吳恩凱，王秋萍*，龔加順*，張婷婷

（云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650201）

茶褐素是指茶葉中以兒茶素為主的多酚類化合物氧化聚合而成的大分子水溶性色素，是一類易溶于水，但不溶于乙醇、甲醇、乙酸乙酯、正丁醇、三氯甲烷等有機溶劑的高聚合物質(zhì)[1]。茶褐素具有減肥、調(diào)節(jié)血脂、抗動脈粥樣硬化、抗氧化等作用，是普洱茶的主要活性物質(zhì)，在普洱熟茶中茶褐素平均質(zhì)量分數(shù)為12%[1-8]。

由于茶褐素具有多種生物活性，快速高效獲得茶褐素是當前茶葉科學(xué)研究的熱點之一。目前茶褐素的獲取主要有3 種途徑：一是采用水提醇沉法從各類黑茶尤其是普洱茶中提取茶褐素[6,8]，然而黑茶存在生產(chǎn)周期長（30 d以上）、茶褐素含量高低不均、生產(chǎn)過程易污染雜菌、生產(chǎn)過程可控性和自動化差的技術(shù)問題；二是以茶多酚、沒食子酸、新鮮茶葉或茶水提物等為原料，采用化學(xué)[9-10]或酶促法[11-12]合成茶褐素，然而化學(xué)合成法中使用的化學(xué)氧化劑如鐵氰化鉀，不僅影響所得茶褐素的食用安全性，同時也會對環(huán)境造成一定的污染，酶促合成法制備茶褐素，快速便捷，所得茶褐素安全性高，然而此方法使用的酶制劑成本通常較高；三是采用微生物液態(tài)發(fā)酵法快速合成茶褐素[13-14]，此法通常是將普洱茶固態(tài)發(fā)酵中的優(yōu)勢微生物，如黑曲霉（Aspergillus niger）、塔賓曲霉（A. tubingensis）、米曲霉（A. oryzae）和釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）等，用于液態(tài)發(fā)酵綠茶水提物或綠茶水提物和茶葉混合物制備茶色素。此法效率高、成本低，其生產(chǎn)條件及環(huán)境容易控制，易實現(xiàn)自動化。在前期研究中，從普洱茶固態(tài)發(fā)酵過程中分離得到優(yōu)勢菌種塔賓曲霉，可直接在綠茶水提物中生長繁殖，無需額外添加任何碳氮源，并能快速地將綠茶水提物中的多酚類物質(zhì)轉(zhuǎn)化為大分子水溶性茶褐素。塔賓曲霉液態(tài)發(fā)酵綠茶茶湯合成茶褐素速率是固態(tài)發(fā)酵的11 倍[14]。李桃等[15]曾報道，液態(tài)自然發(fā)酵的茶褐素與固態(tài)發(fā)酵茶褐素均含有羧基和酚羥基，且液態(tài)茶褐素中的兩種官能團均比固態(tài)茶褐素多，兩種茶褐素總還原力均具有劑量依賴性，活性相似。塔賓曲霉為普洱茶固態(tài)發(fā)酵中的優(yōu)勢菌種[14,16]，采用塔賓曲霉純種液態(tài)發(fā)酵方法得到的茶褐素化學(xué)組成與從傳統(tǒng)固態(tài)發(fā)酵普洱茶中所提取茶褐素的區(qū)別尚鮮見報道。

本實驗主要比較塔賓曲霉液態(tài)發(fā)酵茶褐素和傳統(tǒng)固態(tài)發(fā)酵茶褐素化學(xué)成分的區(qū)別，旨在探討液態(tài)發(fā)酵茶褐素與傳統(tǒng)固態(tài)發(fā)酵茶褐素組分的差異，從而證明新工藝液態(tài)發(fā)酵法制備茶褐素的可行性，為快速高效獲得茶褐素提供理論依據(jù)，為推動普洱茶產(chǎn)業(yè)多元化、健康可持續(xù)發(fā)展提供動力。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

普洱茶熟茶（GB/T 14456.2—2008《綠茶 第二部分：大葉種綠茶》，生產(chǎn)許可證QS53351401 1057）云南春茗茶業(yè)有限責(zé)任公司；大葉曬青綠茶 云南昆明雄達茶城；塔賓曲霉TISTR3647（GenBank序列號：KJ948640，KJ948650，KJ948652）從普洱茶固態(tài)發(fā)酵中分離所得。

茚三酮（生物純） 上海斯信生物科技有限公司；牛血清白蛋白（生物純） 上海源葉生物科技有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Jan-80離心機 常州市華普達教學(xué)儀器有限公司；A360紫外-可見分光光度計 翱藝儀器（上海）有限公司；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮儀器廠；BILON-12真空冷凍干燥機 鄭州比朗儀器有限公司；JHP-5居里點熱裂解（Curie point pyrolysis，CP-Py）儀 日本分析工業(yè)株式會社；7890A-5975C氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）聯(lián)用儀美國安捷倫科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 固態(tài)發(fā)酵茶褐素樣品的制備[6,8,17]

普洱茶熟茶茶樣→10 倍蒸餾水浸提2 次→過濾→合并濾液→減壓濃縮（65 ℃，0.07 MPa）→乙醇醇沉（濾液-無水乙醇1∶4，V/V），靜置6 h→4 000 r/min離心10 min→沉淀→蒸餾水溶解→真空冷凍干燥→固態(tài)發(fā)酵茶褐素樣品

1.3.2 液態(tài)發(fā)酵茶褐素樣品的制備

大葉曬青綠茶→沸水浸提（茶水比1∶30（g/mL））→過濾→茶湯→巴式殺菌（80 ℃，30 min）→冷卻至室溫→接種塔賓曲霉TISTR3647→37 ℃，攪拌速率250 r/min，通氣量0.5 vvm，發(fā)酵72 h→發(fā)酵液→過濾→55 ℃減壓濃縮→巴式殺菌（80 ℃，30 min）→冷凍干燥→液態(tài)發(fā)酵普洱茶粉→蒸餾水溶解→乙醇醇沉（茶湯-無水乙醇1∶4，V/V），靜置6 h→4 000 r/min離心10 min→沉淀→蒸餾水溶解→真空冷凍干燥→液態(tài)發(fā)酵茶褐素樣品

1.3.3 組分的測定

將0.025 g茶褐素溶于10 mL水中，用pH計測其pH值。蛋白質(zhì)含量測定采用考馬斯亮藍法[18]，標準曲線方程為y＝1.108 3x，R2＝0.995 2（x為牛血清白蛋白質(zhì)量濃度/（mg/mL），y為595 nm波長處吸光度）。氨基酸測定采用茚三酮比色法[19]，標準曲線方程為y＝0.505 7x，R2＝0.999 8（x為谷氨酸質(zhì)量濃度/（mg/mL），y為570 nm波長處吸光度）。

總糖、多糖測定采用苯酚-硫酸法[20-21]，標準曲線方程為y＝14.638x，R2＝0.998 9（x為葡萄糖質(zhì)量濃度/（mg/mL），y為490 nm波長處吸光度）。測定多糖含量時，樣品制樣方法：將0.025 g茶褐素溶于1 mL水中，加入4 mL無水乙醇醇沉6 h后4 000 r/min離心10 min，所得沉淀溶于蒸餾水后即為多糖待測液?？偠喾?、總黃酮采用福林-酚比色法[22]，標準曲線方程為y＝9.061x，R2＝0.992 2（x為沒食子酸質(zhì)量濃度/（mg/mL），y為765 nm波長處吸光度）。測定總黃酮時，樣品制樣方法：于2 mL EP管中加入1 mL所測總多酚的樣品、0.5 mL HCl溶液（濃鹽酸-水1∶4，V/V）、0.5 mL 35%甲醛溶液，暗處放置24 h后4 000 r/min離心5 min，沉淀為黃酮樣品[23]?？們翰杷夭捎孟闾m素比色法[24]，標準曲線方程為y＝7.520 9x，R2＝0.999 7（x為表兒茶素質(zhì)量濃度/（mg/mL），y為500 nm波長處吸光度）。茶色素的測定采用Roberts萃取比色法[25-26]。

1.3.4 CP-Py-GC- MS分析條件

CP-Py條件：熱裂解時間10 s，熱裂解室溫度分別為380、600 ℃；進樣針溫度為380 ℃[21]。

GC條件：J&W DB-5石英毛細柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；分析采用程序升溫：初始溫度60 ℃，保持5 min，以10 ℃/min速率升至270 ℃，保持8 min，以5 ℃/min速率升至380 ℃，保持2 min；載氣為氦氣；流量為5.0 mL/min。

MS條件：離子源溫度220 ℃；傳輸線溫度270 ℃；電子電離源；電子能量70 eV；掃描時間0.2 s；質(zhì)量掃描范圍50～400 u。

稱取試樣0.5 mg，包裹于鐵磁體的熱箔片中，分別在380 ℃和600 ℃條件下裂解，進樣分析。主要裂解產(chǎn)物含量的確定采用面積歸一化法[27]，測定各類裂解物質(zhì)的相對含量。

1.4 數(shù)據(jù)和圖像處理

數(shù)據(jù)以 ±s表示，所有數(shù)據(jù)先進行Grubbs檢驗，以排除過失誤差；經(jīng)G檢驗合格的數(shù)據(jù)，采用SPSS 19.0，用鄧肯氏法進行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同發(fā)酵方法普洱茶茶褐素樣品化學(xué)組分比較

由表1可知，液態(tài)發(fā)酵茶褐素樣品的pH值高于固態(tài)發(fā)酵茶褐素樣品（P＜0.05），均屬于弱酸性物質(zhì)。液態(tài)發(fā)酵茶褐素樣品與固態(tài)發(fā)酵茶褐素樣品的蛋白質(zhì)含量差異不顯著（P＞0.05）；液態(tài)發(fā)酵樣品中的總糖、多糖、茶黃素顯著低于固態(tài)發(fā)酵（P＜0.05）；液態(tài)發(fā)酵茶褐素樣品中的氨基酸、總多酚、總黃酮、總兒茶素和茶褐素則顯著高于固態(tài)發(fā)酵（P＜0.05）；茶紅素未檢出。兒茶素和茶褐素是普洱茶的主要活性物質(zhì)，而液態(tài)發(fā)酵茶褐素樣品的總兒茶素含量和茶褐素含量均為固態(tài)發(fā)酵茶褐素樣品的2.3 倍。值得注意的是，本研究測得液態(tài)發(fā)酵茶樣品的茶褐素相對含量高于100%，這是由于茶褐素的定量分析采用的是傳統(tǒng)Roberts萃取比色法，此法自1963年發(fā)表以來，被廣泛用于測定各類茶中的茶褐素含量，然而在測定茶粉等新式產(chǎn)品中茶褐素含量時，易出現(xiàn)此現(xiàn)象。楊妍等[28]基于茶褐素在270 nm波長下有特征性吸收峰，曾建立一種茶褐素紫外光譜定量測定法，然而由于現(xiàn)無市售的茶褐素標準品，此法難以得到普及。

表1 固態(tài)發(fā)酵茶褐素與液態(tài)發(fā)酵茶褐素樣品組分比較Table 1 Theabrownin compositions of instant and ripened Pu-erh tea

2.2 不同發(fā)酵茶褐素樣品CP-Py-GC-MS分析

圖1 固態(tài)發(fā)酵茶褐素與液態(tài)發(fā)酵茶褐素樣品在不同居里點熱裂解溫度下的GC-MS圖Fig. 1 GC-MS pro files of theabrownins extracted from instant and ripened Pu-erh tea at varying Curie-point pyrolysis temperatures

從圖1A和表2可以看出，固態(tài)發(fā)酵茶褐素樣品在380 ℃熱裂解條件下得到的裂解產(chǎn)物共有123 種，經(jīng)鑒定的29 種，占總產(chǎn)物的70.49%。其中包括酚類6 種（14.38%）、酮類3 種（1.71%）、吡咯2 種（2.23%）、胺類2 種（1.12%）、酯類2 種（0.39%）、酸類2 種（0.07%）、吡啶1 種（2.73%）、嘌呤2 種（0.23%）、醛類1 種（0.18%）、呋喃1 種（0.16%）、嘧啶1 種（0.44%）、咖啡因（42.26%）、可可堿（3.06%）、茶堿（0.06%）和其他物質(zhì)（1.47%）。

從圖1B和表3可以看出，液態(tài)發(fā)酵茶褐素樣品在380 ℃熱裂解條件下得到的裂解產(chǎn)物共有142 種，經(jīng)鑒定的21 種，占總產(chǎn)物的60.27%。其中包括酚類4 種（12.61%）、酮類2 種（1.10%）、吡咯2 種（4.12%）、胺類1 種（0.40%）、酯類1 種（0.39%）、嘌呤2 種（0.24%）、吲哚1 種（2.47%）、呋喃1 種（0.13%）、咖啡因（34.66%）、可可堿（3.57%）、茶堿（0.06%）和其他物質(zhì)（0.52%）。

在380 ℃熱裂解條件下（匹配度≥60%），液態(tài)發(fā)酵茶褐素樣品與固態(tài)發(fā)酵茶褐素樣品得到的裂解產(chǎn)物共有12 種共同成分，包括色素酚類（苯酚、鄰苯二酚、4-甲基兒茶酚、1,3-苯二酚）、吡咯類（N-乙基吡咯、吡咯）、嘌呤類（1,3,7,8-四甲基黃嘌呤、1,7-二甲基黃嘌呤）、2-甲基苯并噁唑、咖啡因、可可堿、茶堿。液態(tài)發(fā)酵茶褐素與固態(tài)發(fā)酵茶褐素樣品裂解產(chǎn)物中，化合物數(shù)量最多的是酚類，其次是吡咯類和嘌呤類。其中兩者裂解產(chǎn)物中含量最高的化合物是咖啡因，其次是酚類。

從圖1C和表4可以看出，固態(tài)發(fā)酵茶褐素樣品在600 ℃熱裂解條件下得到的裂解產(chǎn)物共有153 種，經(jīng)鑒定的26 種，占總產(chǎn)物的45.39%。其中包括酚類3 種（5.07%）、酮類2 種（0.94%）、吡咯2 種（2.13%）、呋喃類2 種（2.81%）、酸類1 種（0.61%）、醇類1 種（0.32%）、吲哚2 種（1.70%）、嘧啶2 種（0.45%）、嘌呤2 種（0.24%）、酯類1 種（0.09%）、咖啡因（27.56%）、可可堿（2.14%）、茶堿（0.04%）和其他物質(zhì)（1.29%）。

從圖1D和表5可以看出，液態(tài)發(fā)酵茶褐素樣品在600 ℃熱裂解條件下得到的裂解產(chǎn)物共有124 種，經(jīng)鑒定的21 種，占總產(chǎn)物的36.85%。其中包括酚類3 種（6.84%）、酮類3 種（1.19%）、吡咯5 種（4.69%）、胺類1 種（0.45%）、酸類1 種（0.46%）、酯類1 種（0.16%）、嘌呤1 種（0.10%）、吲哚1 種（1.87%）、咖啡因（18.78%）、可可堿（1.29%）和其他物質(zhì)（1.02%）。

表2 固態(tài)發(fā)酵茶褐素樣品熱裂解產(chǎn)物（380 ℃，匹配度≥60%）Table 2 Pyrolysis products of theabrownins extracted from instant Pu-erh tea (380 ℃, probability ≥ 60%)

表3 液態(tài)發(fā)酵茶褐素樣品熱裂解產(chǎn)物（380 ℃，匹配度≥60%）Table 3 Pyrolysis products of theabrownins extracted from ripened Pu-erh tea (380 ℃, probability ≥ 60%)

表4 固態(tài)發(fā)酵茶褐素樣品熱裂解產(chǎn)物（600 ℃, 匹配度≥60%）Table 4 Pyrolysis products of theabrownins extracted from instant Pu-erh tea (600 ℃, probability ≥ 60%)

表5 液態(tài)發(fā)酵茶褐素樣品熱裂解產(chǎn)物（600 ℃, 匹配度≥60%）Table 5 Pyrolysis products of theabrownins extracted from ripened Pu-erh tea (600 ℃, probability ≥ 60%)

在600 ℃熱裂解條件下（匹配度≥60%），液態(tài)發(fā)酵茶褐素與固態(tài)發(fā)酵茶褐素的裂解產(chǎn)物共有9種共同成分，包括色素酚類（鄰苯二酚、1,4-苯二酚）、3-甲基-2-環(huán)戊烯-1-酮、3-甲基吡咯、1,3,7,8-四甲基黃嘌呤、己二酸二（2-乙基己）酯、2-甲基苯并噁唑、咖啡因、可可堿。液態(tài)發(fā)酵茶褐素與固態(tài)發(fā)酵茶褐素樣品的裂解產(chǎn)物中，化合物數(shù)量最多的分別是酚類和吡咯，含量最高的化合物是咖啡因，其次是酚類。

通過分析液態(tài)發(fā)酵茶褐素與固態(tài)發(fā)酵茶褐素樣品在不同熱裂解溫度下得到的裂解產(chǎn)物發(fā)現(xiàn)，不管是在380 ℃還是600 ℃熱裂解條件下（匹配度≥60%），兩者裂解產(chǎn)物中相對含量最高的化合物均為咖啡因，其次是酚類。在380 ℃時，液態(tài)發(fā)酵茶褐素與固態(tài)發(fā)酵茶褐素樣品裂解產(chǎn)物中咖啡因相對含量分別為34.66%和42.26%；在600 ℃時，液態(tài)發(fā)酵茶褐素與固態(tài)發(fā)酵茶褐素樣品裂解產(chǎn)物中咖啡因相對含量分別為18.78%和27.56%。表明由于居里點熱裂解溫度的不同，裂解產(chǎn)物中的咖啡因相對含量亦發(fā)生變化，但液態(tài)發(fā)酵茶褐素樣品裂解產(chǎn)物中的咖啡因含量低于固態(tài)發(fā)酵茶褐素樣品。在前期研究中[26]，發(fā)現(xiàn)塔賓曲霉液態(tài)發(fā)酵法制備的速溶普洱茶粉咖啡因相對含量為13.52%，而市售的速溶普洱茶粉（提取自傳統(tǒng)固態(tài)發(fā)酵普洱茶）的咖啡因相對含量為9.65%。本研究中，液態(tài)茶褐素的制備是在速溶普洱茶粉的基礎(chǔ)上采用醇沉法進一步純化，因而其裂解產(chǎn)物中咖啡因相對含量亦發(fā)生變化。

通過分析比較不同發(fā)酵方法對普洱茶茶褐素組成的影響，發(fā)現(xiàn)液態(tài)發(fā)酵茶褐素樣品中的氨基酸、總多酚、總黃酮、總兒茶素和茶褐素相對含量顯著高于固態(tài)發(fā)酵茶褐素樣品（P＜0.05）。其中液態(tài)發(fā)酵茶褐素樣品的總兒茶素和茶褐素相對含量均是固態(tài)發(fā)酵茶褐素的2.3 倍，說明采用塔賓曲霉液態(tài)發(fā)酵法制備茶褐素可提高茶褐素粗提物中總兒茶素和茶褐素的相對含量。在380 ℃熱裂解的條件下（匹配度≥60%），液態(tài)發(fā)酵茶褐素樣品與固態(tài)發(fā)酵茶褐素樣品的裂解產(chǎn)物共有12 種共同成分；在600 ℃熱裂解條件下（匹配度≥60%），液態(tài)發(fā)酵茶褐素樣品與固態(tài)發(fā)酵茶褐素樣品裂解產(chǎn)物共有9 種共同成分。液態(tài)發(fā)酵茶褐素樣品與固態(tài)發(fā)酵茶褐素樣品的組分及含量存在一定的差異，可能是由于液態(tài)發(fā)酵法中，茶褐素的生物合成只有塔賓曲霉參與；而傳統(tǒng)的固態(tài)發(fā)酵是自然發(fā)酵，體系中的微生物組成極其復(fù)雜，除塔賓曲霉外還有其他霉菌、酵母及細菌參與了茶褐素的生物合成[14,29-30]。

3 結(jié) 論

液態(tài)發(fā)酵茶褐素樣品中的茶褐素、總多酚、總黃酮、總兒茶素和氨基酸含量顯著高于固態(tài)發(fā)酵茶褐素樣品（P＜0.05），其中液態(tài)發(fā)酵茶褐素樣品的總兒茶素和茶褐素含量均是固態(tài)發(fā)酵茶褐素樣品的2.3 倍；液態(tài)發(fā)酵茶褐素樣品中的總糖、多糖、茶黃素含量顯著低于固態(tài)發(fā)酵樣品（P＜0.05）；液態(tài)發(fā)酵茶褐素樣品與固態(tài)發(fā)酵茶褐素樣品蛋白質(zhì)含量差異不顯著（P＞0.05）。在380 ℃熱裂解條件下（匹配度≥60%），液態(tài)發(fā)酵樣品與固態(tài)發(fā)酵樣品的裂解產(chǎn)物共有12 種共同成分；在600 ℃熱裂解條件下（匹配度≥60%），液態(tài)發(fā)酵茶褐素樣品與固態(tài)發(fā)酵茶褐素樣品的裂解產(chǎn)物共有9 種共同成分。液態(tài)發(fā)酵茶褐素樣品與固態(tài)發(fā)酵茶褐素樣品在不同溫度下的裂解產(chǎn)物中相對含量最高的均為咖啡因，其次是酚類。本研究證明新工藝塔賓曲霉液態(tài)發(fā)酵法制備茶褐素具有可行性。