張 暉， 薛洪寶， 陳飛劍， 王 杰， 王 充， 李柏青*

(1.蚌埠醫(yī)學院化學教研室,安徽蚌埠 233030； 2.蚌埠醫(yī)學院感染與免疫安徽省重點實驗室,安徽蚌埠 233030)

表面等離子共振(Surface Plasmon Resonance,SPR)是應(yīng)用金屬表面等離子與入射光產(chǎn)生共振的一種物理光學現(xiàn)象[1 - 3]，為一種實時監(jiān)測生物傳感芯片上的配體與分析物相互作用全過程的新型技術(shù)手段[4]。與傳統(tǒng)方法相比，它最大優(yōu)點就是不需對分析物進行標記，靈敏度高、專屬性強、消耗樣品少[5 - 7]。該技術(shù)是對生物分子相互作用進行檢測研究比較理想的方法之一[8]，目前已廣泛用于蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)、抗原-抗體反應(yīng)以及細胞、病毒、細菌間的相互作用分析[9 - 12]。

蛋白質(zhì)A(Protein A)來源于金黃色葡萄球菌細胞壁[13]，在一定酸度(pH=1～10)下能夠維持其活性，且穩(wěn)定性非常好。蛋白A活性非常強，能與大部分哺乳動物的免疫球蛋白(抗體)發(fā)生特異性結(jié)合[14]，并且不同免疫球蛋白與蛋白A的特異性結(jié)合難易程度不同，甚至差異很大[15]。本實驗依據(jù)抗原-抗體特異性結(jié)合性質(zhì)，運用SPR生物傳感器技術(shù)，探索建立測定兩種抗人T細胞表面分子的單克隆抗體(抗人TCRγδ和抗人CD3-PE)分別和蛋白A結(jié)合的動力學和熱力學常數(shù)的方法。實驗測出了這兩個特異性結(jié)合的動力學常數(shù)：結(jié)合速率常數(shù)ka、解離速率常數(shù)kd、活化能Ea，以及平衡常數(shù)Ka、焓變ΔH等熱力學常數(shù)，目前這類數(shù)據(jù)在文獻里非常少見。為蛋白A分離和純化抗體調(diào)整操作條件，避免主觀盲目性，提高效率，提供必要的科學參考，具有一定的實際應(yīng)用價值。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

SR 7500DC型雙通道SPR儀、蛋白A檢測芯片(Planar Protein A Sensor Chip)購于美國Reichert公司；pHS-3C酸度計(上?？茖W儀器有限公司)；0.22 μm水相混合纖維素酯膜(海寧市正興特種過濾設(shè)備制造有限公司)。

抗人CD3單克隆抗體-藻紅蛋白(PE)復合物(CD3-PE)溶液，IgG2a，20 μg/mL，購自天津協(xié)科生物科技有限公司；抗人TCRγδ單克隆抗體(TCRγδ)，純化凍干粉，購自Beckman-Coulter公司(編號：IM1349)，IgG1,0.1 mg/manch，根據(jù)說明用0.5 mL超純水溶解，用抗體稀釋液稀釋至40 μg/mL。NaOH、HCl、十二烷基硫酸鈉(SDS)、甘氨酸等試劑均為分析純。超純水(18.2 MΩ·cm)由杭州永潔達凈化科技有限公司的實驗室純水和超純水系統(tǒng)提供。PBST-疊氮鈉(0.1%)運行緩沖溶液pH值(7.10至8.48)用稀HCl和NaOH溶液調(diào)節(jié)。通過SPR儀的所有溶液都要經(jīng)過0.22 μm的濾膜過濾，再進行脫氣處理。

1.2 實驗方法

取出SPR儀流通池，放置蛋白A傳感芯片后，用PBST-疊氮鈉緩沖溶液(pH=7.36)運行至基線穩(wěn)定后，以右通道為參比通道，左通道注入抗人TCRγδ單克隆抗體或抗人CD3-PE溶液，根據(jù)實驗設(shè)定不同流速和運行時間。結(jié)束后用0.5%SDS-50 mmol/L甘氨酸(pH=2.00)緩沖溶液洗去表面結(jié)合的TCRγδ或CD3-PE，隨即用PBST-疊氮鈉運行緩沖溶液沖洗，等基線穩(wěn)定后再進行下一次進樣。TCRγδ或CD3-PE與蛋白A的反應(yīng)進程以響應(yīng)折射率(Refractive Index Unit，RIU)表示，并且RIU值與TCRγδ或CD3-PE和蛋白A特異性結(jié)合的數(shù)量(即反應(yīng)強度)呈正相關(guān)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

傳感圖曲線根據(jù)左通道數(shù)據(jù)扣除右通道(參比)數(shù)據(jù)繪出，再運用Integrated SPR Autolink 和Clamp XP軟件分析和擬合，計算結(jié)合速率常數(shù)ka、解離速率常數(shù)kd。ka或結(jié)合平衡常數(shù)Ka和溫度間的關(guān)系采用Origin 8.0軟件處理、統(tǒng)計、分析和作圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 TCRγδ或CD3-PE抗體與蛋白A反應(yīng)條件選擇

圖1 pH對TCRγδ與蛋白A結(jié)合影響的傳感圖Fig.1 SPR sensorgrams of effect of pH on TCRγδ monoclonal antibody(TCRγδmAb) interacting with protein A pH:8.48(a)，7.90(b)，7.62(c)，7.33(d)，7.10(e).

2.1.1酸度對抗體與蛋白A反應(yīng)的影響用pH分別為7.10、7.33、7.62、7.90、8.48的PBST-疊氮鈉溶液作為運行緩沖溶液，再分別用上述pH的PBST-疊氮鈉溶液配制TCRγδ濃度一定的溶液，進樣分析，傳感圖見圖1。由圖1可知，在所實驗的溶液pH范圍內(nèi)，pH升高，TCRγδ抗體與蛋白A反應(yīng)能力增強，但pH>7.90時，兩者的結(jié)合能力增加甚微；同樣的方法可以得到CD3-PE抗體與蛋白A反應(yīng)強度在pH=7.90附近比較強。本實驗選擇pH為7.90作為體系反應(yīng)的酸度條件。

2.1.2離子強度對抗體與蛋白A反應(yīng)的影響含有NaCl濃度為0、25、50、75、100 mmol/L的PBST-疊氮鈉溶液(pH=7.90)分別作為運行緩沖溶液，以上述運行緩沖溶液配制濃度一定的TCRγδ或CD3-PE溶液并進樣分析。由所得結(jié)果可知，TCRγδ或CD3-PE抗體與蛋白A反應(yīng)響應(yīng)值(即反應(yīng)強度)隨NaCl濃度(即離子強度)的升高而增強。這說明較高的離子強度對該反應(yīng)有促進作用。但是根據(jù)文獻報道[16]，高離子強度對反應(yīng)體系中其它蛋白質(zhì)雜質(zhì)和蛋白A的反應(yīng)也有促進作用，即高離子強度使反應(yīng)的選擇性降低。所以本實驗選擇含NaCl濃度為75 mmol/L，pH=7.90的PBST-疊氮鈉溶液作為運行緩沖溶液。

2.2 方法重現(xiàn)性實驗

以含75 mmol/L NaCl的PBST-疊氮鈉溶液(pH=7.90)配制濃度一定的TCRγδ和CD3-PE溶液，分別進樣分析5次。分別計算兩抗體與蛋白 A 反應(yīng)響應(yīng)最大值的相對標準偏差(RSD)為5.68%和4.95%。說明該方法能夠用于測定TCRγδ或CD3-PE抗體與蛋白A 反應(yīng)的ka和kd。

2.3 TCRγδ或CD3-PE抗體與蛋白A特異性結(jié)合的ka和kd的測定

溫度20 ℃時，濃度不同的TCRγδ或CD3-PE溶液進樣后，所得傳感圖見圖2和圖3。

圖2 20 ℃時不同濃度TCRγδ與蛋白A結(jié)合傳感圖Fig.2 SPR sensorgrams of effect of concentrations of TCRγδmAb on TCRγδmAb interacting with protein A at 20 ℃ Concentrations of TCRγδmAb(mol/L)：5.00×10-8(a)，3.33×10-8(b)， 8.35×10-9(c)，4.18×10-9(d)，2.08×10-9(e).

圖3 20 ℃時不同濃度的CD3-PE與蛋白A結(jié)合傳感圖Fig.3 SPR sensorgrams of effect of concentrations of CD3-PE on CD3-PE interacting with protein A at 20 ℃ Concentrations of CD3-PE(mol/L)：2.67×10-8(a)，1.33×10-8(b)，6.67×10-9(c)， 3.33×10-9(d)，1.67×10-9(e).

將圖2和圖3中的數(shù)據(jù)通過Clamp XP軟件處理，得到TCRγδ或CD3-PE與蛋白A結(jié)合的動力學常數(shù)：ka和kd(20 ℃)，并計算出熱力學常數(shù)：Ka(20 ℃)，見表1。表1中數(shù)據(jù)比較接近文獻報道[17]中的ka、kd與Ka值，實驗時所選擇的反應(yīng)體系的酸度、離子強度等結(jié)合條件的差異是兩組數(shù)據(jù)存在差異的原因。

表1 蛋白A與TCRγδ或CD3-PE的結(jié)合常數(shù)(20 ℃)

Note:ka,association rate constant;kd,dissociation rate constant;Ka(Ka=ka/kd),association equilibrium constant.

TCRγδ或CD3-PE分別與蛋白A反應(yīng)的Ka值(107數(shù)量級)很接近，表明蛋白A 分別與TCRγδ或CD3-PE反應(yīng)程度(即親和力)差別不大，并且為中等強度結(jié)合。

2.4 TCRγδ或CD3-PE抗體與蛋白A反應(yīng)活化能(Ea)、焓變(ΔH)的測定

分別在溫度15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃和35 ℃下，實驗不同濃度的TCRγδ或CD3-PE抗體與蛋白A的反應(yīng)情況，根據(jù)傳感圖得到上述溫度下兩反應(yīng)的ka、kd，并計算出Ka。運用作圖法可求出Ea、ΔH。

2.4.1抗體與蛋白A反應(yīng)Ea的測定根據(jù)Arrhenius方程[18]：

lgk=-Ea/2.303RT+lgA

(1)

式中，k表示反應(yīng)速率常數(shù)，Ea表示反應(yīng)活化能，R表示氣體常數(shù)，T為絕對溫度，A為一常數(shù)。由公式(1)可知，以lgk對1/T作圖，得到一條直線，直線的斜率為-Ea/2.303R，由此計算出Ea。

以15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃和35 ℃的TCRγδ或CD3-PE與蛋白A反應(yīng)的結(jié)合速率常數(shù)的對數(shù)lgk對1/T作圖，得圖4。由圖4可知，TCRγδ與蛋白A反應(yīng)結(jié)合速率常數(shù)的對數(shù)和溫度具有較好的線性關(guān)系，回歸直線的相關(guān)系數(shù)r=0.9707,說明該反應(yīng)符合公式(1)。直線的斜率-Ea/2.303R為-5.1967±0.6379，由此計算出TCRγδ與蛋白A反應(yīng)的Ea=(99.50±12.21) kJ·moL-1；同樣，CD3-PE與蛋白A反應(yīng)結(jié)合速率常數(shù)和溫度關(guān)系的回歸直線的相關(guān)系數(shù)r=0.9598，斜率為-6.7181±0.9725，Ea=(128.63±18.62)kJ·moL-1。TCRγδ或CD3-PE與蛋白A反應(yīng)的Ea比較接近，即兩種抗體分別和蛋白A反應(yīng)時所需要的能量相差不大，所以兩者與蛋白A反應(yīng)的ka很接近，見表1或圖4；溫度越高，ka或kd越大，見圖4。

2.4.2抗體與蛋白A反應(yīng)ΔH的測定根據(jù)Van’t Hoff方程[18]:

lgK=-ΔH/2.303RT+I

(2)

式中，K是在絕對溫度T下的結(jié)合平衡常數(shù)，ΔH是焓變，R是氣體常數(shù)，I為積分常數(shù)。由公式(2)可知，由結(jié)合平衡常數(shù)的對數(shù)lgK對對應(yīng)的溫度的倒數(shù)1/T做圖，得到一條直線，其斜率為-ΔH/2.303R，可計算出ΔH。

以15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃和35 ℃的TCRγδ或CD3-PE與蛋白A反應(yīng)的結(jié)合平衡常數(shù)的對數(shù)lgK對1/T作圖，得圖5。由圖可得，TCRγδ與蛋白A反應(yīng)結(jié)合平衡常數(shù)的對數(shù)和溫度有良好的線性關(guān)系，回歸直線的相關(guān)系數(shù)r=0.9784，說明該反應(yīng)符合公式(2)，直線的斜率-ΔH/2.303R為1.7337±0.1819，由此計算出TCRγδ與蛋白A反應(yīng)的ΔH=(-33.20±3.48) kJ·moL-1；同理，CD3-PE與蛋白A反應(yīng)結(jié)合平衡常數(shù)和溫度關(guān)系的回歸直線的相關(guān)系數(shù)r=0.9811，斜率為-4.9844±0.4898，ΔH=(95.43±9.38) kJ·moL-1。TCRγδ或CD3-PE與蛋白A反應(yīng)的ΔH值告訴我們：TCRγδ抗體與蛋白A反應(yīng)為放熱反應(yīng)，低溫時二者的結(jié)合程度較大；CD3-PE抗體與蛋白A反應(yīng)為吸熱反應(yīng)，高溫有利于兩者的結(jié)合，見圖5。

圖4 TCRγδ或CD3-PE抗體與蛋白A反應(yīng)結(jié)合速率常數(shù)和溫度的關(guān)系Fig.4 The relationship between temperature and association rate constant of the interaction of two antibodies with protein A respectively The interaction of TCRγδmAb with protein A; The interaction of CD3-PE with protein A.

圖5 TCRγδ或CD3-PE抗體與蛋白A結(jié)合平衡常數(shù)和溫度的關(guān)系Fig.5 The relationship between temperature and association equilibrium constant of the interaction of two antibodies with protein A respectively The interaction of TCRγδmAb with protein A; The interaction of CD3-PE with protein A.

本文中TCRγδ或CD3-PE兩種抗體分別與蛋白質(zhì)A反應(yīng)的ka、Ka和Ea比較接近，但兩反應(yīng)ΔH有些差異。我們認為TCRγδ和CD3兩抗體類型相同、結(jié)構(gòu)相近、性質(zhì)類似，與蛋白A反應(yīng)時的ka、Ka和Ea很接近，說明抗人CD3單克隆抗體與藻紅蛋白(PE)結(jié)合形成復合物CD3-PE后對CD3的活性基本上沒有影響。但當CD3-PE與蛋白A特異性結(jié)合時，可能伴隨復合物CD3-PE中部分CD3與PE間化學鍵的松弛而吸收能量，導致抗人CD3-PE與蛋白A結(jié)合的ΔH與TCRγδ與蛋白A結(jié)合的ΔH有點差異。這一點尚需進一步實驗進行驗證。

3 結(jié)論

本研究采用SPR技術(shù)測定兩種抗人T細胞單克隆抗體(抗人TCRγδ和抗人CD3-PE抗體)與蛋白質(zhì)A特異性結(jié)合的動力學常數(shù)和熱力學常數(shù)，為抗體純化和免疫分析提供參考和必要的理論支撐。該方法不需對分析物進行標記，快速、靈敏度高、專屬性強、消耗樣品少，是檢測和分析抗體和蛋白質(zhì)A相互作用較理想的方法之一。