田萬帆，劉 驥，趙燕英，唐俊妮*

（西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川 成都 610041）

由金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）分泌的腸毒素以其極端的熱、酸、蛋白酶水解抗性[1-7]和干燥穩(wěn)定性使之在食品加工的酸熱處理[8]和食品保藏的過程中，仍然保持結(jié)構(gòu)完整性，是導(dǎo)致形成食品中毒的重要毒力因子[9-10]。此外，由于具有直接結(jié)合抗原提呈細(xì)胞表面MHC II分子和T細(xì)胞表面T細(xì)胞受體，并能非特異性促進(jìn)多克隆T淋巴細(xì)胞增殖能力，腸毒素也被稱為超抗原[11]。

金黃色葡萄球菌K型腸毒素（S. aureus enterotoxin K，SEK）編碼基因sek最早于2001年通過對S. aureus基因組序列比對分析而發(fā)現(xiàn)[12]。Jarraud等[13]研究表明，sek基因與編碼腸毒素SEG、SEI、SEL和SEM的基因形成一個操縱子位于腸毒素基因簇。流行病學(xué)調(diào)查顯示[14-15]，sek不但是臨床分離的致病性金葡菌菌株中最高頻出現(xiàn)基因之一，更是與耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillinresistant S. aureus，MRSA）的mecA基因具有顯著相關(guān)的腸毒素編碼基因，這暗示含有sek基因的金黃色葡萄球菌在逃避宿主免疫系統(tǒng)攻擊和抗生素抗性獲得上可能發(fā)揮重要功能。因此，對于sek基因表達(dá)調(diào)控或?qū)ζ浔磉_(dá)產(chǎn)物SEK蛋白的靶向性抑制，有望成為臨床上控制MRSA菌株的新策略。SEK蛋白歸屬于V型超抗原[16]，與其他各型超抗原的不同之處在于，V型超抗原具有一個被稱為α3-β8環(huán)的15 個氨基酸殘基形成的插入序列，該序列位于第3個α-螺旋和第8個β-折疊之間。研究表明SEK蛋白的α3-β8環(huán)與T淋巴細(xì)胞表面T細(xì)胞受體的Vβ結(jié)構(gòu)域相互作用時發(fā)揮關(guān)鍵作用[17]，因而該插入序列可能成為抑制SEK超抗原活性的靶點(diǎn)。利用恒河猴[18]和臭鼩[19]進(jìn)行的動物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，SEK蛋白沒有經(jīng)典腸毒素SEA或SEB的顯著催吐活性，但發(fā)生催吐的時間與經(jīng)典腸毒素SEA或SEB無顯著差異，說明SEK也是一種潛在的食品中毒致病因子，對其進(jìn)行滅活研究是提高食品安全的重要手段之一。

盡管關(guān)于SEK催吐活性[18-19]、超抗原活性[12,17]、時序表達(dá)[20-21]、高靈敏度檢測[22]以及單抗中和治療策略[23]等方面被廣泛研究，但迄今為止，關(guān)于SEK蛋白溶液構(gòu)象的報道并不多見。眾所周知，蛋白質(zhì)生物學(xué)功能發(fā)揮依賴于天然蛋白形成正確的折疊態(tài)構(gòu)象，因此，蛋白構(gòu)象及其穩(wěn)定性分析對于蛋白功能研究至關(guān)重要。鑒于SEK腸毒素引起食物中毒的普遍性和高發(fā)性，為進(jìn)一步理解腸毒素SEK結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系，本研究通過優(yōu)化SEK原核表達(dá)體系獲得重組蛋白，進(jìn)而利用熒光發(fā)射譜、圓二色譜以及十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）對SEK溶液構(gòu)象進(jìn)行研究，旨在揭示維持SEK溶液構(gòu)象穩(wěn)定性的分子基礎(chǔ)，為探索破壞SEK結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，建立更加高效合理的食品消毒工藝奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

金黃色葡萄球菌SA005（該菌株攜帶enterotoxin K-like protein（selk）基因，其NCBI登錄號為KU574280.1）保存于本實(shí)驗(yàn)室；感受態(tài)大腸桿菌（Escherichia coli）菌株DH5α、BL21（DE3）、BL21（DE3）pLysS、Rosetta（DE3） 天根生化科技（北京）有限公司；原核表達(dá)質(zhì)粒pET-28a（＋） 美國Novagen公司。

1.1.2 試劑

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain raction，PCR）擴(kuò)增試劑、核酸分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、限制性內(nèi)切酶EcoRI、SalI 寶生物工程（大連）公司；蛋白Marker 天根生化科技（北京）有限公司；SDS-PAGE 5×上樣緩沖液康為世紀(jì)生物科技有限公司；牛血清白蛋白、胰蛋白胨、酵母粉 英國Oxoid公司；卡那霉素、氯霉素、異丙基硫代半乳糖苷（isopropylthiogalactoside，IPTG） 美國Sigma公司；thrombin 北京博奧拓達(dá)科技有限公司；丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺、咪唑、三羥甲基氨基甲烷（trismetyl aminomethane，Tris） 美國Amresco公司；Ni2＋-NTA-Sepharose、DEAE Sepharose Fast Flow 美國GE Healthcare公司；10 kDa超濾管 德國Millipore公司。

含SDS和巰基乙醇SDS-PAGE上樣緩沖液：10 mL含0.6 mL 1 mol/L Tris-HCl（pH 6.8）、5 mL 50%甘油、2 mL 10% SDS、0.5 mL β-巰基乙醇、1 mL 1%溴酚藍(lán)、0.9 mL蒸餾水；含SDS不含巰基乙醇SDS-PAGE上樣緩沖液：10 mL含0.6 mL 1 mol/L Tris-HCl（pH 6.8）、5 mL 50%甘油、2 mL 10% SDS、1 mL 1%溴酚藍(lán)、1.4 mL 蒸餾水；Buffer A：500 mmol/L NaCl、50 mmol/L Tris（pH 8.0）；Buffer B：1 mmol/L pH 7.0磷酸緩沖液；thrombin儲液：1 000 U溶于1 mL磷酸緩沖液，儲液濃度1 U/μL；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

HZQ-F160全溫振蕩培養(yǎng)箱 蘇州培英實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；5804R型冷凍離心機(jī) 德國Eppendorf公司；WD800B型微波爐 格蘭仕集團(tuán)有限公司；TSNENEN031445 PCR儀、DYY-6C型核酸電泳儀、Mini-PROTEAN Tetra Cell電泳儀 美國Bio-Rad公司；JY92-IIN型超聲破碎儀 寧波新芝生物技術(shù)有限公司；Chirascan plus圓二色譜儀 英國Applied Photophysics Limited公司；F-7000熒光光譜儀 日本Hitachi公司。

1.3 方法

1.3.1 ΔNspSEK蛋白原核表達(dá)載體的構(gòu)建

根據(jù)上述模糊判斷的結(jié)果，通過加權(quán)平均法就可以得到最終的精確輸出量，即在特定偏移條件下，支撐油缸應(yīng)采取的液壓缸壓力差。

引物以及ΔNspSEK（ΔN表示N端缺失，sp為信號肽signal peptide的縮寫）蛋白原核表達(dá)載體構(gòu)建參考文獻(xiàn)[24]，金黃色葡萄球菌基因組DNA采用本實(shí)驗(yàn)室建立的微波加熱法提取[25]，利用不含信號肽的sek基因上游引物序列：5’-CGTACGGAATTCCAAGGTGATATAGGA ATTG-3’（下劃線為EcoRI酶切位點(diǎn)），下游引物序列：5’-CGCTAGGTCGACTTATATCGTTTCTTTATAAG-3’（下劃線為SalI酶切位點(diǎn)，加粗體為插入的終止密碼子）進(jìn)行PCR擴(kuò)增[24]。擴(kuò)增所得片段經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測及PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化后，與質(zhì)粒載體pMD18-T進(jìn)行T-A連接，分別將插入ΔNspsek基因的pMD18-T質(zhì)粒與空載質(zhì)粒pET-28a（＋）用EcoRI/SalI雙酶切，將上述雙酶切獲得的基因片段用T4 DNA連接酶連接，使得目的基因定向克隆至表達(dá)載體。將插入ΔNspsek基因的質(zhì)粒命名為pET-28a（＋）-ΔNspsek，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α擴(kuò)增，將提取到的質(zhì)粒pET-28a（＋）-ΔNspsek進(jìn)行EcoRI/SalI雙酶切鑒定。同時將提取到的質(zhì)粒送成都擎科生物技術(shù)有限公司測序。

1.3.2 重組質(zhì)粒在大腸桿菌中表達(dá)條件優(yōu)化

將經(jīng)過測序驗(yàn)證的重組質(zhì)粒pET-28a（＋）-ΔNspsek分別轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌BL21（DE3）、BL21（DE3）pLysS和Rosetta（DE3）篩選高表達(dá)宿主菌株，在相應(yīng)的抗生素抗性平板上（卡那霉素抗性質(zhì)量濃度30 μg/mL；氯霉素抗性質(zhì)量濃度34 μg/mL）隨機(jī)挑取6 個含有重組質(zhì)粒的單克隆菌落，分別過夜培養(yǎng)后，按1∶50的比例擴(kuò)大至含相應(yīng)抗生素抗性的LB培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)3 h，然后加入適當(dāng)濃度誘導(dǎo)劑IPTG后，繼續(xù)恒溫振蕩培養(yǎng)一定時間后，離心收集菌體，SDS-PAGE檢測蛋白表達(dá)。

選擇高表達(dá)菌株，分別進(jìn)行誘導(dǎo)時間梯度（37 ℃，0.5 mmol/L IPTG分別誘導(dǎo)0、1、2、4、6、8、10、12、24 h），誘導(dǎo)IPTG濃度梯度（37 ℃，8 h，IPTG濃度梯度為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mmol/L），誘導(dǎo)溫度梯度（8 h，IPTG濃度0.5 mmol/L，誘導(dǎo)溫度分別為17、27、37 ℃），以及Zn2＋濃度梯度（0、1、5、10、15、20、25 mmol/L）進(jìn)行優(yōu)化，確定最佳誘導(dǎo)條件。

用獲得的最佳條件進(jìn)行小量誘導(dǎo)，12 000 r/min、10 min離心收集菌體，緩沖液（50 mmol/L Tris-HCl，500 mmol/L NaCl，pH 8.0）洗滌菌體2～3 次，重懸菌體進(jìn)行超聲破碎，超聲破碎條件：功率30%，模式1，變幅桿Φ06，超聲破碎3 s，停3 s，共5 min。隨后12 000 r/min，離心10 min，收集上清液，沉淀以相同步驟再處理2 次，合并上清液為蛋白粗提液，蛋白粗提液與沉淀分別進(jìn)行SDS-PAGE檢測，目的蛋白大部分存在于上清液，表明蛋白為可溶性表達(dá)；目的蛋白大部分存在于沉淀則為包涵體表達(dá)。

1.3.3 His-ΔNspSEK蛋白分離與純化

根據(jù)1.3.2節(jié)確定的最優(yōu)表達(dá)菌株為出發(fā)菌種接種于5 mL LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃過夜振蕩培養(yǎng)。次日將種子液轉(zhuǎn)接到500 mL LB中按照確定的最佳表達(dá)條件擴(kuò)大培養(yǎng)，監(jiān)測菌液吸光度A600nm至0.6～0.7時，進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。離心收集菌體，菌體經(jīng)PBS洗滌后重懸浮于20 mL Buffer A緩沖液中，冰浴超聲破碎，超聲破碎條件：功率285 W，振幅30%，模式1，變幅桿Φ06，超聲破碎3 s，停3 s，共15 min，離心收集上清液。將得到的His-ΔNspSEK蛋白粗提液上樣于事先用含Buffer A緩沖液平衡好鎳離子親合層析柱。先以Buffer A緩沖液和含50 mmol/L咪唑的Buffer A緩沖液除去大部分雜蛋白，再以含100 mmol/L咪唑的Buffer A洗脫目的蛋白，SDS-PAGE分析純度。隨后，采用凝血酶去除SEK His標(biāo)簽，取純化的蛋白于截留分子質(zhì)量10 kDa容量15 mL的Millipore超濾管脫鹽至PBS（pH 7.4）中，作為凝血酶的酶切底物，配制1 IU/μL的thrombin儲液。0.5、1.0、1.5 IU thrombin酶切300 μg SEK蛋白22 ℃、4 h。SDS-PAGE檢測酶切是否完全。最后，將酶切后的蛋白更換為Buffer B緩沖液，采用陰離子交換去除凝血酶，獲得純化的ΔNspSEK蛋白。

1.3.4 ΔNspSEK重組蛋白聚合態(tài)和熱穩(wěn)定分析

將純化的ΔNspSEK蛋白分別加入2 種不同的SDSPAGE上樣緩沖液（一種是含SDS和不含巰基乙醇；另一種是同時含SDS和巰基乙醇）處理后進(jìn)行SDS-PAGE分析，純化的ΔNspSEK蛋白置于100 ℃水浴0、3、6、10、20、40、60 min，牛血清白蛋白作對照，SDS-PAGE分析蛋白的受熱降解程度。

將純化的ΔNspSEK重組蛋白用Buffer B調(diào)節(jié)質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL，參考文獻(xiàn)[26]條件，在Chriascan plus型圓二色譜儀上進(jìn)行蛋白溶液的測定，儀器參數(shù)設(shè)定為：掃描范圍190～260 nm，激發(fā)光和發(fā)射光狹縫1 nm，中速掃描，光譜校正開啟，25 ℃氮?dú)獯祾呦逻M(jìn)行。每個樣品掃描3 次取平均值。參考文獻(xiàn)[26]條件將純化的ΔNspSEK蛋白調(diào)節(jié)質(zhì)量濃度為45 μg/mL，干式恒溫器25 ℃溫育10 min，后用F-7000熒光光譜儀進(jìn)行測定，儀器參數(shù)設(shè)定：激發(fā)波長278 nm和295 nm，發(fā)射波譜掃描范圍為300～400 nm，掃描速率為1 200 nm/min，掃描激發(fā)光和發(fā)射光狹縫為5 nm，PMT電壓700 V，消除光柵，每個樣品掃描3 次取平均值。

1.4 數(shù)據(jù)分析和圖像處理

使用圓二色譜數(shù)據(jù)在線分析軟件DichroWeb對掃描的圓二色譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，選擇CDSSTR擬合方案，采用圓二色譜參考數(shù)據(jù)集SMP180，190～240 nm波長范圍內(nèi)對掃描數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，計(jì)算溶液中ΔNspSEK蛋白二級結(jié)構(gòu)含量。將得到熒光光譜數(shù)據(jù)用FL Solutions轉(zhuǎn)化成Excel表格，然后用Origin7.5作出278 nm和295 nm波長處熒光光譜圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組表達(dá)質(zhì)粒pET-28a（＋）-ΔNspsek的基因測序鑒定結(jié)果

將重組表達(dá)質(zhì)粒的插入基因ΔNspsek進(jìn)行測序，得到長度為729 bp的片段，利用NCBI BLAST多序列比對發(fā)現(xiàn)克隆到的ΔNspsek基因序列與菌株SA005的selk基因序列（登錄號：KU574280.1）的第70～729位堿基序列100%吻合，第1～69位為信號肽序列。質(zhì)粒雙酶切鑒定結(jié)果見圖1，表明SEK融合蛋白（His-ΔNspSEK）表達(dá)載體構(gòu)建成功。

圖1 重組質(zhì)粒pET-28a（）-ΔNspsek的雙酶切鑒定Fig. 1 Veri fication of pET-28a(+)-ΔNspsek positive clone by doublerestriction enzyme digestion

2.2 pET-28a（＋）-ΔNspsek在大腸桿菌中表達(dá)條件優(yōu)化及可溶性表達(dá)驗(yàn)證結(jié)果

將重組原核表達(dá)質(zhì)粒pET-28a（＋）-ΔNspsek分別轉(zhuǎn)化至BL21（DE3）、BL21（DE3）pLysS、Rosetta（DE3）3 種不同的感受態(tài)細(xì)胞，對每個轉(zhuǎn)化子在平板上隨機(jī)挑選6 個單克隆，經(jīng)過相同的條件進(jìn)行小量誘導(dǎo)表達(dá)，結(jié)果如圖2所示。目標(biāo)蛋白在3 種不同的宿主菌中均有明顯表達(dá)，且Rosetta（DE3）表達(dá)宿主菌中蛋白產(chǎn)量普遍較高（圖2C），該菌株整合了大腸桿菌缺乏的6 種稀有密碼子對應(yīng)的tRNA，因此，選取表達(dá)量最高的Rosetta（DE3）菌株中的1號單克隆作為后續(xù)表達(dá)條件優(yōu)化實(shí)驗(yàn)的菌株，進(jìn)一步探討融合蛋白的最佳表達(dá)條件。

由圖2D可知，當(dāng)IPTG濃度梯度升高至0.6 mmol/L時，目標(biāo)蛋白表達(dá)量最大，隨著IPTG濃度升高，雜蛋白也在增加，為減輕純化負(fù)擔(dān)，本研究選擇0.5 mmol/L為最佳IPTG濃度。由圖2E可知，隨著誘導(dǎo)時間的延長，目標(biāo)蛋白表達(dá)量也在逐漸增加，但8 h后增加不明顯，因此，選擇最佳誘導(dǎo)時間為8 h。由圖2F可以看出，低溫誘導(dǎo)目標(biāo)蛋白表達(dá)量較大，因此，設(shè)置最佳誘導(dǎo)溫度為27 ℃。由圖2G可知，低濃度Zn2＋并未顯著改善目標(biāo)蛋白表達(dá)量，而當(dāng)Zn2＋濃度高于10 mmol/L時，目的蛋白幾乎不表達(dá)，因此，Zn2＋濃度選擇為0 mmol/L。綜上所述，選擇IPTG濃度0.5 mmol/L、誘導(dǎo)時間8 h、誘導(dǎo)溫度27 ℃、不添加Zn2＋為最佳誘導(dǎo)條件。

利用上述最優(yōu)表達(dá)條件對Rosetta（DE3）宿主菌1號單克隆進(jìn)行小量誘導(dǎo)表達(dá)驗(yàn)證，由圖2H可知，3 次平行實(shí)驗(yàn)均獲得ΔNspSEK蛋白高產(chǎn)量表達(dá)。隨后，將1 mL菌液離心收集菌體，經(jīng)Buffer A緩沖液重懸后超聲破碎，裂解液離心所得上清液見圖2I的泳道1，離心的沉淀見圖2I的泳道2，上清液中有清晰的蛋白表達(dá)條帶，結(jié)果表明融合蛋白為可溶性表達(dá)。

圖2 ΔNspsek基因在不同原核表達(dá)宿主菌中誘導(dǎo)表達(dá)及條件優(yōu)化Fig. 2 Optimization of expression conditions for His-ΔNspSEK protein

2.3 最優(yōu)條件下的His-ΔNspSEK表達(dá)純化及凝血酶切除6×His標(biāo)簽結(jié)果

按上述最優(yōu)條件擴(kuò)大培養(yǎng)所得融合蛋白超聲破碎粗提液進(jìn)行鎳親合層析純化，經(jīng)過含10、50 mmol/L咪唑的緩沖液梯度洗脫雜蛋白后，含His標(biāo)簽的ΔNspSEK融合蛋白被100 mmol/L咪唑緩沖液洗脫效果好，見圖3A的第5泳道。進(jìn)一步采用凝血酶切除6×His標(biāo)簽肽，圖3B的泳道3效果較好，對于300 μg融合蛋白底物，凝血酶量為1.0 IU時，酶切4 h即可完全除去標(biāo)簽肽。進(jìn)一步將凝血酶切除標(biāo)簽肽后的反應(yīng)體系超濾去除標(biāo)簽肽并更換為Buffer B，收集過DEAE離子交換樹脂的穿透液進(jìn)行SDS-PAGE，結(jié)果如圖3C中的泳道2所示，結(jié)果表明除去His標(biāo)簽肽的ΔNspSEK蛋白純度高，可以滿足后續(xù)光譜學(xué)測定。

圖3 His-ΔNspSEK蛋白的純化與凝血酶切除6×His標(biāo)簽肽Fig. 3 SDS-PAGE analysis of purified His-ΔNspSEK fusion protein after thrombin digestion

2.4 純化的ΔNspSEK聚合狀態(tài)分析和熱穩(wěn)定分析

將凝血酶切除標(biāo)簽后經(jīng)DEAE純化的ΔNspSEK蛋白分成2 份，分別用含有SDS與β-巰基乙醇的樣品處理液（泳道1）和只含有SDS不含β-巰基乙醇的樣品處理液（泳道2）處理后，進(jìn)行SDS-PAGE，結(jié)果如圖4A所示，由于SDS可以破壞蛋白質(zhì)亞基間的非共價相互作用，β-巰基乙醇可破壞鏈內(nèi)或鏈間二硫鍵，因此，泳道1顯示的是ΔNspSEK蛋白單體形式。泳道2中樣品由于缺乏β-巰基乙醇，不能破壞鏈間二硫鍵，部分ΔNspSEK蛋白以二聚體形式呈現(xiàn)。結(jié)果表明，在非還原態(tài)時，截除信號肽的SEK可能通過鏈間二硫鍵形成二聚體的形式存在。進(jìn)一步將去除His標(biāo)簽肽的ΔNspSEK重組蛋白100 ℃熱處理，間隔時間為0、3、6、10、20、40、60 min進(jìn)行采樣，分別對樣品進(jìn)行SDS-PAGE分析，如圖4B所示，100 ℃加熱到40 min時，重組蛋白ΔNspSEK依舊無明顯降解，但到加熱60 min時可以看出蛋白出現(xiàn)部分降解，說明ΔNspSEK蛋白具有較高的熱穩(wěn)定性。

圖4 ΔNspSEK蛋白聚合狀態(tài)分析（A）和熱穩(wěn)定性分析（B）Fig. 4 SDS-PAGE analysis of aggregation state (A) and heat stability (B) of ΔNspSEK

2.5 純化ΔNspSEK蛋白的圓二色譜和熒光發(fā)射譜分析

純化的重組蛋白ΔNspSEK遠(yuǎn)紫外區(qū)的圓二色譜見圖5A，表現(xiàn)為192 nm波長處的強(qiáng)正峰和208 nm波長處的強(qiáng)負(fù)峰信號。采用DichroWeb在線分析軟件，計(jì)算溶液中ΔNspSEK重組蛋白二級結(jié)構(gòu)含量為α-螺旋29.1%、β-折疊23.6%、β-轉(zhuǎn)角28%和無規(guī)卷曲19.4%，Difference（exp-recon）表明實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與擬合數(shù)據(jù)之間的誤差在可接受范圍之內(nèi)。由圖5B可知，蛋白溶液分別在278 nm和295 nm波長激發(fā)時，具有相同的344 nm波長色氨酸熒光發(fā)射峰。與處于親水環(huán)境的游離色氨酸354 nm波長熒光發(fā)射峰相比藍(lán)移了10 nm，說明雖然ΔNspSEK蛋白中色氨酸處于蛋白質(zhì)分子表面，但仍未完全暴露于極性水環(huán)境中。

圖5 ΔNspSEK重組蛋白的遠(yuǎn)紫外圓二色譜（A）與室溫?zé)晒獍l(fā)射譜（B）Fig. 5 Far-UV circular dichroism spectra (A) and room temperature fl uorescence emission spectra (B) of ΔNspSEK fusion protein

3 討 論

本研究對SEK蛋白表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化，并建立表達(dá)ΔNspSEK蛋白的方法。在純化蛋白前通過查找文獻(xiàn)得知ΔNspSEK理論等電點(diǎn)為7.7。而采用凝血酶酶切后雜蛋白的等電點(diǎn)為5.0～5.5[26-27]，據(jù)此，本研究嘗試使用陰離子交換方法進(jìn)行蛋白質(zhì)酶切純化。通過多次實(shí)驗(yàn)證明當(dāng)緩沖液pH值為7.0時，穿透后，凝血酶結(jié)合到了DEAE柱上，ΔNspSEK蛋白大部分保留在穿透液中，這樣的嘗試大大降低了酶切后的純化難度，此方法可供相關(guān)研究者借鑒。

眾所周知，加熱對于食品加工與安全具有重要作用，是食品殺菌的主要手段。本研究對金黃色葡萄球菌腸毒素重組蛋白ΔNspSEK的熱穩(wěn)定進(jìn)行研究，通過圓二色譜分析揭示ΔNspSEK蛋白溶液構(gòu)象β-折疊為23.6%。劉驥等[26]研究認(rèn)為新型腸毒素M的蛋白溶液構(gòu)象β-折疊高達(dá)42%，王小紅[28]研究表明傳統(tǒng)B型腸毒素β-折疊達(dá)40.4%，經(jīng)過121 ℃處理30 min后，仍具有39.9%的β-折疊含量。β-折疊對腸毒素?zé)岱€(wěn)定性維持具有關(guān)鍵作用，SEK的β-折疊含量比SEM和SEB的都低，因此，可以解釋SEK的熱穩(wěn)定性不如SEM和SEB好，當(dāng)100 ℃加熱到60 min時，蛋白出現(xiàn)部分降解。如果在食品加工中延長加熱時間可以破壞部分SEK腸毒素，但是還會有部分SEK穩(wěn)定存在，需進(jìn)一步探索破壞SEK的方法。

對融合蛋白ΔNspSEK的熒光發(fā)射譜進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)278 nm波長激發(fā)時呈現(xiàn)的是色氨酸特征性的344 nm波長熒光發(fā)射主峰。該峰位與295 nm波長單獨(dú)激發(fā)色氨酸殘基時，產(chǎn)生的熒光發(fā)射峰一致，根據(jù)蛋白質(zhì)分子內(nèi)能量轉(zhuǎn)移有效性和色氨酸熒光峰位相對于極性水環(huán)境（354 nm波長發(fā)射峰）的顯著藍(lán)移，可以推測純化的ΔNspSEK處于構(gòu)象緊密的天然折疊狀態(tài)。

本研究成功構(gòu)建SEK的融合蛋白ΔNspSEK可溶性原核表達(dá)系統(tǒng)，純化的融合蛋白ΔNspSEK在溶液中處于構(gòu)象緊密的天然折疊狀態(tài)，ΔNspSEK蛋白熱穩(wěn)定性好，為進(jìn)一步研究SEK的結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系提供參考依據(jù)。