng)后，在激發(fā)波長495 nm，發(fā)射波長520 nm下分別測定各組混合溶液的熒光強度。為探究酶切放大效果，分別將濃度為0、0.3、1、10、20、30、40、60、70 nmol/L的靶標(biāo)序列RNA與DNase Ⅰ同時加入到TFP/GO中，室溫孵育50 min后，測定各混合溶液的熒光強度。

1.2.6TFP/GO生物傳感器對金黃色葡萄球菌的靈敏性分析為了評價TFP/GO生物傳感器在實際樣品中對金黃色葡萄球菌的靈敏度，準(zhǔn)備濃度為0、50、102、103、104、105、106、107、108CFU/mL的靶細菌菌液，冷凍離心(1 700g)收集菌體，用試劑盒提取總RNA。然后將總RNA和DNase Ⅰ同時加入到TFP/GO復(fù)合溶液中，室溫孵育50 min后，分別測定混合溶液的熒光值。

1.2.7TFP/GO生物傳感器對金黃色葡萄球菌的特異性分析為考察該生物傳感器的特異性，以金黃色葡萄球菌為實驗組，以表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸桿菌為對照組，所有菌種的濃度均為105CFU/mL，提取它們的總RNA，按上述方法測定該體系的熒光值。

2 結(jié)果與討論

2.1 生物傳感器的設(shè)計原理

TFP/GO傳感器設(shè)計的原理是基于DNase Ⅰ介導(dǎo)的酶切靶標(biāo)循環(huán)的熒光信號放大反應(yīng)，如圖1所示。設(shè)計的ssDNA包含能捕捉16S rRNA靶標(biāo)的DNA序列，序列5′-端、3′-端各有6個堿基分別與探針1、探針2互補。ssDNA與探針1、探針2互補配對形成兩個熒光分子標(biāo)記的探針(TFP)。當(dāng)無靶標(biāo)時，TFP通過π-π鍵吸附在GO表面，由于共振能量轉(zhuǎn)移，熒光被猝滅，如圖1(a)。當(dāng)加入靶標(biāo)RNA時，TFP與靶標(biāo)RNA互補配對使其從GO表面解離下來，因此體系熒光恢復(fù)。當(dāng)核酸分子從GO表面解離下來后，DNase Ⅰ隨機降解單、雙鏈DNA分子從而釋放靶標(biāo)RNA參與下一輪反應(yīng)，同時產(chǎn)生更多游離的FAM，體系熒光信號進一步增強，如圖1(b)。因此該過程能有效的提高傳感器的靈敏度，有望在低濃度下進行定量分析。

圖1 TFP/GO生物傳感器檢測金黃色葡萄球菌的原理圖Fig.1 Schematic representation of the TFP/GO biosensor for S.aureus detection (a) Constructions of TFP and preparation of TFP/GO complexes;(b) DNase Ⅰ-mediated target recycling and fluorescent signal amplification occurred.

2.2 檢測條件的優(yōu)化

TFP與GO的供受比例、熒光恢復(fù)的反應(yīng)時間及DNase Ⅰ的用量是影響傳感器檢測效率以及靈敏性的重要因素，因此對這三個條件進行了優(yōu)化。圖2(a)顯示了TFP加到不同濃度GO溶液中的熒光猝滅率的變化。隨著GO濃度的增大，熒光強度降低，熒光猝滅率迅速上升，當(dāng)GO濃度達到0.09 mg/mL時，熒光猝滅率超過95%，繼續(xù)增加GO濃度，猝滅率基本不變。因此最終確定GO最佳濃度為0.09 mg/mL，后續(xù)實驗均采用此比例。檢測時由于DNase Ⅰ的作用，時間越長產(chǎn)生的游離熒光分子越多，為提高檢測效率對熒光恢復(fù)時間進行優(yōu)化，如圖2(b)所示。當(dāng)靶標(biāo)加入體系后，熒光強度逐漸恢復(fù)。反應(yīng)50 min后，熒光值基本趨于平緩不再顯著增加。因此將50 min作為最佳的熒光恢復(fù)反應(yīng)時間。為確定最佳的DNase Ⅰ濃度，考察反應(yīng)體系中加入不同濃度的DNase Ⅰ的熒光值的變化，如圖2(c)所示。隨著DNase Ⅰ濃度的增大，其熒光值增大，當(dāng)DNase Ⅰ用量達到1U后繼續(xù)增加用量，其熒光值基本趨于平緩不再顯著增加，因此體系中DNase Ⅰ的最佳用量為1 U。

圖2 檢測條件的優(yōu)化Fig.2 Optimization of detection system(a) Optimization of the concentration ratio of GO to TFP；(b) Optimization of fluorescence restoration time；(c) Optimization of the concentration of DNase Ⅰ.

2.3 可行性分析

圖3 可行性分析Fig.3 Feasibility assay

在不同條件下考察該生物傳感器的可行性，如圖3所示。無GO時，TFP的熒光強度要遠大于其它組(圖3曲線1)；當(dāng)DNase Ⅰ加入到TFP(圖3曲線2)的熒光強度與TFP(圖3曲線1)單獨存在時相近，說明DNase Ⅰ對FAM基本沒有影響。然而當(dāng)GO加入該體系后，熒光猝滅效率達到95%以上，表明TFP吸附在GO表面已達到飽和狀態(tài)，由于共振能量轉(zhuǎn)移熒光被猝滅(圖3曲線3)；當(dāng)DNase Ⅰ 加入到TFP/GO中，熒光信號幾乎不產(chǎn)生變化，表明GO能夠保護TFP而不被DNase Ⅰ降解(圖3曲線4)；當(dāng)加入60 nmol/L的靶標(biāo)，熒光信號恢復(fù)(圖3曲線5)，表明TFP通過捕捉探針與靶標(biāo)RNA特異性結(jié)合，使得探針從石墨烯上脫離下來；當(dāng)在檢測體系中加入DNase Ⅰ(圖3曲線6)，檢測到的熒光值遠遠高于曲線5，表明DNase Ⅰ隨機裂解了體系中自由存在的ssDNA、dsDNA，靶標(biāo)被釋放參與到下一個循環(huán)，同時產(chǎn)生更多游離的FAM；與曲線6相比，當(dāng)探針1(圖3曲線7)與探針2(圖3曲線8)單獨存在時，熒光值增加并不顯著，表明兩個FAM標(biāo)記的探針能極大的提高檢測的熒光強度?；谝陨辖Y(jié)果，新構(gòu)建的生物傳感器用于檢測金黃色葡萄球菌，不僅能成功的檢測靶標(biāo)還能顯著提高檢測的靈敏度，因此該體系是可行的。

圖4 加入DNase Ⅰ前(a)、后(b)TFP對不同靶標(biāo)RNA序列濃度的檢測Fig.4 Detection of target RNA at different concentrations by TFP/GO without (a) and with (b) DNase Ⅰ

2.4 對16S rRNA靶標(biāo)序列的檢測

為考察TFP對序列的檢測限及DNase Ⅰ的放大效果，將TFP/GO復(fù)合物在不加入和加入DNase Ⅰ兩種條件下，分別對不同靶標(biāo)RNA濃度進行了熒光測定，結(jié)果如圖4所示。當(dāng)不存在DNase Ⅰ時，在靶序列濃度為10～60 nmol/L的范圍內(nèi)，熒光值與靶序列呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，如圖4(a)所示，其檢測限為10 nmol/L。當(dāng)DNase Ⅰ和靶序列同時加入TFP/GO復(fù)合物，室溫孵化后檢測其熒光值，如圖4(b)所示，在0.3～60 nmol/L的濃度范圍內(nèi)，隨著靶標(biāo)濃度的不斷增加，熒光值也不斷增大，當(dāng)靶標(biāo)濃度大于60 nmol/L時熒光值無明顯增加，說明60 nmol/L靶標(biāo)與50 nmol/L探針的結(jié)合達到飽和。RNA濃度在1～60 nmol/L的范圍內(nèi)，熒光值與靶標(biāo)RNA濃度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，檢測限可達0.3 nmol/L。可見DNase Ⅰ的加入使得檢測限大幅度下降，顯著提高了該傳感器的靈敏度。

2.5 對金黃色葡萄球菌的靈敏度和特異性分析

傳感器對靶標(biāo)RNA的檢測限低并不意味著它在實際菌種檢測中的性能好。因此我們使用該生物傳感器檢測了不同濃度的金黃色葡萄球菌，如圖5所示。在50～107CFU/mL的濃度范圍內(nèi)，熒光強度隨著菌體濃度的增大而增大，當(dāng)菌體濃度大于107CFU/mL時熒光值已無明顯增加，說明探針與菌中靶標(biāo)RNA的結(jié)合已達飽和。在102～107CFU/mL濃度范圍內(nèi)，熒光值與菌體濃度呈良好的線性關(guān)系，且檢測下限低至50 CFU/mL。結(jié)果表明該傳感器能在總RNA組中捕捉16S rRNA，而且具有很高的靈敏性，因此在實際樣品分析中具有很大的應(yīng)用前景。

此外，我們還對該傳感器的特異性進行了探究，向制備好的TFP/GO體系中，分別加入相同濃度的6種菌的16s rRNA，在相同條件下反應(yīng)后測定熒光值。如圖6所示，1號菌為靶標(biāo)金黃色葡萄球菌，其檢測到的信噪比為10.37，而表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸桿菌的信噪比分別為2.37、2.17、1.4、1.27。表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌檢測到的信噪比略高于銅綠假單胞菌和大腸桿菌，可能由于這兩種菌與金黃色葡萄球菌均屬于葡萄球菌屬，存在一定的同源性。但是其信噪比遠低于靶標(biāo)菌，而且一般來說，只有當(dāng)信噪比大于3才有檢測意義，結(jié)果說明該生物傳感器對金黃色葡萄球菌具有高度選擇性，能夠區(qū)別同屬不同種的細菌,因此在臨床病原菌的檢測中具有良好的應(yīng)用前景。

圖5 TFP/GO傳感器對不同濃度靶標(biāo)菌的檢測Fig.5 Detection of target bacteria at different concentrations

圖6 生物傳感器的特異性分析Fig.6 Specific detection of biosensor 1.S.aureus;2.S.epidermidis;3.S.saprophyticus; 4.P.aeruginosa;5.E.coli;6.Black.

3 結(jié)論

本研究根據(jù)共振能量轉(zhuǎn)移、熒光疊加原理，以金黃色葡萄球菌的16S rRNA為靶標(biāo)，構(gòu)建了基于酶促信號放大GO與16S rRNA核酸探針納米生物傳感器。該生物傳感器采用了雙熒光標(biāo)記法，使熒光強度增大，并通過DNase Ⅰ降解DNA的特性，靶標(biāo)分子能被循環(huán)檢測，同時產(chǎn)生多個熒光分子，從而大幅降低了該生物傳感器的檢測限。將靶標(biāo)與DNase Ⅰ同時加入，檢測時一邊識別靶標(biāo)，一邊進行酶切作用，大大提高了檢測效率，檢測所需時間不到2 h。方法兼具選擇性強、操作簡單、成本低廉等優(yōu)勢，有望應(yīng)用于臨床診斷、食品檢驗等領(lǐng)域。此外更換基于16S rRNA的探針還可應(yīng)用于其他病原菌、癌細胞、寄生蟲等其他生物靶標(biāo)的檢測。