婁珀瑜, 劉 振, 孫 洋, 冉 鳴

( 1. 西安文理學院 服務地方研究院， 陜西 西安 710065； 2. 西安文理學院 化學工程學院， 陜西 西安 710065；3. 四川師范大學 化學與材料科學學院， 四川 成都 610066)

在癌癥作為威脅人類生命健康的主要疾病之一的今天，探討高效低毒抗腫瘤藥物的機制具有非常重要的意義.該領域目前在以DNA作為靶點的抗腫瘤小分子藥物研究方面關注頗多[1-2].萘酰亞胺類化合物具有強烈熒光、良好熱穩(wěn)定性及較高量子效率等特征，可用來作為潛在的光敏生物單元以及抗腫瘤劑[3-4].自3-硝基單萘酰亞胺類衍生物被證明能有效嵌入DNA之后[5]，已研制出進入臨床實驗的米托萘胺[6]和氨萘非特[7]等藥物，隨后研發(fā)出的雙萘酰亞胺能夠提高嵌入劑分子與DNA的親和力并形成穩(wěn)定的復合物[8]，在此基礎上研制出的依利萘法德[9]和雙萘法德[10]已處于臨床研究階段.

本研究設計合成了新型1,8-萘酰亞胺衍生物，通過紅外光譜、紫外可見吸收光譜、熒光光譜、圓二色譜和熱變性實驗對合成化合物與小牛胸腺DNA(Ct-DNA)的鍵合行為進行了研究，同時利用四甲基偶氮唑藍(MTT)法檢驗了合成化合物對Bel-7402、HL-60、A549以及Hela等4種細胞的體外抗腫瘤活性.此工作為研究嵌入單元與鏈接基之間的特異性提供了實驗和理論依據(jù)，同時也為其他化合物鏈接基的分子設計奠定一定的基礎.

1 實驗部分

1.1主要試劑4-溴-1,8-萘酐、四氫糠醇、CTAB(溴化十六烷基三甲胺)、乙二胺、丙二胺、丁二胺、戊二胺、己二胺、甲醇、無水乙醇等均購自上海阿拉丁試劑有限公司;小牛胸腺DNA(染發(fā)劑質量分數(shù)90%)購自Sigma試劑公司；DNA的PBS標準溶液(ρ=10.0 mg/mL，pH值7.4)自制；實驗用水為二次去離子水.

1.2主要儀器IS50傅里葉變換紅外光譜(美國熱電公司),Q2000差示掃描量熱儀(美國TA公司),AVANCF300MHz核磁共振儀(德國布魯克公司),F-7000熒光光譜儀(日本日立公司),UV-2550PC紫外光分光光度計(日本島津公司),Chirascan圓二色譜(英國應用光物理公司),ANKETGL-16C離心機(上海安亭科學儀器廠),PHS-3C型精密pH計(上海精密科學儀器有限公司).

圖 1 目標產物合成路線

化學式摩爾質量/(g·mol-1) m/zν(IR)/cm-1元素分析/%C23H24N2O8a456.15456.15(100%)457.16(25.5%)458.16(4.8%)3 354(NH)2 824(CH)1 756(CO)1 480(OH)C 60.52H 5.30N 6.14O 28.04C24H26N2O8b470.17470.17(100%)471.17(27.0%)472.18(3.4%)3 351(NH)2 834(CH)1 758(CO)1 470(OH)C 61.27H 5.57N 5.95O 28.04C25H28N2O8c484.18484.18(100%)485.19(27.7%)486.19(5.3%)3 344(NH)2 823(CH)1 746(CO)1 470(OH)C 61.97H 5.83N 5.78O 26.42C26H30N2O8d498.20498.20(100%)499.20(29.2%)500.21(4.0%)3 354(NH)2 814(CH)1 753(CO)1 489(OH)C 62.64H 6.07N 5.62O 25.67C27H32N2O8e512.22512.22(100%)513.22(29.9%)514.22(6.1%)3 352(NH)2 824(CH)1 736(CO)1 485(OH)C 63.27H 6.29N 5.47O 24.97

1.3萘酰亞胺探針的合成如圖1，按照文獻[11]報道的方法制備中間產物1，其結構經化學和光譜法(1H NMR，IR)表征后與文獻報道相一致.接著在圓底燒瓶中加入中間產物1(2 mmol)、四氫糠醇(5 mL)、CTAB(0.13 g)以及二甲基氨基乙醇(10 mL)，60 ℃下攪拌加熱6 h，以0.5 mol/L的乙醇溶液(溶劑氯仿)萃取得到不同鏈長的黃色固體2(a～e).最后以二氯甲烷為溶劑，體積分數(shù)為10%的乙酸乙酯為流動相進行柱層析，各個探針表征數(shù)據(jù)如表1.

2 結果與討論

2.1探針對Ct-DNA紅外光譜的影響在Ct-DNA中分別滴加a～e探針，在波長為1 000～5 000 cm-1測其紅外光譜，如圖2所示.

1: DNA; 2: a+DNA; 3: b+DNA;

可以看出，Ct-DNA分別在1 100和1 800 cm-1處因ON振動出現(xiàn)吸收峰，當Ct-DNA加入熒光探針后，在1 100和1 800 cm-1處出現(xiàn)了明顯強吸收.此現(xiàn)象可以說明，加入的探針被Ct-DNA包圍后，可能在Ct-DNA表面同Ct-DNA結合，也可能嵌插到Ct-DNA內部.由于在1 100 cm-1處吸收強度變化十分明顯，故此處探針以嵌插的方式同Ct-DNA結合的可能性較大.此外，隨著探針鏈長增加，吸收強度逐漸減小，說明探針與Ct-DNA的鍵合作用隨探針鏈長的增加而減弱，這與文獻[12]中的報道一致.

2.2探針對Ct-DNA紫外可見吸收光譜的影響在5個5 mL比色管中分別加入2 mL 0.5 mg/mL的Ct-DNA，再分別加入0、10、20、30和40 μL探針溶液，室溫放置15 min后，以Ct-DNA溶液為參比，掃描300～500 nm處的紫外吸收光譜如圖3所示.

V(DNA)=2 mL； A～D=10、20、100、200 μL

在探針a～e與Ct-DNA的鍵合紫外可見吸收光譜圖中，可以看到在450 nm處出現(xiàn)強吸收峰，這是由于n→π*躍遷而產生.探針a～e的吸收強度隨著探針體積的增大而增大，最大吸收峰表現(xiàn)出不太明顯的藍移，這是由探針與Ct-DNA鍵合后的疏水作用而引起的.圖3中隨著側鏈長度的增長，吸光度的變化不很明顯.

實驗數(shù)據(jù)的曲線擬合處理如下式

A=Kc+b,

(1)

其中,A為吸光度,c為探針濃度.

數(shù)據(jù)處理結果如表2所示,可以得知探針a～e與Ct-DNA的結合常數(shù)在0.539 1、0.528 4、0.498 7、0.534 5和0.522 4處.

表 2 通過紫外可見吸收光譜研究探針a～e與 Ct-DNA作用的鍵合常數(shù)K與光照性質

根據(jù)圖3和表2，可以表明探針a～e與Ct-DNA的結合表現(xiàn)出相似的鍵合型.由此可以猜測，不同側鏈長度的探針a～e對Ct-DNA的鍵合性能有很弱的影響.但是，通過對a～e探針的相對比較，探針a的吸收強度比其他探針稍微大一些.由此可以說明，探針a與其他探針相比能夠更好地嵌入到Ct-DNA中.

2.3探針對Ct-DNA熒光發(fā)射光譜的影響在5個5 mL比色管中分別加入2 mL 0.5 mg/mL的Ct-DNA，再分別加入0、10、20、30和40 μL的探針溶液.室溫放置15 min后，以Ct-DNA溶液為參比，掃描350～650 nm熒光發(fā)射光譜，如圖4所示.

在探針Ct-DNA熒光譜圖中，420 nm周圍出現(xiàn)高頻，這表明隨著探針體積增加，親水作用明顯增強，在譜圖中明顯出現(xiàn)了約10 nm的紅移.在圖5的(a)、(b)圖中產生一組新發(fā)射峰，說明探針a、b與Ct-DNA可能發(fā)生了嵌入作用，而其他探針可能發(fā)生的是表面結合作用.由于探針a比探針b的熒光發(fā)射強度大，使得探針a能更好嵌入Ct-DNA中.

探針與Ct-DNA結合激發(fā)態(tài)分子間碰撞所發(fā)生的相互作用過程可以用探針與Ct-DNA作用的動態(tài)增強過程來反映，用Stern-Volmer方程[13]描述為

F0/F=1+KSVca,

(2)

其中,F0和F分別為探針與Ct-DNA作用前后的熒光強度，KSV為熒光增強常數(shù)，用來衡量探針的增強速率，ca表示探針的濃度.

對于探針與Ct-DNA作用的熱力學函數(shù)[14-17]，利用如下公式進行計算：

ln(K2/K1)=(1/T1-1/T2)ΔH/R,

(3)

ΔG=-RTlnK=ΔH-TΔS,

(4)

其中，R為氣體常數(shù)，T為溫度，K為結合常數(shù).當溫度變化不大時，焓變ΔH可以看做是一個常數(shù)，結果見表3.

表3中呈現(xiàn)的不同溫度下的熱力學數(shù)據(jù)均有△H<0，表明探針與Ct-DNA的結合釋放熱量.通過文獻[18]總結出的生物大分子與小分子結合力類型的熱力學規(guī)律可知，對于疏水作用力而言，△H>0，△S>0；對于氫鍵或者范德華力而言，△H<0，△S<0；對于靜電作用力而言，△H<0.由于表3的數(shù)據(jù)均小于0，可知探針與Ct-DNA的結合是焓熵協(xié)同驅動過程，且以氫鍵與靜電作用力結合為主.Takenaka等[19]報道藥物與Ct-DNA發(fā)生嵌插結合的顯著特征是氫鍵作用，也更進一步證明探針與DNA的結合方式是嵌插.

表 3 探針與Ct-DNA不同溫度下作用的結合常數(shù)及熱力學參數(shù)

由此推斷，探針與Ct-DNA相互作用過程是放熱的焓熵協(xié)同驅動過程.當探針Ct-DNA相互作用時，探針的雙羧基插入DNA的雙螺旋結構的堿基對之間，以氫鍵和靜電作用進行相互作用.

2.4探針對Ct-DNA圓二色光譜的影響在5個5 mL比色管中分別加入2 mL 0.5 mg/mL的Ct-DNA，再分別加入0、10、20、100和200 μL的探針溶液.室溫放置15 min后，以Ct-DNA溶液為參比，掃描200～300 nm熒光發(fā)射光譜，如圖5所示.

μmol/L

分析結果可見，正峰表示Ct-DNA的堿基堆積程度，負峰表示Ct-DNA的螺旋松散程度[20].Ct-DNA的圓二色譜在276 nm處有一正峰，在243 nm處有一負峰，a～e加入均可引起圓二色譜正峰增強、負峰減弱，表明該類化合物可以嵌入Ct-DNA分子[21].經對比分析可知，隨著合成物連接基長度的增加，探針正峰和負峰強度增加和減弱程度呈下降趨勢，即e

2.5探針與Ct-DNA作用的熱分析在25～120 ℃范圍內，以3 ℃/min的升溫速率，對所得探針與Ct-DNA進行了熱重-差熱分析，如圖6所示.純Ct-DNA在36 ℃左右開始放熱，在45 ℃左右放熱基本結束.當將探針加入Ct-DNA中后，從40 ℃左右開始放熱，a～e探針分別在78、70、69和68 ℃放熱基本結束.探針a與Ct-DNA放熱最多，說明探針a與Ct-DNA的結合更緊密，為嵌插作用.其他探針與Ct-DNA可能進行表面結合作用或溝槽結合作用.此現(xiàn)象表明，探針與Ct-DNA作用隨著鏈長的增加而減弱，其中探針a與Ct-DNA的作用最緊密，這與前面各圖譜的結果相符合.

圖 6 探針與Ct-DNA作用的DSC曲線

2.6抗腫瘤作用研究利用四甲基偶氮唑藍(MTT)染色法分別測定了探針a～e對A549、Hela、Bel-7402和HL-60細胞體外抗腫瘤活性.在以順鉑為陽性對照時，由表4的數(shù)據(jù)可以看出，對A549和Hela細胞株，增長探針側鏈，細胞毒性變化很大，但隨側鏈增長呈下降趨勢；對于Bel-7402和HL-60細胞株，探針側鏈的增長造成的細胞毒性變化很小，探針活性同時呈下降趨勢,其中，乙二胺修飾的A549細胞株的探針a為3.23 μmol/L，優(yōu)于陽性對照順鉑.因此探針與Ct-DNA分子的鍵合行為發(fā)現(xiàn)探針a對Ct-DNA有較好的抗腫瘤活性.

2.7探針嵌入DNA過程模擬圖由于小分子對核酸主要有非共價鍵結合、共價鍵結合和剪切作用3種方式，因此通過對圖6中各光譜曲線的分析，探針對Ct-DNA的作用可能存在的結合方式如圖7所示.

圖 7 探針與Ct-DNA可能的結合方式

圖7顯示表面結合的探針作用于Ct-DNA雙螺旋結構的外壁，無選擇性；溝槽結合是探針與Ct-DNA的大溝或小溝的堿基對邊緣直接作用；嵌插結合是探針中的平面成分嵌入Ct-DNA的堿基之間.

3 結論

通過縮合取代反應合成新型雙羧基型1,8-萘酰亞胺類化合物，并研究了其與Ct-DNA的結合作用及結合模式.光譜研究結果表明探針以嵌插方式與Ct-DNA結合，并且隨著烷基鏈增加，誘發(fā)疏水作用增強從而導致嵌插入Ct-DNA的雙螺旋結構和堿基堆積力等結合作用減弱.熱力學研究結果表明，隨著探針烷基鏈的增加，放熱逐漸減少，結合作用減弱，烷基鏈最短的探針a同時具有較強的腫瘤細胞毒性作用.以上實驗結論說明探針a與Ct-DNA的嵌插結合更緊密，其他探針與Ct-DNA可能進行表面或溝槽結合作用.

綜上所述，雙羧基型1,8-萘酰亞胺類化合物的合成為新型腫瘤抑制劑的開發(fā)以及抗腫瘤活性機制研究提供了實驗依據(jù)和理論基礎.