李寶輝, 李冬暉, 倪永年

(1.解放軍989醫(yī)院中心實驗室,河南洛陽 471031; 2.南昌大學化學系,江西南昌 330031)

中藥以其藥效作用多樣和低毒而聞名,而隨著對中藥認知度的不斷提高和使用,中藥正在走向世界并逐漸為國內外民眾所認可。郁金是較早使用的中藥材,并被記錄于蘇敬的《唐本草》,用藥歷史距今已有1 400年。郁金廣泛用于活血止痛、行氣解郁、清心涼血、利膽退黃、抗腫瘤、降血脂、抗氧化、殺菌、抗病毒和抗炎。其主要的兩大活性組分為姜黃素類化合物和揮發(fā)油類化合物。地域對中藥材的藥性影響很大,通常把較其他產區(qū)的同種藥材品質更佳、療效更好，并具有較高知名度的藥材稱為道地藥材[1]。四川產郁金被稱作為郁金的道地藥材,廣西、云南、浙江一帶也都產郁金藥材,但質量不如四川產郁金。由于價格等因素市場上可能流通著以次充好的郁金藥材,而且一般很難用肉眼來進行產地鑒別。不同于西藥的單一組分,多數(shù)中藥藥效由多種藥效組分配伍而發(fā)揮其治療的作用,因此中藥的質量控制和質量保證還存在一定困難和挑戰(zhàn)。

指紋圖譜技術被認為是分析復雜中藥材的重要方法,在化學統(tǒng)計學的幫助下,能從其指紋圖譜中挖掘復雜體系的有效信息,去冗求簡,并構建準確快速識別的數(shù)據(jù)庫[2 - 3]。高效液相色譜-質譜(HPLC-MS)和氣相色譜-質譜(GC-MS)由于具有通用、穩(wěn)健和可重復性,常被用來鑒定復雜物質(例如中藥和食品)的組成或有效成分、品質和真?zhèn)?。特別是HPLC和GC具有非常強的分離能力,因此，由這兩種色譜方法構建的樣品指紋圖譜可以清晰確認某一種或幾種化合物成分在復雜物質定性中的作用[4 - 5]。Qin等[6]應用GC-MS法研究了黃絲郁金(C.Longa)、蓬莪術(C.Phaeocaulis)、溫郁金(C.Wenyujin)和廣西莪術(C.Kwangsiesis)的塊根和根莖,并發(fā)現(xiàn)了四種標志物芳姜黃烯(ar-Curcumene)、芳姜黃酮(ar-Turmerone)、α-姜黃酮(α-Turmerone)和β- 姜黃酮(β-Turmerone)對塊根和根莖的鑒別起到了重要作用。Li等[7]應用HPLC-MS法定性定量分析郁金藥材中的姜黃素類化合物,發(fā)現(xiàn)不同產地和不同栽培年限藥材中姜黃素類化合物的含量差別較大。Ni等[8]應用GC-MS法和HPLC法研究復雜物質(莪術)并構建其色譜指紋圖譜,經統(tǒng)計學方法處理后,兩類數(shù)據(jù)得到比較好的融合,從而提高了對莪術樣品采用指紋圖譜進行判別鑒定的準確性。近紅外光譜(NIRS)測定具有快速、無損、需要樣品量少、能實時監(jiān)測等特點,目前已被廣泛應用于工農業(yè)生產過程中復雜物質的檢測和鑒定。NIRS測量的是有機分子中含氫基團(-OH、-NH、-CH)振動的合頻和各級倍頻峰吸收,因此其構建的指紋圖譜能表達某類或幾類化合物的加和作用。NIRS的復雜性決定其依靠善于處理復雜信號、挖掘隱藏信息、可視化分析結果的統(tǒng)計學方法來解析[9 - 10]。

本文應用高效液相色譜-質譜法(HPLC-MS)和頂空-氣相色譜-質譜法(HS-GC-MS)分別測定郁金藥材水提物和揮發(fā)油的化合物組分;并應用HPLC、GC和NIR分別構建郁金藥材指紋圖譜,以期有的放矢高效用好中藥藥材。

1 實驗部分

1.1 郁金樣品的采集

本研究共采集了三個產地的53份郁金樣品,其中四川2016批次8份(1#～8#),四川2017批次12份(9#～20#),廣西2016批次8份(21#～28#),廣西2017批次10份(29#～38#),浙江2017批次15份(39#～53#)。

1.2 樣品前處理

將郁金樣品打碎并過40目篩后,保存于自封塑料袋中,并盡快完成HS-GC-MS和NIRS檢測。樣品的HPLC-MS測定前處理如下:準確稱取1.00 g郁金粉末樣品,加入20 mL二次蒸餾水，于50 ℃超聲30 min,之后將提取物過濾于25 mL容量瓶中。液相色譜進樣前,將提取物過0.45 μm的濾膜。

1.3 檢測儀器及參數(shù)設置

NIRS測定:日立UV-4100紫外-可見-近紅外光譜儀,反射模式,掃程200～2 500 nm,掃描步長2 nm,每個樣品掃描32次取其平均吸光度值。

HS-GC-MS測定:配備島津AOC 5000頂空自動進樣器的島津QP 2010 GC-MS儀,RTX-5毛細柱(30 m×0.25 mm,0.25 μm)。HS參數(shù)如下:溫度100 ℃,500 r/min轉動25 min。GC參數(shù)如下:進樣體積250 μL,流速1.0 mL/min,進樣口溫度230 ℃,柱溫程序,初始70 ℃(保持5 min)，以10 ℃/min升溫至140 ℃(保持2 min)。MS測定參數(shù)如下:接口溫度230 ℃,掃描范圍m/z30～500,掃描頻率0.30 scan/s。

HPLC-MS測定:Waters AQ 4000/2695 HPLC-MS儀,Zorbax Ecllipse Plus-C18柱(250×4.6 mm,5 μm),流速1.0 mL/min,柱溫20 ℃,檢測波長270 nm,進樣體積20 μL。流動相及梯度如下:流動相為甲醇(A)和0.1%H3PO4(B),0～4 min，95%～90%B；4～30 min，90%～50%B；30～50 min，50%～8%B;MS條件如下:電噴霧離子化檢測器,解離溫度350 ℃,離子源溫度110 ℃,掃描范圍m/z50～1 000。

1.4 化學統(tǒng)計學分析

由以上測試所得的郁金樣品數(shù)據(jù),包括NIRS、GC和HPLC,均在Matlab 7.0平臺上完成統(tǒng)計運算。在本研究中,我們采用了KK-分析法(KK-Analysis)對測量數(shù)據(jù)進行分析。KK-分析法是基于Matlab語言并包含多種無監(jiān)督模式識別方法,如自組織地圖(SOM)和聚類分析。其原理如下[11]:SOM首先由Teuvo Kohonen提出，因此也稱做Kohonen地圖，它是一種將原始的多維數(shù)據(jù)壓縮成更低維數(shù)據(jù)的方法,這種壓縮技術叫做向量量化;SOM創(chuàng)造一個包含數(shù)據(jù)集模型的拓撲關系的信息網絡。

SOM是由很多節(jié)點組成的,每個節(jié)點被分配一個權重向量Wi;在某種意義上節(jié)點組成一個小的群落;Wi和原始的特征向量具有相同的維度。迭代步驟如下:

(1)

核心步驟就是鑒定距離真實輸入數(shù)據(jù)最近的節(jié)點，以及對于第j個模型來說的最佳匹配單元(BMU)。一旦確定了BMU,它的權重就按照所謂的學習率逐漸調整。權重的調整過程如下:

Wi(t+1)=Wi(t)+φ(Δ,t)λ(t)(WI(t)-Vj(t))

(2)

式中φ是描述依賴節(jié)點升級的距離,而φ(Δ,t)是BMU的最大值。

聚類分析可以分為無級區(qū)分和分級區(qū)分兩種技術,本文應用到的是無級區(qū)分策略,這種模式下需要預定義樣品分為幾個類,每次預定義的類數(shù)目發(fā)生改變,整個聚類過程將重新開始。在模糊聚類分析中,在一定程度上每一個模型都有可能屬于任何一個可能的類,因此一個模型到底屬于哪個類是通過向量表達的。這個區(qū)分過程是通過一個矩陣M×K表示的,M是整個數(shù)據(jù)機的模型數(shù)目,K表示類數(shù)目。區(qū)分的優(yōu)化過程是通過最小化目標函數(shù)實現(xiàn)的。

2 實驗結果

2.1 HPLC-MS水提物組分分析和統(tǒng)計學

將HPLC色譜數(shù)據(jù)結果導入指紋圖譜相似度軟件進行分析,發(fā)現(xiàn)三個產地5個批次的郁金樣品共有21組共有峰(標記為L1～L21),見圖1(a)。經過MS分子量以及組分最大紫外吸收的比對,有12個組分被鑒定(表1),分別是:沒藥姜黃醇B(Bisacurone B)(L2),姜黃素(Curcumin)(L4),去甲氧基姜黃素(Demethoxycurcumin)(L5),二去甲氧基姜黃素(Bisdemethoxycurcumin)(L6),莪術醇(Curcumol)(L7),吉馬酮(Germacrone)(L11),芳姜黃酮(Arturmerone)(L12),莪術二酮(Curdione)(L13),莪術醇(Curcumenol)(L15),異莪術醇(Isocurcumenol)(L16),姜黃醇酮(Curcolone)(L18),姜黃醇(Curcumone)(L19)。

將21組共有峰數(shù)據(jù)作為變量輸入Matlab作為平臺的KK-分析法,進行聚類分析,結果見圖2(a)。發(fā)現(xiàn)53個樣品大致分為三類,其中四川2016和2017兩批次樣品歸為一類,廣西2017和浙江2017批次樣品水提物差別不大,廣西2016批樣品獨自為一類;另外浙江2017批4個樣品(41#,44#,51#和53#)和廣西2016批次樣品較為相似。

表1 HPLC-MS法分析郁金樣品組分特性

2.2 HS-GC-MS揮發(fā)油組份分析和統(tǒng)計學

將HS-GC測定數(shù)據(jù)導入指紋圖譜相似度軟件分析,發(fā)現(xiàn)三個產地5個批次的郁金樣品具有14組共有峰(標記為G1～G14),見圖1(b)。經過GC-MS化合物相似度軟件查詢并與文獻作比對,這14個化合物分別確定為:3-蒈烯(3-carene)(G1)，α-蒎烯(α-Pinene)(G2)，莰烯(Camphene)(G3)，β-蒎烯(β-Pinene)(G4)，桉油精(Eucalyptol)(G5)，樟腦(Camphor)(G6)，龍腦(Borneol)(G7)，石竹烯(Caryophyllene)(G8)，α-檀香醇(α-Santalol)(G9)，α-石竹烯(α-Caryophyllene)(G10)，β-人參烯(β-Panasinsene)(G11)，臭樟腦(Napthalene)(G12)，廣藿香烯(Patchonlene)(G13)，異香樹烯(Isoaromadendren)(G14)。

將14個共有峰作為變量，利用前述KK-分析法做聚類分析,結果見圖2(b)。發(fā)現(xiàn)三產地5批次的53份郁金樣品大致分為三類,其中四川2016和2017批次郁金樣品的揮發(fā)油組分含量較為相似,廣西2016和2017批次的樣品差別不大,浙江2017批次獨成聚為一類,另外浙江2017批次3個樣品(44#,51#和53#)不能和四川的樣品區(qū)分。

圖1 三個產地5個批次的53份郁金樣品HPLC(a)、HS-GC(b)和NIRS(c)檢測結果 Fig.1 The measured spectra of HPLC(a),HS-GC(b) and NIRS(c) for Radix Curcumae samples from three origins with five batches

2.3 NIRS全組分分析和統(tǒng)計學

由于樣品的近紅外光譜測量易受溫度、散射和顆粒不均勻等因素的影響,故我們采用標準正態(tài)變量變換(SNVT)來校正測得的NIRS曲線(圖1(c))[12]。進而將全光譜作為變量做統(tǒng)計分析,結果見圖2(c)。三產地5批次的郁金樣品可分為5類:四川2016批次,四川2017批次,廣西2016批次,廣西2017批次和浙江2017批次。同時我們可以看到浙江2017批次中,39#和廣西2016批次較相似,44#和四川2017批次較相似,53#和廣西2017批次分為一組?？梢姴煌a地不同批次間確實存在一定的差異。

為了驗證無監(jiān)督模式識別結果的準確度，我們將每組樣品按2:1隨機分為校正集組(四川2016批次5個,四川2017批次8個,廣西2016批次5個,廣西2017批次7個,浙江2017批次10個)和驗證集組(四川2016批次3個,四川2017批次4個,廣西2016批次3個,廣西2017批次-3個,浙江2017批次5個)。應用經典的有監(jiān)督模式識別方法最小二乘-支持向量機(LS-SVM)[13]處理校正組數(shù)據(jù)并建立驗證模型,進而用于對校正組和驗證組分別進行識別,可以發(fā)現(xiàn)校正組樣品識別率為100%,而驗證組識別率為94.7%(參數(shù)gam=27.21,sig2=105.84)。

圖2 三個產地5個批次的53份郁金樣品HPLC(a)、HS-GC(b)和NIRS(c)檢測結果的聚類分析結果Fig.2 The clustering results of HPLC(a),HS-GC(b) and NIRS(c) for the Radix Curcumae samples from three origins with five batches

3 結論

本研究應用HPLC-MS和GC-MS分別分析中藥郁金的水提物和揮發(fā)油,26個化合物組分被準確鑒定。HPLC指紋圖譜發(fā)現(xiàn)四川2016和2017批次水提物幾無差別,但廣西2016和2017批次差別較大。很明顯依據(jù)郁金藥材水提物的分析結果發(fā)現(xiàn)廣西2017和浙江2017批次的郁金藥材質量高于廣西2016批次。由GC指紋圖譜發(fā)現(xiàn)四川2016和2017批次揮發(fā)油類物質之間差別不大,而廣西2016批次和廣西2017批次揮發(fā)油類物質含量較相似,浙江、廣西和四川3個產地郁金藥材的揮發(fā)油成分含量各不相同。本研究結果在醫(yī)院臨床實踐或者工廠配方制劑生產過程中可起到參考價值,以提高和控制產品的質量。本研究還應用NIRs對中藥郁金的全組分測定,經統(tǒng)計學方法移除基線漂移和矯正散射影響后,構建NIRs指紋圖譜,由NIRs解析的結果表明3個產地5個批次的郁金藥材存在組分間的差異,可以被鑒定并區(qū)分。