呂愛軍， 常銀霞, 張向梅， 齊 萌

(1.臨汾職業(yè)技術(shù)學(xué)院，山西臨汾 041000； 2.山西中醫(yī)藥大學(xué)，山西太原 030619； 3.山西師范大學(xué)現(xiàn)代文理學(xué)院，山西臨汾 041000)

甲氨蝶呤(MTX)是一種葉酸類似物的抗葉酸制劑，廣泛用于治療白血病和骨肉瘤等惡性腫瘤[1 - 2]，其結(jié)構(gòu)式見圖1。測定MTX的方法已有多種，如熒光偏振免疫法[3]、毛細(xì)管電泳法(CE)[4 - 5]和高效液相色譜法(HPLC)[6 - 7]。然而，這些方法都有一定的局限性，CE法精確度差，HPLC法需要復(fù)雜的樣品制備過程。熒光分光光度法簡單實(shí)用且具有高的靈敏度，廣泛用于檢測一些無機(jī)和有機(jī)分子[8 - 9]。目前，熒光光譜法檢測MTX未見文獻(xiàn)報道。

圖1 MTX、CB[7]和BER的化學(xué)式Fig.1 The Structures of MTX,CB[7] and BER

葫蘆[n]脲(CB[n])是一類大環(huán)化合物[10]，具有疏水的空腔和環(huán)繞的羰基氧原子組成的端口，空腔兩端的多個羰基可通過離子-偶極/氫鍵作用與客體分子結(jié)合[11 - 12]，因此CB[n]及其衍生物的研究引起越來越多人的關(guān)注。而CB[7](圖1)具有很好的水溶性以及可與很多有機(jī)化合物和陽離子形成絡(luò)合物[13 - 14]，具有化學(xué)穩(wěn)定性高、生物毒性低等特點(diǎn)，在藥物分析及藥物轉(zhuǎn)運(yùn)等方面具有潛在的應(yīng)用價值。

本文中我們把小檗堿(BER)(圖1)作為熒光探針檢測生物流體中的MTX。MTX的水溶液幾乎沒有熒光，當(dāng)BER加入到CB[7]溶液中時，熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)，當(dāng)一定量的MTX加入到CB[7]-BER體系中時，體系的熒光強(qiáng)度顯著猝滅?；跓晒鈴?qiáng)度變化和MTX的濃度之間的線性關(guān)系，提出了一種簡單的測定MTX的熒光測定新方法。并通過紫外-可見光譜、1H NMR和理論計(jì)算對其作用機(jī)理進(jìn)行探究。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器及試劑

Agilent Cary Eclipse型熒光分光光度計(jì)(美國，安捷倫科技公司)；U-3010型紫外-可見分光光度計(jì)(日本，日立公司)；pHS-3C型pH計(jì)(上海天達(dá)儀器有限公司)。

葫蘆[7]脲(CB[7])按文獻(xiàn)方法[15]合成。鹽酸小檗堿(BER)、甲氨蝶呤(MTX)、5-氟尿嘧啶和亞葉酸鈣均為色譜純，購自中國藥品生物制品檢定所。用二次蒸餾水配成濃度分別為100、250和200 μg·mL-1的MTX、5-氟尿嘧啶和亞葉酸鈣的儲備液。CB[7]和BER分別用二次蒸餾水配成0.9×10-4mol·L-1的儲備液。工作液用二次蒸餾水稀釋而得。實(shí)驗(yàn)所用其它試劑均為分析純，水為二次蒸餾水。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1熒光光譜測定在10 mL比色管中，依次加入1 mL 0.9×10-4mol·L-1CB[7]溶液，1 mL 0.9×10-4mol·L-1BER，1 mL pH=2.0的三酸緩沖溶液，隨后移入一定量的MTX標(biāo)準(zhǔn)溶液，用水定容，并在室溫下振蕩15 min。用1.0 cm的石英池，激發(fā)和發(fā)射光譜的狹縫均為5.0 nm,掃速為1 200 nm·min-1，以344 nm為激發(fā)波長，在496 nm處測量溶液的熒光強(qiáng)度(FBER-CB[7]-Drug)，同時測定空白溶液的熒光強(qiáng)度(FBER-CB[7])。獲得熒光猝滅值：ΔF=FBER-CB[7]-FBER-CB[7]-Drug。

1.2.2血漿樣品分析取2.0 mL血漿樣品于離心管中，移入0.1 mL的藥物溶液、適量的5-氟尿嘧啶和亞葉酸鈣溶液，攪拌，再加入6.0 mL甲醇，以10 000 r·min-1離心15 min，脫蛋白，然后取5.0 mL的上清液用水定容到50 mL，隨后按熒光光譜測定步驟進(jìn)行測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 CB[7]-MTX包合物的熒光光譜特征

MTX表現(xiàn)出較弱的熒光發(fā)射，當(dāng)向MTX溶液中加入CB[7]時，MTX的熒光強(qiáng)度沒有明顯的改變(圖2(A))。BER也表現(xiàn)出弱的熒光發(fā)射，當(dāng)向BER溶液中加入CB[7]時，觀察到熒光強(qiáng)度顯著增加；向CB[7]-BER體系中加入MTX時，觀察到熒光強(qiáng)度顯著猝滅(圖2(B))。熒光強(qiáng)度隨MTX濃度的增大而減小，這可能是由于MTX和BER客體競爭CB[7]主體分子的空腔，使BER分子離開CB[7]的空腔進(jìn)入水溶液，因此，CB[7]-BER體系的熒光強(qiáng)度減少是由于CB[7]和MTX之間形成了新的包合物。

圖2 (A)MTX和MTX+CB[7]的熒光光譜圖;(B)BER、BER+CB[7]和BER+CB[7]+MTX熒光光譜圖Fig.2 (A)Fluorescence spectra of MTX and MTX+CB[7];(B)Fluorescence spectraof BER,BER+CB[7] and BER+CB[7]+MTX Excitation and Emission slit 5 nm;Scanning speed:1 200 nm ·min-1.1 cm quartz cell,cMTX=15.0 μg·mL-1,cCB[7]=CBER=0.9×10-5 mol·L-1,pH=2.0.

2.2 CB[7]和MTX的包合比

圖3 (A)在MTX溶液中滴加不同濃度CB[7]的吸收光譜;(B)吸光度vs.NCB[7]/NMTX曲線(插圖為ΔA vs.[NMTX/(NCB[7]+NMTX)]曲線)Fig.3 (A)Absorption spectrum of MTX(4.1 μg·mL-1) in the presence of CB[7];(B)Absorbance vs.NCB[7]/NMTX curve(Insert:ΔA vs.[NMTX/(NCB[7]+NMTX)] curve)cMTX=4.1 μg·mL-1.

2.3 1H NMR和2D NOESY譜

通過1H NMR研究了CB[7]和MTX的相互作用。從圖4可以看出，當(dāng)把CB[7]加到MTX溶液中時，MTX對應(yīng)的質(zhì)子的化學(xué)位移都發(fā)生了不同程度的移動，蝶啶環(huán)上質(zhì)子H7的移動最大(1.0 ppm)，這表明蝶啶環(huán)可能位于CB[7]腔內(nèi)。而且從氫譜中觀察到CB[7]和MTX的化學(xué)計(jì)量比達(dá)到2∶1時，藥物分子上的質(zhì)子幾乎不發(fā)生移動了。這表明一個MTX分子會與兩個CB[7]分子相互作用，這結(jié)果與前面紫外-可見光譜得出的結(jié)果一致。證明了CB[7]和MTX發(fā)生了相互作用。

圖4 MTX(0.25 mmol·L-1)和CB[7]的 1H NMR譜圖Fig.4 1H NMR spectra(600 MHz) of MTX(0.25 mmol·L-1) with CB[7] in D2O MTX∶CB[7](a)1∶0;(b)2∶1;(c)1∶1;(d)1∶1.5;(e)1∶2;(f)1∶3.

圖5 MTX(0.5 mmol·L-1)和CB[7](1 mmol·L-1)在D2O(0.01 mol·L-1 DCl)中的部分NOESY譜圖Fig.5 Partial NOESY spectrum(600 MHz,295 K) of MTX(0.5 mmol·L-1) with CB[7](1 mmol·L-1) in D2O (containing 0.01 mol·L-1 DCl)

2.4 pH的影響

在pH=1～12范圍內(nèi)考察了pH值對所形成包合物的影響。發(fā)現(xiàn)所有的包合物在pH為2.0時顯示最大變化。因此，確定pH值等于2.0的三酸緩沖溶液用于整個實(shí)驗(yàn)。

2.5 靈敏度與選擇性

往BER-CB[7]溶液中加入MTX時，熒光強(qiáng)度降低，在一定的范圍內(nèi)，熒光猝滅值(ΔF)和MTX的濃度呈很好的線性。線性范圍是0.2～15 μg·mL-1，線性方程為：ΔF=30.385c+21.974(c:μg·mL-1)，相關(guān)系數(shù)為0.9988，檢測限為0.06 μg·mL-1，說明此方法有很高的靈敏度。

甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶(5-FU)和亞葉酸鈣(LV)用于聯(lián)合治療晚期胃癌和結(jié)腸癌。在CB[7]-BER溶液中加入適量的5-氟尿嘧啶、亞葉酸鈣時，熒光強(qiáng)度幾乎無變化。當(dāng)CB[7]-BER-MTX溶液中加入適量的5-氟尿嘧啶、亞葉酸鈣時，熒光強(qiáng)度也幾乎沒有改變。因此，所提出的方法具有良好的選擇性。

2.6 加標(biāo)血漿樣品的測定

血漿中的蛋白對測定有一定的影響，用適量甲醇去蛋白后，即可消除干擾。通過對5種濃度藥物加標(biāo)回收率進(jìn)行測定，每個濃度平行測定5次，回收率達(dá)到97.6%～101.7%，表明該探針可用于檢測生物流體中MTX，并且有較好的精密度和準(zhǔn)確度。數(shù)據(jù)如表1所示。

表1 加標(biāo)血漿樣品MTX的測定(n=5)

2.7 分子模型的理論計(jì)算

采用Gaussian 09程序包，用半經(jīng)驗(yàn)方法PM6對MTX-CB[7]包合物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了優(yōu)化(圖6)。在能量最低結(jié)構(gòu)中觀察到，MTX中的OH/NH2基團(tuán)與CB[7]的羰基氧原子之間形成O-H…O/N-H…O氫鍵，使結(jié)構(gòu)處于穩(wěn)定狀態(tài)。MTX中的蝶啶環(huán)鉆進(jìn)了CB[7]的空腔，芳香環(huán)接近于主體分子的寬邊緣。這個結(jié)果與1H NMR和2D NOESY的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

圖6 CB[7]-MTX包合物的能量最低結(jié)構(gòu)的模型圖(兩個視角) Fig.6 Optimized Structures of CB[7]-MTX Complex(two points of view) Colour codes:oxygen,red;carbon,yellow;nitrogen,blue;hydrogen,grey.

3 結(jié)論

建立了一種檢測甲氨蝶呤的新的熒光方法，此方法靈敏度高，選擇性好，經(jīng)濟(jì)，易操作，并成功地應(yīng)用于生物流體中藥物的測定。通過熒光光譜、紫外-可見光譜、1H NMR、2D NOESY和理論計(jì)算相互佐證，證實(shí)MTX與CB[7]可以形成穩(wěn)定的包合物，包合作用的形成有望降低抗癌藥物甲氨蝶呤的毒性，提高藥物的療效。