徐友強(qiáng)，孫寶國，蔣玥鳳，鹿發(fā)展，張成楠，鄒 偉，王文華，楊 然，滕 超，范光森，李秀婷,*

（1.北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心，北京工商大學(xué)，北京 100048；2.北京市食品添加劑工程技術(shù)研究中心，北京工商大學(xué)，北京 100048；3.四川理工學(xué)院 釀酒生物技術(shù)及應(yīng)用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 自貢 643000）

白酒是中國特色發(fā)酵酒類飲品，也是世界知名蒸餾酒之一[1]。依據(jù)香氣特征，中國白酒分為12 種香型，其中濃香型白酒目前銷量占白酒市場份額的70%以上，屬于白酒行業(yè)的支柱型產(chǎn)品[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)，濃香型白酒的主體風(fēng)味物質(zhì)為己酸乙酯。國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，優(yōu)級高度酒的總酯質(zhì)量濃度不低于2.0 g/L，其中己酸乙酯質(zhì)量濃度不低于1.2 g/L，優(yōu)級低度酒的總酯質(zhì)量濃度不低于1.5 g/L，其中己酸乙酯質(zhì)量濃度不低于0.7 g/L[3]。生產(chǎn)實(shí)踐中，以己酸乙酯含量的高低作為濃香型白酒品質(zhì)的重要衡量參數(shù)已成為業(yè)內(nèi)共識[4-6]。這充分說明己酸乙酯對濃香型白酒品質(zhì)的重要作用。己酸乙酯合成的前體物質(zhì)為己酸和乙醇。其中，白酒釀造過程己酸的合成代謝對于己酸乙酯的生成具有決定性的作用[7]。研究發(fā)現(xiàn)，濃香型白酒釀造過程Clostridium屬的微生物具有較高豐度，且對于酒醅己酸的產(chǎn)生具有重要貢獻(xiàn)[7]。其中，Clostridium kluyveri是白酒來源Clostridium屬微生物的典型代表[8]。20世紀(jì)60年代，C. kluyveri自白酒窖泥被分離，并經(jīng)研究證實(shí)對于己酸代謝合成和己酸乙酯生成具有顯著促進(jìn)作用，繼而通過微生物的外源添加，保障白酒釀造過程己酸乙酯的生成，使酒體呈現(xiàn)濃香型白酒的感官和風(fēng)味，進(jìn)而推動濃香型白酒的生產(chǎn)突破傳統(tǒng)白酒釀造的地域依賴性，目前全國多個(gè)地區(qū)均能夠生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)濃香型白酒[1]。這也充分說明微生物對于白酒釀造的重要性。

C. kluyveri是己酸的重要代謝生產(chǎn)菌種之一，所代謝合成的己酸具有重要用途。作為六碳的小分子脂肪酸，己酸可用于香料、醫(yī)藥前體、食品添加劑、潤滑油、煙草調(diào)香、橡膠和印染領(lǐng)域，同時(shí)可作為前體合成己酸酯如己酸乙酯，是食品領(lǐng)域的重要風(fēng)味酯類，用途廣泛[9-12]。因此，有研究對微生物的己酸代謝進(jìn)行探索，如通過基因組測序和注釋，解析己酸代謝途徑等[8,10]。另有文獻(xiàn)報(bào)道，Clostridium屬的其他菌株、Megasphaera elsdenii、基因工程改造的Escherichia coli和Kluyveromyces marxianus等也具有己酸的代謝合成能力[9-12]。但目前研究顯示，C. kluyveri己酸代謝合成的產(chǎn)量和生產(chǎn)速率均居于前列[10]。由于己酸廣泛的用途和C.kluyveri突出的己酸代謝合成性能，C. kluyveri的己酸代謝已有文獻(xiàn)報(bào)道。Seedorf等[8]解析C. kluyveri模式菌株DSM 555的基因組信息，對乙醇代謝合成丁酸的途徑進(jìn)行詳細(xì)分析。之后，Tao Yong等[10]對另一株己酸高產(chǎn)菌株Clostridium sp. CPB6的基因組序列進(jìn)行解析和注釋，并分析該菌株代謝合成己酸的可能途徑。

目前研究認(rèn)為，C. kluyveri合成己酸的經(jīng)典代謝過程是通過乙醇作為底物和電子供體的反向β-氧化循環(huán)鏈延長機(jī)制實(shí)現(xiàn)的。其代謝途徑見圖1。乙醇首先經(jīng)乙醇脫氫酶（Adh）轉(zhuǎn)化為乙醛，經(jīng)乙醛脫氫酶（Ald）轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A，這兩步轉(zhuǎn)化均偶合NAD＋轉(zhuǎn)化為NADH。乙酰輔酶A經(jīng)磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶（Pta）生成乙酰磷酸，經(jīng)乙酸激酶（Ack）轉(zhuǎn)化生成乙酸，該步催化伴隨ADP生成ATP。乙酰輔酶A還可經(jīng)乙酰輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移酶（又名硫解酶）（ThlA）轉(zhuǎn)化為乙酰乙酰輔酶A，經(jīng)3-羥基丁酰輔酶A脫氫酶（Hbd）轉(zhuǎn)化為3-羥基丁酰輔酶A并消耗NADH。3-羥基丁酰輔酶A經(jīng)3-羥基丁酰輔酶A脫水酶（Crt）轉(zhuǎn)化為丁烯酰輔酶A。丁烯酰輔酶A在丁酰輔酶A脫氫酶（Bcd）的催化下，轉(zhuǎn)化為丁酰輔酶A，該步催化偶合FAD依賴型的電子轉(zhuǎn)移黃素蛋白（Etf）和鐵氧化還原蛋白氧化還原酶（Rnf），并伴隨電子的轉(zhuǎn)移。丁酰輔酶A和乙酸經(jīng)丁酰輔酶A:乙酸輔酶A轉(zhuǎn)移酶（Cat3）轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A和丁酸，實(shí)現(xiàn)以乙酸合成丁酸的過程。再經(jīng)類似的催化過程，實(shí)現(xiàn)由丁酰輔酶A到己酰輔酶A，經(jīng)酰基輔酶A硫酯酶（Tes1）催化生成己酸。代謝途徑分析表明，由乙酰輔酶A到己酸代謝的主要催化酶包括乙酰輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移酶/硫解酶（ThlA）、3-羥基丁酰輔酶A脫氫酶（Hbd）、3-羥基丁酰輔酶A脫水酶（Crt）和丁酰輔酶A脫氫酶（Bcd）。

基于代謝途徑的解析，利用代謝工程技術(shù)進(jìn)行微生物的遺傳改造，改良微生物的代謝特性，是實(shí)現(xiàn)目標(biāo)化合物微生物高產(chǎn)的有效途徑。然而，由于C. kluyveri遺傳操作體系的匱乏，目前通過基因工程手段利用微生物進(jìn)行己酸的生產(chǎn)優(yōu)化主要集中于在大腸桿菌或者酵母菌株中異源重構(gòu)己酸的代謝途徑來實(shí)現(xiàn)[11-12]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，乙酰輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移酶是己酸代謝途徑的關(guān)鍵酶，其表達(dá)強(qiáng)度對于己酸代謝的產(chǎn)量和速率具有決定作用[12]。然而到目前為止，已知的C. kluyveri基因組測序和注釋結(jié)果關(guān)于己酸代謝核心催化酶以及關(guān)鍵酶的注釋及功能分析仍不深入，甚至存在欠缺和謬誤，不利于后續(xù)對己酸代謝的深入研究?；诖耍狙芯客ㄟ^比較基因組學(xué)和生物信息學(xué)相結(jié)合的方法，對3 株遺傳信息全面解析的C. kluyveri進(jìn)行己酸代謝途徑核心催化酶的重新注釋和關(guān)鍵酶硫解酶的結(jié)構(gòu)及催化機(jī)制分析，為后續(xù)的深入研究提供參考。

圖1 C. kluyveri的己酸代謝途徑Fig. 1 Hexanoic acid metabolic pathway in C. kluyveri

1 材料與方法

1.1 材料

檢索NCBI的基因組數(shù)據(jù)庫，共獲得已知全基因組信息的3 株C. kluyveri，編號分別為DSM 555[8]、NBRC 12016[13]和JZZ[12]，以其為研究對象，將全基因組序列信息下載到本地進(jìn)行分析。

1.2 方法

1.2.1 比較基因組學(xué)分析

利用軟件MAUVE 2.3.1進(jìn)行3 株C. kluyveri菌株全基因組序列分析[14]。利用文本編輯軟件fasta編輯符合比對要求的基因組序列文件，通過MAUVE細(xì)菌基因組比對默認(rèn)參數(shù)進(jìn)行比較基因組學(xué)分析。

1.2.2 關(guān)鍵酶序列和基本性質(zhì)分析

序列比對選用DNAMAN 7.0軟件完成、酶的基本性質(zhì)分析采用ExPASy-ProtParam tool完成（http://web.expasy.org/protparam/）[15]。

蛋白質(zhì)系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建：選取代表性的不同乙酰輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移酶序列，按照系統(tǒng)發(fā)育分析軟件MEGA 5.0的要求制作序列比對文件，通過Neighbour-Joining算法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，Bootstrap values：1 000[16]。

1.2.3 關(guān)鍵酶親水/疏水性分析、信號肽和跨膜區(qū)預(yù)測

蛋白親水/疏水性分析通過軟件ExPASy-ProtScale完成（http://web.expasy.org/protscale/）[15]，信號肽的預(yù)測通過SignalP 4.1網(wǎng)站進(jìn)行（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）[17]，利用在線軟件TMHMM 2.0進(jìn)行蛋白跨膜區(qū)的預(yù)測（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM）。

1.2.4 關(guān)鍵酶二級、三維結(jié)構(gòu)預(yù)測和催化機(jī)制分析

蛋白二級結(jié)構(gòu)利用軟件SOPMA（Secondary Structure Prediction Method）（https://npsa-prabi.ibcp.fr/ cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）進(jìn)行分析[18]。蛋白三維結(jié)構(gòu)預(yù)測通過SWISS-MODEL（http://swissmodel.expasy.org/）完成[19]。分子對接分析酶與底物作用關(guān)系通過DISCOVERY STUDIO 2.5軟件完成[20]。

2 結(jié)果與分析

2.1 C. kluyveri JZZ、NBRC 12016和DSM 555基因組的比較基因組學(xué)分析

圖2 3 株C. kluyveri全基因組序列比對（A）和己酸代謝途徑基因分布分析（B）Fig. 2 Whole genome sequence alignment (A) of three C. kluyveri and gene distribution of hexanoic acid metabolic pathway

比較基因組分析發(fā)現(xiàn)，模式菌株DSM 555與NBRC 12016的基因組長度接近，但均明顯短于JZZ，說明DSM 555與NBRC 12016在進(jìn)化關(guān)系上更加接近，而JZZ可能存在區(qū)別于DSM 555和NBRC 12016的獨(dú)有遺傳信息（圖2A）。文獻(xiàn)研究表明，菌株JZZ分離自白酒釀造過程，該菌株基因組獨(dú)有的遺傳信息可能與基因水平轉(zhuǎn)移有關(guān)[21]，來自白酒釀造過程中其他微生物所攜帶的遺傳信息，賦予該菌株區(qū)別于DSM 555和NBRC 12016的生物學(xué)功能，使其在白酒釀造的獨(dú)特生境下可以更好地生存和繁殖。另外，比較基因組學(xué)分析表明，3 株菌株均不存在明顯的基因組DNA片段的轉(zhuǎn)換或者顛換?；诒容^基因組學(xué)分析和基因組基因注釋結(jié)果，研究繪制不同拷貝的己酸代謝核心催化酶編碼基因在基因組上的相對位置圖譜（圖2B）。3 株菌株均攜帶己酸代謝的核心催化酶編碼基因，表明具有代謝合成己酸的能力，且每一株菌對應(yīng)核心催化酶編碼基因的拷貝數(shù)一致，但同一株菌不同酶編碼基因的拷貝數(shù)不同（圖2B）。3 株菌株攜帶己酸代謝的核心催化酶編碼基因均為多拷貝，說明該代謝途徑屬于C. kluyveri的關(guān)鍵代謝途徑，對于維持菌株的生存和基本代謝至關(guān)重要。

表1 3 株C. kluyveri己酸代謝途徑的核心催化酶重新注釋Table 1 Re-annotation of the core enzymes of the hexanoic acid metabolic pathway in three C. kluyveri strains

表2 關(guān)鍵硫解酶基本性質(zhì)分析Table 2 Characteristics of the key thiolases

對核心代謝酶的注釋信息進(jìn)行比較分析，由表1可知，NBRC 12016由于基因組測序較早，非冗余蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫的信息相對不完善，導(dǎo)致己酸代謝途徑的注釋信息匱乏。與之相比，DSM 555和JZZ的注釋信息較為完善，但JZZ存在?；o酶A脫氫酶注釋的錯誤，編碼?；o酶A脫氫酶的基因被錯誤預(yù)測為編號BS101_04340和BS101_04345的兩個(gè)基因，對應(yīng)編碼蛋白的注釋信息亦需更正。另外，基因bcd2編碼蛋白的注釋信息為酰基輔酶A脫氫酶、短鏈特異的，表明源于DSM 555的基因bcd1和bcd2編碼蛋白的底物特異性可能存在差別，有待后續(xù)研究證實(shí)。由于己酸代謝合成是脂肪酸代謝鏈延長的過程，C. kluyveri攜帶的己酸代謝關(guān)鍵酶硫解酶的序列多態(tài)性可能與催化過程鏈延長循環(huán)的底物特異性有關(guān)，但目前鮮見相關(guān)的研究報(bào)道。

2.2 己酸代謝途徑關(guān)鍵酶基本性質(zhì)和序列比對分析

對3 株C.kluyveri菌株己酸代謝途徑的關(guān)鍵酶乙酰輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移酶（硫解酶）進(jìn)行基本酶學(xué)性質(zhì)分析，包括氨基酸殘基數(shù)量、分子質(zhì)量、等電點(diǎn)、帶負(fù)電荷氨基酸、帶正電荷氨基酸、分子式、原子總數(shù)、消光系數(shù)和不穩(wěn)定指數(shù)（表2）。不同菌株來源對應(yīng)的硫解酶以及同一菌株來源不同拷貝的硫解酶的基本性質(zhì)包括分子質(zhì)量、等電點(diǎn)、分子式、原子總數(shù)、消光系數(shù)和不穩(wěn)定指數(shù)均存在區(qū)別。其中，不同硫解酶的不穩(wěn)定指數(shù)均小于40，說明蛋白本身在結(jié)構(gòu)上是穩(wěn)定的[22]。蛋白的穩(wěn)定性與序列的二肽組成緊密相關(guān)[22]，不同硫解酶的序列存在差別（圖3），導(dǎo)致氨基酸序列中的二肽組成具有差異，是穩(wěn)定性差別的內(nèi)在原因。另外，ThlA1、ThlA3、BS101_21010、BS101_21025、CKR_3261和CKR_3263雖然帶正負(fù)電荷氨基酸總數(shù)分別相等，但是經(jīng)統(tǒng)計(jì)，組成正負(fù)電荷的氨基酸不同（圖3），不同氨基酸的解離系數(shù)存在差別，導(dǎo)致酶的等電點(diǎn)存在微小差別。上述分析對于后續(xù)該類關(guān)鍵酶的分離純化和催化特性研究具有一定的指導(dǎo)意義。

在硫解酶基本理化性質(zhì)解析基礎(chǔ)上，研究對酶的氨基酸序列進(jìn)行比對和系統(tǒng)發(fā)育分析。結(jié)果表明，C. kluyveri不同種均攜帶3 個(gè)拷貝的硫解酶，同一菌株來源的3 個(gè)硫解酶的序列和不同菌株來源對應(yīng)硫解酶的序列均存在差別（圖3），且不同來源硫解酶在系統(tǒng)發(fā)育樹上明顯聚于不同的分支（圖4）。同時(shí)，C. kluyveri來源硫解酶與Clostridium屬其余種來源的硫解酶具有序列的差異。硫解酶催化短鏈的?；o酶A合成長鏈的酰基輔酶A，是脂肪酸合成代謝的關(guān)鍵酶之一[23]。研究發(fā)現(xiàn)，微生物中脂肪酸合成代謝一般存在3 種類型的硫解酶，I型脂肪酸合成酶（fatty-acid synthesis type I，F(xiàn)AS I），II型脂肪酸合成酶（FAS II）和III型脂肪酸合成酶（FAS III）。其中，F(xiàn)AS I和FAS II與脂肪酸的鏈延長相關(guān)，而FAS III與脂肪酸合成的反應(yīng)起始相關(guān)[23-24]。由于C. kluyveri來源硫解酶的研究較少，目前尚鮮見關(guān)于不同拷貝硫解酶底物特異性的文獻(xiàn)報(bào)道。圖4表明，以C. kluyveri來源硫解酶為對象進(jìn)行深入研究，對于解析C. kluyveri己酸代謝途徑具有重要意義。

圖3 關(guān)鍵硫解酶序列比對Fig. 3 Sequence alignment of the key thiolases

圖4 關(guān)鍵硫解酶系統(tǒng)發(fā)育分析Fig. 4 Phylogenetic analysis of the key thiolases

2.3 己酸代謝途徑關(guān)鍵酶ThlA疏水性分析、信號肽和跨膜區(qū)預(yù)測

圖5 C. kluyveri DSM 555關(guān)鍵酶ThlA疏水性分析（A）、信號肽（B）和跨膜區(qū)（C）預(yù)測Fig. 5 Hydrophobic analysis (A), signal peptide (B) and transmembrane domain (C) prediction of the key enzymes ThlA from C. kluyveri DSM 555

在酶的理化性質(zhì)和系統(tǒng)發(fā)育分析基礎(chǔ)上，研究以C.kluyveri模式菌株DSM 555來源硫解酶ThlA為代表性對象，采用Hphob/Kyte & Doolittle算法計(jì)算ThlA1、ThlA2和ThlA3的疏水性（圖5A）[25]。ThlA1疏水指數(shù)最小值為－2.556（370位），最大值為2.322（30位），總平均親水性指數(shù)（grand average of hydropathicity，GRAVY）為0.049；ThlA2疏水指數(shù)最小值為－2.622（368位），最大值為2.322（30位），GRAVY為0.104；ThlA3疏水指數(shù)最小值為－2.622（368位），最大值為2.289（30位），GRAVY為0.076。特定位點(diǎn)的氨基酸疏水性指數(shù)越大，表明該位點(diǎn)的疏水性越高[25]。3 個(gè)ThlA的GRAVY存在差別，說明三者雖然都是疏水蛋白，但是疏水性有差別。蛋白質(zhì)的疏水作用與其穩(wěn)定性具有密切的相關(guān)性，通過蛋白氨基酸位點(diǎn)的疏水性分析，結(jié)合蛋白質(zhì)工程技術(shù)，進(jìn)行關(guān)鍵位點(diǎn)或者區(qū)域的理性設(shè)計(jì)和改造，對于改善蛋白的穩(wěn)定性具有重要作用[26]。圖5B表明，3 拷貝的ThlA均不具有信號肽，不能分泌到胞外，是具有重要催化功能的胞內(nèi)酶?？缒^(qū)預(yù)測顯示，3 個(gè)酶均不具有明顯的跨膜區(qū)，是非跨膜蛋白（圖5C）。但與ThlA1相比，ThlA2和ThlA3的C端具有更強(qiáng)的疏水性，疏水性的差別可能會影響蛋白的結(jié)構(gòu)，進(jìn)而影響酶的催化特性[27]。不同硫解酶的催化特性存在差異，最近研究發(fā)現(xiàn)可能與硫解酶C端loop區(qū)的空間結(jié)構(gòu)有關(guān)[28]，但C端疏水性對催化的具體影響仍需要通過實(shí)驗(yàn)加以解析。通過生物信息學(xué)的技術(shù)手段對酶的可能催化機(jī)制進(jìn)行先期分析，可為后續(xù)的研究提供借鑒。

2.4 己酸代謝途徑關(guān)鍵酶ThlA結(jié)構(gòu)模擬和催化機(jī)制分析

圖6 關(guān)鍵酶ThlA1二級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig. 6 Prediction of the secondary structure of the key enzyme ThlA1

以C. kluyveri DSM 555來源ThlA1為例，進(jìn)行酶的結(jié)構(gòu)和催化機(jī)制解析。二級結(jié)構(gòu)預(yù)測表明，ThlA1蛋白具有15 個(gè)α-螺旋和9 個(gè)β-折疊，占序列總長的60.3%。另經(jīng)與相近序列的比對分析，確定Cys88、His350和Cys380為催化關(guān)鍵位點(diǎn)（圖6三角標(biāo)示位點(diǎn)的氨基酸），其中，His350行使激活酶催化的功能；Cys88與Cys380可以形成二硫鍵，二硫鍵的形成或者斷開會直接影響酶的催化，是調(diào)節(jié)酶催化與否的關(guān)鍵位點(diǎn)[23,28]。研究發(fā)現(xiàn)，綠色下劃線部分的loop結(jié)構(gòu)在空間上位于Cys88和Cys380之間，當(dāng)二硫鍵形成時(shí)，loop區(qū)會發(fā)生空間上的旋轉(zhuǎn)，進(jìn)一步阻礙乙酰輔酶A與酶催化活性中心的結(jié)合[28]。二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測對于蛋白的研究具有重要幫助，例如，當(dāng)序列同源性較低時(shí)，二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測有助于確定蛋白質(zhì)之間結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系；借助于蛋白二級結(jié)構(gòu)統(tǒng)計(jì)分析的規(guī)律，可以用于全新蛋白的從頭設(shè)計(jì)；另外，二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測有助于多維核磁共振中二級結(jié)構(gòu)的確認(rèn)和晶體結(jié)構(gòu)的解析[26,29]。

利用軟件SWISS MODEL以C. acetobutylicum來源硫解酶CaTHL（PDB:4xl4.1.A）為模板，構(gòu)建三維結(jié)構(gòu)模型（圖7A）。4xl4.1.A與ThlA1序列相似度為72.82%。目前研究發(fā)現(xiàn)，硫解酶一般以四聚體的形式存在，利用SWISS MODEL同時(shí)進(jìn)行了四聚體結(jié)構(gòu)的預(yù)測（參考蛋白PDB:4wyr.1.A）（圖7D）。四聚體是通過單體的L-結(jié)構(gòu)域（圖7A兩β折疊及其之間的無規(guī)則卷曲）結(jié)合形成的規(guī)則對稱結(jié)構(gòu)。研究同時(shí)進(jìn)行分子對接，確定酶與底物分子乙酰輔酶A的最佳結(jié)合角度和取向，并分析酶與底物可能的成鍵（圖7B和7C）。結(jié)構(gòu)解析結(jié)合文獻(xiàn)總結(jié)表明，Clostridium屬微生物來源的ThlA具有不同于已知硫解酶的獨(dú)特調(diào)控催化機(jī)制——氧化還原開關(guān)調(diào)控機(jī)制[28]。當(dāng)酶處于還原狀態(tài)時(shí)，Cys88與Cys380保持還原狀態(tài)，之間不形成二硫鍵，Cys88的硫原子失去氫離子被激活，進(jìn)而起始催化反應(yīng)（圖7E I）；當(dāng)酶處于氧化狀態(tài)時(shí)，Cys88與Cys380失去氫離子并形成二硫鍵，酶處于無活性狀態(tài)，不行使催化反應(yīng)（圖7E II）。

圖7 關(guān)鍵酶ThlA1單體的三維結(jié)構(gòu)模擬（A）、分子對接（B）、酶-底物作用關(guān)系分析（C）、四聚體結(jié)構(gòu)預(yù)測（D）、氧化還原開關(guān)催化調(diào)控（E）和具體催化機(jī)制（F）Fig. 7 Monomer modeling (A), molecular docking (B), enzymesubstrate interaction analysis (C), tetramer structure prediction (D),redox-switch catalytic regulation (E) and catalytic mechanism (F) of the key enzyme ThlA1

基于結(jié)構(gòu)解析和分子對接，推測ThlA1的催化機(jī)制如下：His350通過親核攻擊并轉(zhuǎn)移Cys88與硫原子連接的氫離子激活Cys88，Cys88的硫原子與?；o酶A的羰基碳原子作用生成共價(jià)鍵，形成?；?酶復(fù)合體，同時(shí)Cys380與硫原子連接的氫離子轉(zhuǎn)移到失去?；妮o酶A上（圖7F I和II）。之后，失去氫離子的Cys380與另一分子的?；o酶A發(fā)生作用，獲取底物?；臍潆x子，并激活底物的甲基碳原子向?；?酶復(fù)合體的羰基碳原子進(jìn)行親核攻擊，形成共價(jià)鍵，獲得以C2單位延長的酰基輔酶A（圖7F III和IV）[23-24,28,30]。碳鏈延長的?；o酶A最終經(jīng)硫酯酶的催化作用脫去輔酶A生成對應(yīng)鏈長的脂肪酸[11]（圖1）。

3 結(jié) 論

由于己酸對中國傳統(tǒng)釀造濃香型白酒風(fēng)味與品質(zhì)的重要作用和C. kluyveri對己酸合成的突出貢獻(xiàn)，研究對已知遺傳信息的3 株C. kluyveri進(jìn)行比較基因組學(xué)分析和己酸代謝途徑關(guān)鍵基因的深度挖掘及重新注釋。通過代謝途徑分析結(jié)合文獻(xiàn)研究，聚焦于C. kluyveri DSM 555來源己酸代謝途徑關(guān)鍵基因編碼的硫解酶ThlA1，對其序列和結(jié)構(gòu)進(jìn)行全面的生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)C. kluyveri來源ThlA1具有獨(dú)特的氧化還原開關(guān)調(diào)控機(jī)制，并結(jié)合分子對接，對具體催化的過程進(jìn)行闡釋。上述研究對于白酒重要功能微生物C. kluyveri己酸代謝合成途徑的科學(xué)解析，以及基于此改造菌株的己酸代謝性能，進(jìn)而科學(xué)調(diào)控傳統(tǒng)濃香型白酒的釀造具有重要意義。