彭真汾，葉清華，王 威，謝 倩，陳清西*

（福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院，福建 福州 350002）

橄欖（Canarium album (Lour.) Raeusch），為橄欖科（Burseraceae）橄欖屬（Canarium）植物[1]，主要分布于中國福建和廣東兩省，是我國南方特有的熱帶、亞熱帶果樹[2-3]。橄欖果實(shí)營養(yǎng)價(jià)值高，富含VC、鈣等營養(yǎng)物質(zhì)[2-3]，兼具較高的藥用價(jià)值[4-8]，是一種藥食兩用的水果[9]。橄欖有普通橄欖和清橄欖之分，普通橄欖口味酸澀，多用于加工，清橄欖口味清淡，回甘良好，品質(zhì)優(yōu)于普通橄欖，更適宜鮮食。為更加了解造成普通橄欖和清橄欖鮮食品質(zhì)差異的原因，本實(shí)驗(yàn)室前期在多酚代謝、糖代謝和氨基酸組分等方面展開研究[2-3,10]；其中林玉芳[2]利用橄欖果實(shí)氨基酸含量對橄欖風(fēng)味形成進(jìn)行解釋；池毓斌[11]通過氣相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜法測定橄欖果實(shí)氨基酸含量變化趨勢發(fā)現(xiàn)普通橄欖和清橄欖的甜味氨基酸存在差異，為揭示氨基酸在2 類橄欖鮮食品質(zhì)差異的研究提高理論依據(jù)。作為橄欖果實(shí)重要營養(yǎng)物質(zhì)及風(fēng)味組成成分的氨基酸，根據(jù)其狀態(tài)，可分為結(jié)合態(tài)的水解氨基酸和游離態(tài)的游離氨基酸[12-13]。游離氨基酸可分為呈味氨基酸和藥用氨基酸，能增加食物的風(fēng)味和藥用價(jià)值[14-15]，其比例和種類是作為評(píng)價(jià)植物品質(zhì)優(yōu)劣的主要指標(biāo)之一[16]。然而，目前在橄欖氨基酸上的研究多集中于水解氨基酸[2,17-19]，主要用于評(píng)價(jià)橄欖果實(shí)的營養(yǎng)價(jià)值，對評(píng)價(jià)風(fēng)味品質(zhì)的游離氨基酸研究仍鮮見報(bào)道[12-13]，對造成普通橄欖和清橄欖風(fēng)味差異的具體氨基酸及其代謝通路的研究幾乎沒有，并且對于甜味氨基酸與果實(shí)中糖之間相關(guān)性的研究甚少。

液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)屬于直接色譜法測定氨基酸，無需衍生，能夠簡單、快速測定氨基酸，即使在液相色譜難分離的情況下，質(zhì)譜能對目標(biāo)化合物進(jìn)行中性碎片掃描，則可發(fā)現(xiàn)并突出混合物中的目標(biāo)化合物，顯著提高信噪比[20]。目前已在血漿[21]、煙草[22]、中藥[23-24]等樣品氨基酸分析研究中得到應(yīng)用。因此，本實(shí)驗(yàn)在采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法定性定量測定普通橄欖‘長營’和清橄欖‘清欖1號(hào)’果實(shí)游離氨基酸的基礎(chǔ)上，通過多元統(tǒng)計(jì)分析方法找出2 類橄欖顯著差異的氨基酸，對其代謝通路進(jìn)行研究，并展開甜味氨基酸與果實(shí)中糖相關(guān)性的研究，為今后普通橄欖和清橄欖鮮食品質(zhì)的研究和調(diào)控提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

2015年‘長營’、‘清欖1號(hào)’橄欖采于福建省閩清縣久源橄欖專業(yè)合作社，僅采摘花后190 d，2016年于花后30 d開始，每隔20 d采摘1 次，共9 次；樣品采摘每個(gè)品種選取3 株橄欖樹，按照東南西北4 個(gè)方向挑選無畸形、無病蟲害且大小相近的橄欖果實(shí)于4 ℃保溫箱帶回實(shí)驗(yàn)室。

乙腈、甲酸、甲醇（均為色譜級(jí)） 德國Merck公司；乙酸銨、20 種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品（甘氨酸（Gly）、丙氨酸（Ala）、絲氨酸（Ser）、脯氨酸（Pro）、纈氨酸（Val）、蘇氨酸（Thr）、半胱氨酸（Cys）、亮氨酸（Leu）、異亮氨酸（Ile）、天冬酰胺（Asn）、天冬氨酸（Asp）、谷氨酰胺（Gln）、賴氨酸（Lys）、谷氨酸（Glu）、甲硫氨酸（Met）、組氨酸（His）、苯丙氨酸（Phe）、精氨酸（Arg）、酪氨酸（Tyr）、色氨酸（Trp））（均為色譜級(jí)） 美國Sigma公司；蒽酮、乙酸乙酯、濃硫酸、蔗糖、葡萄糖、3,5-二硝基水楊酸、氫氧化鈉、酒石酸鉀鈉、結(jié)晶酚、亞硫酸鈉、鹽酸、無水乙醇（均為分析純） 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Xevo TQ-S高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國Waters公司；LGJ-25C型冷凍干燥機(jī) 北京四環(huán)科學(xué)儀器廠有限公司；FW177型中草藥粉碎機(jī) 天津市泰斯特儀器有限公司；KQ-300DE型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；Allegra 64R型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 美國貝克曼庫爾特公司；DK-S22型電熱恒溫水浴鍋 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；RV10型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 德國IKA公司；UV WinLab V6紫外-可見分光光度計(jì) 鉑金埃爾默儀器（上海）有限公司；Infinite M200 PRO多功能酶標(biāo)儀 Tecan（奧地利）公司；0.22 μm型尼龍過濾器 天津津騰公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

先將每個(gè)氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品用不同體積分?jǐn)?shù)甲醇溶液配制成不同質(zhì)量濃度儲(chǔ)備液。吸取一定體積儲(chǔ)備液，用70%甲醇溶液定容至10 mL，配為混標(biāo)液。再吸取混標(biāo)液100、200、500 μL和800 μL，用70%甲醇溶液分別定容至1 000 μL，得到4 個(gè)質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別稀釋10、100 倍和1 000 倍，共獲得17 個(gè)不同質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液?；鞓?biāo)液中各氨基酸質(zhì)量濃度見表1，剩余各氨基酸的16 個(gè)質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液為稀釋所得。

表1 混標(biāo)液中20 種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度Table 1 Concentrations of 20 amino acids in mixed standard solution

1.3.2 橄欖果實(shí)預(yù)處理

將用4 ℃保溫箱帶回實(shí)驗(yàn)室的新鮮橄欖，立即洗凈、晾干，取果肉，一部分凍干并粉碎至過40 目篩，另一部分用液氮處理后一同保存于－40 ℃冰箱中備用。

1.3.3 橄欖果實(shí)游離氨基酸樣品的提取

稱取橄欖粉末0.5 g（精確至0.000 1 g）于50 mL離心管中，按料液比1∶41（g/mL）加入60%乙醇溶液，在超聲功率270 W、超聲溫度50 ℃條件下提取20 min后，置于室溫放至常溫，10 000 r/min離心10 min，最后上清液過0.22 μm尼龍過濾器作為橄欖果實(shí)游離氨基酸樣品，氨基酸含量測定結(jié)果以干質(zhì)量計(jì)。

1.3.4 色譜條件

色譜柱：Merck ZIC-pHILIC（100 mm×2.1 mm，5 μm）；柱溫40 ℃；流速0.4 mL/min；進(jìn)樣室溫度10 ℃；進(jìn)樣量2 μL；流動(dòng)相A為水-5 mmol/L乙酸銨溶液；流動(dòng)相B為乙腈-0.1%甲酸溶液；梯度洗脫程序見表2。

表2 流動(dòng)相梯度洗脫程序Table 2 Mobile phase gradients

1.3.5 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧正離子模式；監(jiān)測方式：多反應(yīng)監(jiān)測；離子源溫度150 ℃；毛細(xì)管電壓1.00 kV；錐孔電壓30 V；錐孔氣（N2）流量150 L/h；脫溶劑氣（N2）流量800 L/h；脫溶劑溫度400 ℃；碰撞氣（Ar）流速0.13 mL/min；定量方式為外標(biāo)法。其他質(zhì)譜條件如表3所示。

表3 20 種氨基酸的質(zhì)譜條件Table 3 Mass spectrometric conditions for 20 amino acids

1.3.6 Gln代謝相關(guān)酶活性測定

酶液提取均為稱取0.1 g橄欖果實(shí)，加入1 mL提取液（各個(gè)酶提取液不同），進(jìn)行冰浴研磨成勻漿，裝于1.5 mL離心管中，4 ℃、8 000×g離心10 min，取上清液，置于冰上待測。所有酶提取過程均在冰浴條件下進(jìn)行，且重復(fù)3 次。

1.3.6.1 Gln合成酶（glutamine synthetase，GS）測定

采用蘇州科銘生物技術(shù)有限公司試劑盒進(jìn)行GS活性的測定，結(jié)果以鮮質(zhì)量計(jì)。

1.3.6.2 Glu合成酶（glutamate synthase，GOGAT）測定

采用蘇州科銘生物技術(shù)有限公司試劑盒進(jìn)行GOGAT活性的測定，結(jié)果以鮮質(zhì)量計(jì)。

1.3.6.3 Asn合成酶（asparagine synthetase，AS）測定

采用蘇州科銘生物技術(shù)有限公司試劑盒進(jìn)行AS活性的測定，結(jié)果以鮮質(zhì)量計(jì)。

1.3.7 蔗糖、可溶性糖和還原糖含量測定

1.3.7.1 蔗糖含量測定

采用蘇州科銘生物技術(shù)有限公司試劑盒進(jìn)行蔗糖含量的測定，結(jié)果以干質(zhì)量計(jì)。

1.3.7.2 可溶性糖含量測定

參考王學(xué)奎[25]的方法，采用蒽酮比色法測定可溶性糖含量，結(jié)果以干質(zhì)量計(jì)。

1.3.7.3 還原糖含量測定

參考王學(xué)奎[25]的方法，采用3,5-二硝基水楊酸測定還原糖含量，結(jié)果以干質(zhì)量計(jì)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)整理和圖表制作采用Excel 2013軟件，顯著性分析、相關(guān)性分析采用SPSS 17.0軟件，儀器控制、數(shù)據(jù)采集軟件為Masslynx V4.1 SCN905；數(shù)據(jù)處理軟件（即積分和定量）：Masslynx中的Targetlynx；多元統(tǒng)計(jì)分析采用SIMCA-P＋ 11.0軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 主成分分析（principal component analysis，PCA）結(jié)果

圖1 ‘長營’和‘清欖1號(hào)’花后190 d果實(shí)游離氨基酸PCA得分圖Fig. 1 PCA scores of free amino acids in ‘Changying’ and ‘Qinglan 1 hao’ at 190 days after flowering

通過PCA方法，可以初步直觀分析樣品的聚集情況，發(fā)現(xiàn)樣品間成分是否存在差異[26-27]。為尋找影響橄欖果實(shí)鮮食口感差異的氨基酸，本研究將2015年和2016年普通橄欖‘長營’和清橄欖‘清欖1號(hào)’花后190 d（成熟果）所測定的20 種氨基酸分別進(jìn)行PCA，結(jié)果如圖1所示。圖1A中，2 個(gè)品種的橄欖分布在不同區(qū)域，具有明顯的區(qū)別，分類結(jié)果較為理想，表明2015年花后190 d 2 種橄欖果實(shí)游離氨基酸成分存在明顯差異；另外同一品種樣本分布較集中，表明組內(nèi)均一性良好，其中‘清欖1號(hào)’橄欖的組內(nèi)均一性優(yōu)于‘長營’。同理，圖1B中，2 個(gè)品種橄欖也得到了明顯的區(qū)分，表明2016年花后190 d 2 種橄欖果實(shí)游離氨基酸成分存在明顯的差異；而與2015年相反，其‘長營’橄欖組內(nèi)均一性優(yōu)于‘清欖1號(hào)’。

2.2 偏最小二乘投影判別分析（partial least squares projection to latent structure-discriminant analysis，PLS-DA）結(jié)果

表4 ‘長營’和‘清欖1號(hào)’花后190 d果實(shí)游離氨基酸VIP值與P值Table 4 Variable importance plot and P values of free amino acids in‘Changying’ and ‘Qinglan 1 hao’ at 190 days after flowering

PLS-DA與PCA相比，為一種有監(jiān)督的模式識(shí)別方法，能更大程度地將樣本進(jìn)行歸類區(qū)分，更有利于確定樣本之間的差異成分[28]。通常情況下在PLS-DA時(shí)，需通過變量權(quán)重（variable importance plot，VIP）值來描述變量的貢獻(xiàn)程度，一般認(rèn)為VIP值大于1的變量為潛在的差異成分[29]。對2015年2 個(gè)品種橄欖果實(shí)游離氨基酸進(jìn)行PLS-DA，得到R2X＝0.945，R2Y＝0.995，Q2＝0.994，其R2X、R2Y值接近1，表明模型穩(wěn)定可靠；Q2大于0.5，具有良好的預(yù)測性[29]。由圖2A1可知，2 個(gè)品種橄欖得到更好的分離，由圖2A2可知，遠(yuǎn)離中心點(diǎn)的氨基酸為潛在的差異氨基酸，為更準(zhǔn)確地獲得差異氨基酸，將VIP值與顯著性分析t檢驗(yàn)結(jié)合，只有VIP值大于1且P值小于0.05是差異氨基酸，由表4可知，差異氨基酸為Ala、Ser、Thr、Gln、Glu和Met；同理，對2016年2 類橄欖果實(shí)游離氨基酸進(jìn)行PLS-DA，如圖2B所示，得到＝0.882，＝0.997，Q2＝0.991，表明模型穩(wěn)定可靠，其VIP值與P值結(jié)果見表4，可知差異氨基酸為Ser、Leu、Asn、Asp、Gln、Glu和Tyr。綜合結(jié)果，認(rèn)為普通橄欖‘長營’和清橄欖‘清欖1號(hào)’的差異氨基酸為Ser、Gln和Glu。

圖2 2015年（A）和2016年（B）‘長營’和‘清欖1號(hào)’花后190 d果實(shí)游離氨基酸PLS-DA得分圖和載荷圖Fig. 2 PLS-DA scores plot and loading plot of free amino acids in ‘Changying’ and ‘Qinglan 1 hao’ at 190 days after fl owering in the year 2015 and 2016

2.3 差異氨基酸含量比較

圖3 ‘長營’和‘清欖1號(hào)’花后190 d差異氨基酸含量Fig. 3 Differential amino acid contents of ‘Changying’ and ‘Qinglan 1 hao’ at 190 days after flowering

如圖3所示，各差異氨基酸在2 個(gè)品種間都達(dá)到顯著差異（P＜0.05），其中各差異氨基酸含量均以‘清欖1號(hào)’的居高。3 個(gè)差異氨基酸2015年含量最高為‘清欖1號(hào)’Glu，2016年含量最高為‘清欖1號(hào)’Gln；將其含量進(jìn)行比較，可知2015年‘清欖1號(hào)’與‘長營’Ser、Gln和Glu的含量比例分別為3.41、1.16、1.39；2016年‘清欖1號(hào)’與‘長營’Ser、Gln和Glu的含量比例分別為2.66、2.12、1.34，其中差異順序?yàn)镾er＞Gln＞Glu。綜合含量值與差異倍數(shù)考慮，首先選擇Gln開展代謝通路研究。

2.4 Gln與其代謝相關(guān)酶活性變化關(guān)系

2.4.1 Gln代謝相關(guān)酶活性變化

圖4 Gln代謝通路簡圖Fig. 4 Schematic diagram of glutamine metabolic pathway

圖5 ‘長營’和‘清欖1號(hào)’成熟過程中GS、GOGAT、AS活性變化Fig.5 Changes in GS, GOGAT and AS activity during the ripening of ‘Changying’ and ‘Qinglan 1 hao’

GS、GOGAT和AS為Gln代謝通路上的酶，其代謝通路如圖4所示。由圖5可知，通過將2016年‘長營’和‘清欖1號(hào)’成熟過程中GS、GOGAT和AS活性變化進(jìn)行比較，GS活性變化在‘長營’和‘清欖1號(hào)’之間差異最大，‘長營’GS活性變化為先升后降并趨于穩(wěn)定，而‘清欖1號(hào)’GS活性變化為緩慢上升后緩慢下降，總體差異不大，呈平緩趨勢；對于GOGAT和AS活性變化趨勢在‘長營’和‘清欖1號(hào)’之間相似，兩者GOGAT活性變化除花后50 d差異外，其余基本相同，‘長營’GOGAT活性變化呈降-升-降-升-降趨勢，‘清欖1號(hào)’GOGAT活性變化呈升-降-升-降趨勢；兩者AS活性變化除花后170 d差異外，其余趨勢相似，‘長營’AS活性變化呈緩慢下降趨勢，最終趨于穩(wěn)定，‘清欖1號(hào)’AS活性變化除花后170 d突然升高外，其余也呈緩慢下降趨勢。

2.4.2 Gln與其代謝相關(guān)酶活性相關(guān)性分析

表5 Gln與其代謝相關(guān)酶相關(guān)性分析Table 5 Correlation coefficient between glutamine and metabolic enzymes

測定‘長營’和‘清欖1號(hào)’成熟過程Gln代謝相關(guān)酶活性，分析其酶活性變化趨勢，在此基礎(chǔ)上，為進(jìn)一步獲得對Gln代謝高度相關(guān)的酶，通過將對應(yīng)品種的成熟過程中Gln含量與其相關(guān)酶活性進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果如表5所示?！L營’Gln與AS活性呈顯著（P＜0.05）負(fù)相關(guān)（r＝－0.792），與GOGAT呈正相關(guān)（r＝0.392），與GS呈負(fù)相關(guān)（r＝－0.203）；‘清欖1號(hào)’Gln與GOGAT呈負(fù)相關(guān)（r＝－0.291），與AS（r＝－0.604）和GS （r＝－0.404）呈負(fù)相關(guān)，均不存在顯著性差異（P＞0.05）。

2.5 Gln與蔗糖、可溶性糖和還原糖含量變化關(guān)系

2.5.1 蔗糖、可溶性糖和還原糖含量變化

圖6 2016年‘長營’和‘清欖1號(hào)’成熟過程中蔗糖、可溶性糖、還原糖含量變化Fig. 6 Changes in sucrose, soluble sugar and reducing sugar contents during the ripening of ‘Changying’ and ‘Qinglan 1 hao’

如圖6所示，‘長營’和‘清欖1號(hào)’蔗糖含量在成熟過程中基本呈上升趨勢，‘長營’蔗糖含量為緩慢上升，花后130～170 d為其快速積累期，‘清欖1號(hào)’蔗糖含量上升幅度更大，其蔗糖含量在花后110 d后大量積累并高于‘長營’；‘長營’可溶性糖含量前期低，在花后50～90 d大量積累后緩慢下降，在花后150～170 d有一個(gè)短暫的上升期，總體含量低于‘清欖1號(hào)’，‘清欖1號(hào)’可溶性糖含量先升后降再升高，其含量在花后90～170 d大量積累，總體為上升的趨勢；‘長營’和‘清欖1號(hào)’還原糖含量趨勢相近，為降-升-降并趨于穩(wěn)定。

2.5.2 Gln與蔗糖、可溶性糖和還原糖含量相關(guān)性分析

表6 Gln與蔗糖、可溶性糖、還原糖含量相關(guān)性分析Table 6 Correlation coefficients of Gln with sucrose, soluble sugar and reducing sugar

如表6所示，‘長營’Gln與可溶性糖呈顯著負(fù)相關(guān)（r＝－0.711），與蔗糖（r＝－0.092）相關(guān)性不明顯，與還原糖呈負(fù)相關(guān)（r＝－0.425），不顯著（P＞0.05）；‘長營’蔗糖與可溶性糖呈極顯著正相關(guān)（r＝0.902），與還原糖呈顯著負(fù)相關(guān)（r＝－0.692）；而可溶性糖與還原糖呈負(fù)相關(guān)（r＝－0.414），不顯著（P＞0.05）?！鍣?號(hào)’Gln與蔗糖呈極顯著正相關(guān)（r＝0.953），與可溶性糖呈顯著正相關(guān)（r＝0.791），與還原糖呈顯著負(fù)相關(guān)（r＝－0.780）；蔗糖與可溶性糖呈正相關(guān)（r＝0.557），與還原糖（r＝0.292）相關(guān)性不明顯，均無顯著性差異（P＞0.05）；可溶性糖與還原糖呈顯著正相關(guān)（r＝0.747）。

3 討論與結(jié)論

通過高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法測定2015年與2016年花后190 d普通橄欖‘長營’和清橄欖‘清欖1號(hào)’的游離氨基酸組分，并結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)分析方法發(fā)現(xiàn)兩者在PCA得分圖中得到明顯區(qū)分，表示其游離氨基酸組分存在差異，在此基礎(chǔ)上，進(jìn)行PLS-DA，分別獲得2015年與2016年潛在的差異氨基酸，最后通過顯著性分析，確定差異氨基酸為Ser、Gln和Glu。游離氨基酸具有呈味性，不同的氨基酸其風(fēng)味不同，其中Ser和Gln為甜味氨基酸，Glu為鮮味氨基酸[12-13,30-31]，表明清橄欖‘清欖1號(hào)’其呈甜味的Ser、Gln和鮮味的Glu對其風(fēng)味貢獻(xiàn)大，與普通橄欖‘長營’存在差異，造成兩者鮮食口感的差異，此結(jié)果與兩者鮮食品質(zhì)的評(píng)價(jià)一致[11]，為今后研究游離氨基酸對普通橄欖和清橄欖鮮食品質(zhì)差異提供一定的依據(jù)。

Gln和Glu為植物合成有機(jī)氮化合物的第1步，其中，GS將銨鹽與Glu結(jié)合生成Gln，GOGAT又可以將Gln提供的酰胺基與2-酮戊二酸反應(yīng)生成Glu，此過程被稱為GS/GOGAT循環(huán)，對植物體內(nèi)的氮代謝具有重要的作用[32]。此外，Gln還能提供氨基與Asp在AS的催化條件下合成Asn[32]。通過將普通橄欖‘長營’和清橄欖‘清欖1號(hào)’成熟過程中Gln代謝相關(guān)酶活性測定后發(fā)現(xiàn)，GS活性變化在‘長營’和‘清欖1號(hào)’之間差異最大，GOGAT和AS活性變化趨勢在‘長營’和‘清欖1號(hào)’之間相似，其酶活性的變化差異對Gln的代謝造成影響，使‘長營’和‘清欖1號(hào)’Gln含量變化趨勢不同，為更直觀觀察代謝酶對Gln的影響，通過相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)僅‘長營’Gln與AS活性呈顯著（P＜0.05）負(fù)相關(guān)（r＝－0.792），其余酶雖與Gln具有一定的相關(guān)性，但均不顯著（P＞0.05）。因此，認(rèn)為AS為與Gln高度相關(guān)的酶，為今后實(shí)驗(yàn)的研究重點(diǎn)。

糖類為橄欖果實(shí)中重要的品質(zhì)成分，其對橄欖的風(fēng)味具有重要貢獻(xiàn)。果實(shí)中的可溶性糖主要分為蔗糖、果糖和葡萄糖，其中果糖和葡萄糖為還原糖。三者中以果糖的甜度最高，蔗糖次之，葡萄糖最低[10,33]。Gln為甜味氨基酸，同樣對果實(shí)的甜味風(fēng)味具有貢獻(xiàn)。通過查詢KEGG上Gln的代謝通路，發(fā)現(xiàn)其最終能生成略帶甜味的氨基葡萄糖，其廣泛存在于細(xì)菌、絲狀真菌、酵母和動(dòng)植物體內(nèi)，但目前多在大腸桿菌[34]和動(dòng)物[35]中進(jìn)行研究鮮見植物中的相關(guān)報(bào)道。為研究Gln對果實(shí)中糖代謝的影響，本實(shí)驗(yàn)測定普通橄欖‘長營’和清橄欖‘清欖1號(hào)’成熟過程中蔗糖、還原糖和可溶性糖含量，發(fā)現(xiàn)蔗糖含量在成熟過程中基本呈上升趨勢，均存在一個(gè)快速積累期，對比成熟時(shí)可溶性糖含量，發(fā)現(xiàn)‘清欖1號(hào)’高于‘長營’，還原糖含量相當(dāng)，造成可溶性糖含量的差異主要由蔗糖引起，此結(jié)果與李澤坤[10]研究結(jié)果一致。進(jìn)而將Gln與蔗糖、還原糖和可溶性糖進(jìn)行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)‘長營’Gln與可溶性糖呈顯著負(fù)相關(guān)（r＝－0.711），與蔗糖（r＝－0.092）相關(guān)性不明顯，與還原糖呈負(fù)相關(guān)（r＝－0.425），無顯著性（P＞0.05）；‘清欖1號(hào)’Gln與蔗糖呈極顯著正相關(guān)（r＝0.953），與可溶性糖呈顯著正相關(guān)（r＝0.791），與還原糖呈顯著負(fù)相關(guān)（r＝－0.780）。表明在‘長營’果實(shí)中Gln含量越高，其可溶性糖含量越低，相反，在‘清欖1號(hào)’果實(shí)中Gln含量越高，可溶性糖、蔗糖含量越高，還原糖含量越低，此結(jié)果與萬繼鋒等[17]研究認(rèn)為橄欖果實(shí)中糖和氨基酸含量存在相關(guān)性一致。綜上，Gln含量與普通橄欖‘長營’和清橄欖‘清欖1號(hào)’中糖類具有高度相關(guān)性，且存在差異，其可通過調(diào)節(jié)Gln代謝實(shí)現(xiàn)橄欖果實(shí)糖含量的調(diào)控，進(jìn)而調(diào)控果實(shí)風(fēng)味。

本研究通過高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)分析方法已獲得普通橄欖‘長營’和清橄欖‘清欖1號(hào)’的差異氨基酸Gln、Ser和Glu，并發(fā)現(xiàn)與Gln代謝高度相關(guān)的酶AS，以及Gln對2 種橄欖果實(shí)糖含量的差異影響，后續(xù)可首先通過對Ser和Glu代謝相關(guān)酶活性進(jìn)行測定，研究其含量與糖含量相關(guān)性，再從分子生物學(xué)角度對Ser、Glu和Gln相關(guān)酶基因進(jìn)行克隆和定量測定，從分子生物學(xué)角度查找造成普通橄欖和清橄欖口感差異的關(guān)鍵基因，將分子生物學(xué)與代謝組學(xué)方法相結(jié)合，以便進(jìn)一步從氨基酸角度實(shí)現(xiàn)對普通橄欖與清橄欖鮮食品質(zhì)的調(diào)控提供更多依據(jù)。