劉亞秋 李新輝 李躍飛 李 策

(1. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所, 廣州 510380; 2. 農(nóng)業(yè)部珠江中下游漁業(yè)資源環(huán)境科學(xué)觀測實驗站, 廣州 510380;3. 上海海洋大學(xué)海洋科學(xué)學(xué)院, 上海 201306)

魚類在早期發(fā)育階段的生長規(guī)律及生理特性的變化特點對于研究其早期生活史發(fā)生機理具有的作用。饑餓在魚類早期發(fā)育階段是導(dǎo)致其仔魚死亡的重要原因之一[1]。在早期發(fā)育階段仔魚的生理生化變化特點是反映仔魚的生長及形態(tài)變化的指標[2, 3]。鯉(Cyprinus carpio)隸屬于鯉形目, 鯉科,是中國重要的經(jīng)濟魚類之一, 在長江、珠江等流域均有分布。在漁業(yè)生產(chǎn)中, 鯉作為西江流域的漁獲物之一占有重要地位[4]。近年來, 航道整治、采砂等人為活動影響, 鯉在西江的資源量明顯下降。目前關(guān)于鯉基礎(chǔ)生物學(xué)特性已有較多研究報道[4—6]。本實驗室已在西江郁南、高要、肇慶等江段開展了人工魚巢增殖鯉魚相關(guān)工作, 并對人工魚巢增殖效果進行了評估[7]。但有關(guān)西江鯉的早期發(fā)育中消化酶活性變化目前尚未見報道。在仔稚魚早期發(fā)育過程, 消化酶比活力已作為評價仔稚魚發(fā)育健康狀況的重要的指標之一[8, 9]。為此, 作者探究了鯉仔稚魚的生長過程中主要消化酶活性變化特征, 揭示其早期消化酶變化的規(guī)律, 以期豐富該江段鯉早期生活史資料, 也為鯉早期資源保護及苗種培育提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 實驗魚培育

2017年3月30日從西江肇慶江段人工魚巢抽取蘆葦, 約5.0 kg(附著有鯉胚胎約15000個), 放置于水桶中充氧, 帶回實驗室進行人工培育。實驗仔魚均來自同一批受精卵, 并于4月2日全部出膜。魚苗分6個組飼養(yǎng)于容積100 L的水族缸內(nèi), 每個水族缸內(nèi)飼養(yǎng)約2000尾, 飼養(yǎng)40d, 于5月12日結(jié)束。其中3個試驗組, 3—5日齡仔魚開始投喂蛋黃, 5—10日齡投喂豐年蟲; 10日齡后投喂顆粒飼料, 投喂之前清除缸內(nèi)剩余殘渣。飼養(yǎng)期間每天飽食投喂2次, 投喂時間為9:00和19:00。另外3個組不進行投喂, 實驗過程中發(fā)現(xiàn)未投喂組至15日齡鯉仔稚魚幾乎全部死亡。飼養(yǎng)期間, 水溫: 21—24℃, 溶氧: 7.2—7.9 mg/L,pH: 7.1—7.8。

1.2 樣品采集

分別在0、1、2、3、4、5、7、9、10、12、15、20、25、30和40日齡(孵化當日記為0日齡)對鯉仔稚魚全長與體重進行測量, 在1、2、3、5、7、9、12、15、18、20、25、30和40日齡對其消化酶活性測定。實驗取樣在早上9:00投喂完1h以后進行, 從3個水族缸中隨機撈取魚苗分別放入裝有清水的不同燒杯中, 0.5h后撈出, 取材過程中樣品均置于冰上, 以免消化酶失活。取完樣品后立即置于-40℃超低溫冰箱保存, 用于消化酶測定。

1.3 特定生長率的測定

特定生長率的計算公式:SGR=100×(lnFBW-lnIBW)/T, 其中FBW為個體終末體量(g),IBW為個體初始體重(g),T為時間(d)。

1.4 可溶性蛋白含量和消化酶活性的測定

快速從超低溫冰箱中取出待測樣品, 放置于冰盒上解凍。在解凍完成后, 按質(zhì)量: 體積為1∶4加入勻漿稀釋液, 進行勻漿。所得勻漿液用低溫超速離心機4℃, 3000 r/min轉(zhuǎn)速離心20min后取上清液用于消化酶活力測定。實驗中的可溶性蛋白含量以及消化酶比活力均使用南京建成公司生產(chǎn)的試劑盒進行檢測。實驗使用儀器為多功能高端酶標儀(Infinite M200 PRO)。

1.5 數(shù)據(jù)分析

對不同發(fā)育時期鯉仔稚魚的可溶性蛋白含量和各消化酶活性差異的顯著性, 采用單因子方差分析(ANOVA)檢驗。顯著性水平為0.05。采用Excel(2007)以及SPSS19.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。所測得實驗數(shù)據(jù)均以平均值±標準差(Means±SD)表示。

2 結(jié)果

2.1 生長情況

經(jīng)過40d飼養(yǎng)后(圖 1), 非饑餓組鯉體重由1.12 mg增至412.31 mg, 全長由5.77 mm增至34.65 mm, 特定生長率為14.81%。在發(fā)育過程中, 擬合全長和體重增長方程, 分別為:y=0.765x+4.002 (R2= 0.958)和y=0.218x2+1.488x-1.403 (R2=0.996)。饑餓組全長以及體重則沒有明顯增長。

圖 1 鯉仔稚魚發(fā)育過程中全長和體重隨日齡變化Fig. 1 Total length and body weight of C. carpio during the development of larvae and juvenile

2.2 可溶性蛋白含量

鯉仔稚魚在其生長的過程中(圖 2), 在1—3日齡, 非饑餓組可溶性蛋白含量下降, 并第3日齡時到達最小值。7日齡后, 可溶性蛋白質(zhì)含量上升, 25日齡后, 上升趨于平緩, 40日齡時達到(2.01±0.23) g/L。5日齡, 饑餓組可溶性蛋白含量逐漸降低, 15日齡時降至(0.43±0.05) g/L。

2.3 消化酶活性變化

如圖 3所示, 非饑餓組仔魚淀粉酶的比活力從1日齡到3日齡迅速增加(P＜0.05)。開口攝食后淀粉酶的比活力下降, 5日齡時降至最低, 隨后經(jīng)過短暫的波動在15日齡到達峰值。隨后小幅下降, 逐漸趨于穩(wěn)定。饑餓組淀粉酶比活力在3日齡到達最大,隨后淀粉酶比活力快速下降。非饑餓組脂肪酶比活力在1—5日齡顯著上升, 而在9日齡后脂肪酶比活力迅速下降(P＜0.05), 15日齡后又開始逐漸上升,至18日齡后趨于穩(wěn)定, 其后消化酶比活力保持在相對穩(wěn)定的水平。饑餓組脂肪酶在5日齡前變化趨勢與非饑餓組類似, 后迅速下降。非饑餓組胰蛋白酶比活力3日齡后快速升高, 在9日齡時達到峰值, 隨后顯著下降至15日齡后顯著上升(P＜0.05), 到25日齡后出逐漸下降。饑餓組7日齡達到峰值, 后迅速下降(P＜0.05)。在鯉仔稚魚發(fā)育過程中, 非饑餓組糜乳蛋白酶比活力在9日齡時達到峰值。在20日齡后, 糜乳蛋白酶比活力逐漸下降。饑餓組的糜乳蛋白酶比活力在3日齡后顯著下降(P＜0.05)。在9日齡后, 饑餓組糜乳蛋白酶比活力無顯著變化(P＞0.05)。非饑餓組堿性磷酸酶比活力從2日齡后, 開始顯著上升(P＜0.05), 在 3日齡和20日齡, 分別達到峰值,18日齡后堿性磷酸酶比活力顯著升高(P＜0.05), 到25日齡, 比活力趨于穩(wěn)定狀態(tài)。饑餓組堿性磷酸酶比活力在7日齡后顯著下降, 12日齡后趨于穩(wěn)定, 活性相對較低。非饑餓組氨基肽酶在出膜后迅速升高, 在3日齡和7日齡時, 達到峰值后逐漸下降至15日齡, 隨后逐漸緩慢上升。饑餓組5日齡后, 氨基肽酶比活力處于相對較低的水平。

3 討論

3.1 可溶性蛋白的變化

仔魚發(fā)育到出膜后3日齡可溶性蛋白含量降至最低。1—3日齡, 仔魚尚未開口, 生長發(fā)育所需的營養(yǎng)物質(zhì)主要由卵黃提供, 卵黃蛋白不斷減少導(dǎo)致蛋白含量快速下降。開口攝食后仔魚蛋白含量顯著上升。這與胭脂魚(Myxocyprinus asiaticus)、泥鰍(Misgurnus anguillicaudatus)的研究結(jié)果類似[10, 11]。而瓦氏黃顙魚(Pelteobagrus vachelli)的研究中發(fā)現(xiàn), 可溶性蛋白含量沒有顯著的下降[12]。推測鯉可溶性蛋白含量變化過程可能與仔稚魚發(fā)育過程中營養(yǎng)方式轉(zhuǎn)換相關(guān)。

3.2 消化酶活性的變化

圖 2 鯉仔稚魚發(fā)育過程中可溶性蛋白含量變化Fig. 2 Soluble protein content of C. carpio during th development of larvae and juvenile

在本研究中我們發(fā)現(xiàn)鯉淀粉酶、脂肪酶、胰蛋白酶、堿性磷酸酶、糜乳蛋白酶以及氨基肽酶的比活力在開口攝食前均能檢測到活性。Chen等[13]在對黃 魚(Seriola lalandi)消化系統(tǒng)發(fā)育研究中, 也有類似結(jié)果。Gawlicka等[14]研究發(fā)現(xiàn)消化酶的發(fā)育決定了仔魚開始攝取以及消化外源食物的時間。有研究表明, 消化酶在仔魚初孵時就已存在,因此, 在開始外源營養(yǎng)之前消化酶的發(fā)育不是被食物誘導(dǎo)的, 而是被其內(nèi)部遺傳機制所調(diào)控[15, 16]。鯉仔魚在開口攝食之前, 淀粉酶已具有較高的活性可能由于提供營養(yǎng)物質(zhì)的卵黃囊中含有豐富的糖原。也有研究表明仔魚消化酶活性會在外源營養(yǎng)開始之前達到相對高的水平, 以適應(yīng)消化外源食物的需要[17]。在3日齡, 淀粉酶活性顯著下降, 仔魚對蛋白質(zhì)和脂肪的利用能力增強, 而對糖類的利用能力減弱。也有學(xué)者認為仔魚在消化系統(tǒng)的發(fā)育過程中, 其淀粉酶分泌功能會出現(xiàn)一定的減弱[17, 18]。脂肪酶活性在5日齡達到峰值, 這可能與卵黃囊的吸收有關(guān)。但是在10—15日齡其活性降到很低的水平。Oozeki等[19]在對狹鱈(Theragra chalcogramma)的脂肪酶研究中也發(fā)現(xiàn)同樣的結(jié)果。對塞內(nèi)加爾鰨(Sole asenegalensis)的研究發(fā)現(xiàn), 早期仔魚體內(nèi)存在兩種不同類型的脂肪酶分別為與卵黃囊中脂肪的消化相關(guān)的脂酶以及與外源營養(yǎng)物質(zhì)中脂肪的消化相關(guān)的磷脂酶[20]。這2種脂肪酶相互轉(zhuǎn)變引起的仔魚初次攝食后脂肪酶活性的顯著下降。15日齡后逐漸上升, 恢復(fù)到穩(wěn)定的水平, 這是由于胰腺結(jié)構(gòu)完善以及分泌功能增強所致。胰蛋白酶和糜乳蛋白酶比活力在5日齡后顯著上升, 并在9日齡達到峰值。這說明外源食物對于胰蛋白酶分泌起到了一定刺激作用。12日齡后胰蛋白酶活性顯著上升, 表明了在這一時期鯉仔稚魚消化體系發(fā)育完善, 對蛋白質(zhì)消化能力逐漸增強, 而隨后的下降可能是由于鯉體內(nèi)的可溶性蛋白的累積。堿性磷酸酶和氨基肽酶, 主要存在于魚類腸道上皮刷狀緣膜[18, 21]。有學(xué)者提出將其活性變化作為仔魚腸道功能發(fā)育程度以及其營養(yǎng)物質(zhì)吸收狀況的評價指標[22, 23]。本研究發(fā)現(xiàn)鯉仔魚在1—3日齡, 堿性磷酸酶以及氨基肽酶活性顯著上升, 腸道消化吸收功能的增強, 也標志著細胞外消化的開始。7日齡時, 鯉仔魚堿性磷酸酶以及氨基肽酶達到峰值, 表明了腸道消化功能在這個階段的快速發(fā)育。18—25日齡堿性磷酸酶活性顯著性上升, 標志鯉仔稚魚腸道組織結(jié)構(gòu)完善, 腸細胞消化吸收功能逐漸完善。

圖 3 鯉仔稚魚發(fā)育過程中不同消化酶比活力變化Fig. 3 The activities of different digestive enzymes in C. carpio during the development of larvae and juvenile

3.3 饑餓對消化酶活性影響

鯉仔魚在3日齡時開口攝食, 在饑餓組仔魚的生長過程中, 并沒有投喂任何食物, 饑餓組仔魚的消化酶仍具有一定活性, 這可能說明消化酶的發(fā)生是主要受到了基因調(diào)控而并非受外源食物的誘導(dǎo)。但是由于外源食物嚴重缺乏, 此后的發(fā)育過程中, 鯉的消化酶活性逐漸下降。仔魚階段是一個細胞分化增殖非常集中的時期, 饑餓可以導(dǎo)致細胞的分化和增殖停止, 破壞細胞結(jié)構(gòu)和致使其功能的喪失, 從而引起消化酶活性的顯著下降[23]。

3.4 開口需求及人工魚巢設(shè)置

研究發(fā)現(xiàn), 鯉作為一種雜食性的魚類, 在發(fā)育早期對糖類物質(zhì)消化能較強, 隨著消化系統(tǒng)不斷發(fā)育, 對于蛋白質(zhì), 脂肪等營養(yǎng)物質(zhì)利用率會逐漸提高。在其苗種開口階段可選擇糖類物質(zhì)含量相對較高食物作為餌料, 來提高其成活率。人工魚巢最早使用于鯉的人工繁殖生產(chǎn)[24]。目前西江設(shè)置的人工魚巢主要是在鯉繁殖季節(jié)為其提供產(chǎn)卵場所以達到資源增殖的目的。其材料主要采用蘆葦, 當人工魚巢放置區(qū)域出現(xiàn)食物源不足情況時, 可考慮在已有普通材料上結(jié)合有機可腐化的材料制備人工魚巢, 其成分配方可根據(jù)不同發(fā)育時期鯉消化酶活性的變化來進行相應(yīng)調(diào)整, 降低饑餓對仔稚魚成活率的影響, 從而提高人工魚巢的生態(tài)修復(fù)功能。