夏繼剛 李秀明 付世建

(重慶師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院進(jìn)化生理與行為學(xué)實(shí)驗(yàn)室, 重慶市動物生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 重慶 401331)

全氟辛烷磺酸(Perfluorooctane sulfonate, PFOS,C8F17SO3)是全氟化合物家族中具有代表性的一種持久性有機(jī)污染物(Persistent Organic Pollutants,POPs), 被稱為“工業(yè)味精”, 由于具有疏水、疏油、耐高溫等特性, PFOS被廣泛應(yīng)用于紡織與印染、影像材料、半導(dǎo)體、電鍍鉻霧抑制劑、皮革與塑料加工、表面活性劑、泡沫滅火劑、防護(hù)涂料以及醫(yī)藥品等各類產(chǎn)品的生產(chǎn)中[1—5]。PFOS在環(huán)境中難以降解、易在生物體內(nèi)蓄積、毒性較強(qiáng)[6, 7],這些特性導(dǎo)致PFOS在全世界范圍內(nèi)的各類環(huán)境介質(zhì)以及動植物體內(nèi)被廣泛檢測出[1, 6, 8]。2009年5月,PFOS作為一種新型的POPs被增列入《斯德哥爾摩公約》。2018年1月, 我國將PFOS正式列入《中國嚴(yán)格限制的有毒化學(xué)品名錄》。

PFOS在我國水域生態(tài)系統(tǒng)的污染較為嚴(yán)重[1, 9—12]。例如, 長江上游、嘉陵江江水以及下游三峽庫區(qū)江水均存在著不同程度的PFOS污染[12],不僅如此, 在長江野生魚體內(nèi)也普遍檢測出了PFOS[9]。PFOS對魚類等水生生物健康的影響以及水生生態(tài)系統(tǒng)安全的潛在威脅已成為當(dāng)前人們高度關(guān)注的水環(huán)境問題。

PFOS具有環(huán)境內(nèi)分泌干擾作用, 可以引發(fā)遺傳毒性、繁殖與發(fā)育毒性、免疫與神經(jīng)毒性等[2, 8, 13, 14]。近期研究表明, PFOS還具有代謝毒性,能夠?qū)е卖~類代謝水平升高、有氧運(yùn)動能力以及游泳效率下降[4, 15], 尚未見PFOS對魚類爆發(fā)游泳能力及其相關(guān)代謝特征的影響的研究報(bào)道。爆發(fā)游泳(Burst swimming)是一種快速的高能耗游泳運(yùn)動,在魚類捕食獵物、逃避捕食者、穿越激流尋找適宜生境等生存活動中發(fā)揮重要作用[16, 17]。另一方面, 由于爆發(fā)游泳主要依賴于無氧代謝供能, 其持續(xù)的時(shí)間往往較短, 力竭運(yùn)動后的代謝恢復(fù)能力將直接影響到魚類后續(xù)的爆發(fā)游泳性能[16, 17, 18], 因此對魚類的生存適合度至關(guān)重要。

為探究PFOS污染對魚類爆發(fā)游泳及其代謝恢復(fù)能力的影響, 本研究以長江中上游廣泛分布的中華倒刺鲃幼魚(Spinibarbus sinensis)為對象, 考察了不同濃度PFOS暴露對該物種靜止代謝率(Resting metabolic rate, RMR)、爆發(fā)游泳速度(Burst swimmingspeed,Uburst)以及運(yùn)動力竭后代謝恢復(fù)特征的影響, 為評估PFOS的代謝毒性及其潛在的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物與試劑

中華倒刺鲃(Spinibarbus sinensis)幼魚購于重慶市當(dāng)?shù)佤~市, 于實(shí)驗(yàn)室條件下馴養(yǎng)適應(yīng)2周。實(shí)驗(yàn)用水為充分曝氣脫氯并經(jīng)過活性炭過濾的自來水, 水溫(18.0±0.5)℃, 溶解氧＞8 mg/L, 光暗周期15 L∶9 D, 飼養(yǎng)密度ρ＜0.5 g/L, 氨氮濃度＜0.02 mg/L;每日投喂1次冰凍紅蟲, 投喂5min后, 吸去殘餌。在馴養(yǎng)結(jié)束后, 選取大小相近、健康活潑的中華倒刺鲃幼魚[(2.88±0.07) g, (5.68±0.04) cm,n=60]開展實(shí)驗(yàn)。

PFOS(純度＞99%)購自Tokyo Kasei Kogyo Co.Ltd(Tokyo, Japan), 其余化學(xué)品購自Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, USA)。將PFOS以二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide, DMSO)為助溶劑, 配置成0.5 g/mL的PFOS母液, 4℃避光保存, 待用。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用半靜態(tài)暴露法, 暴露容器為方形玻璃缸(42 cm ×22 cm ×42 cm, 長×寬×高, 實(shí)際水量為22 L)?；谇捌趯?shí)驗(yàn)研究[4, 5]并參考實(shí)際環(huán)境中可能出現(xiàn)的PFOS濃度(最高可達(dá)6.57 mg/L)[19], 本實(shí)驗(yàn)共設(shè)5個(gè)PFOS濃度梯度組, 分別為對照組(0)、0.32、0.8、2和5 mg/L PFOS暴露組, 各組DMSO濃度不超過0.001% (v/v), 暴露時(shí)長為4周。每個(gè)濃度梯度處理隨機(jī)放入馴化適應(yīng)后的中華倒刺鲃幼魚12尾(n=12)。暴露期間, 每天更換含有相應(yīng)濃度PFOS的水溶液50%, 所更換的新水體均在換水前新配置, 新水體PFOS濃度與實(shí)驗(yàn)設(shè)置濃度保持一致。除水體含有PFOS污染物外, 其余飼養(yǎng)狀況及水質(zhì)條件與馴化期間相同。污染水體經(jīng)活性炭過濾后排入污水處理系統(tǒng)。

在暴露結(jié)束后, 依次對實(shí)驗(yàn)魚的靜止代謝率(RMR), 暴發(fā)游泳速度(Uburst)以及力竭運(yùn)動后的代謝恢復(fù)特征(Excess post-exercise oxygen consumption, EPOC)等進(jìn)行測定, 各測定參數(shù)的樣本量均為n=12。

1.3 參數(shù)測定

RMR采用流水式呼吸代謝測定儀測定RMR[20]。測定前將實(shí)驗(yàn)魚禁食24h, 之后將單尾實(shí)驗(yàn)魚移入呼吸室(100 mL)并使其適應(yīng)24h。在適應(yīng)結(jié)束后, 分別于3個(gè)時(shí)間段(10:00、14:00和18:00)使用溶氧儀(HQ30, Hach Company, Loveland, CO,USA; 測量精度為0.01 mg O2/L)檢測呼吸室內(nèi)環(huán)境溶氧水平的變化(每個(gè)時(shí)間段測定3次), 最后將平均值用于計(jì)算。RMR以單位時(shí)間內(nèi)實(shí)驗(yàn)魚的呼吸耗氧量表示, 計(jì)算公式如下:

式中, ΔO2(mg/L)為實(shí)驗(yàn)魚所在呼吸室和空白呼吸室(無魚室)出水口處溶氧水平的差值;v(L/h)為呼吸室的水流速度;m(kg)為實(shí)驗(yàn)魚的體重。測試水溫為(18.0±0.5)℃。為了避免水體溶氧降低可能引發(fā)的生理應(yīng)激, 在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中, 呼吸室內(nèi)的溶氧水平不低于水體飽和溶氧的85%。

爆發(fā)游泳能力采用魚類游泳代謝儀測定Uburst。該設(shè)備體積3.5 L, 橫截面積19.9 cm2, 其結(jié)構(gòu)與工作原理詳見Li等[21], 游泳管連接計(jì)算機(jī), 管內(nèi)的水流速度由編寫的程序控制。測定時(shí), 將單尾實(shí)驗(yàn)魚放入游泳管中適應(yīng)1h以使其適應(yīng)流水環(huán)境, 適應(yīng)水流為6 cm/s(約為一倍體長/s), 測試水溫為(18.0±0.5)℃。在適應(yīng)結(jié)束后, 將測定儀中的水流速度以0.167 cm/s2的加速度持續(xù)增加, 直至實(shí)驗(yàn)魚到達(dá)運(yùn)動力竭狀態(tài), 實(shí)驗(yàn)魚力竭時(shí)的水流速度即為其爆發(fā)游泳速度[16]。力竭狀態(tài)的評判標(biāo)準(zhǔn)為實(shí)驗(yàn)魚無力前進(jìn)游泳并停留在游泳管末端篩板20s以上。將Uburst除以實(shí)驗(yàn)魚體長記為相對爆發(fā)游泳速度(relativeUburst,rUburst)。

運(yùn)動力竭后代謝恢復(fù)特征將運(yùn)動力竭后的實(shí)驗(yàn)魚立即放入流水式呼吸代謝測定儀并監(jiān)測呼吸室內(nèi)溶氧量的變化[22], 數(shù)據(jù)采集時(shí)間分別為實(shí)驗(yàn)魚放入呼吸室前(0)以及放入后的第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28和30min。依據(jù)呼吸室內(nèi)溶氧值的動態(tài)變化特征, 計(jì)算得出以下參數(shù): (1)運(yùn)動后代謝峰值, 即實(shí)驗(yàn)魚在運(yùn)動力竭后恢復(fù)過程中觀測到的最大代謝率(Maximum metabolic rate, MMR)[mg O2/(kg·h)]; (2)代謝率增量(MMR-RMR)[mg O2/(kg·h)], 即力竭運(yùn)動前后代謝率的變化量也叫代謝范圍(Metabolic scope, MS); (3)代謝變化倍差(MMR/RMR), 即力竭運(yùn)動前后代謝率變化的倍率(Factorial metabolic scope, F-MS); (4)力竭運(yùn)動后過量氧耗(EPOC)(mg O2/kg), 即實(shí)驗(yàn)魚在力竭運(yùn)動后恢復(fù)過程中各個(gè)時(shí)間點(diǎn)高于RMR的差值在時(shí)間上的積分。

1.4 數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用軟件SPSS for Windows 16.0 (SPSS Inc.,USA)對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。首先對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性和方差齊性檢驗(yàn), 然后采用單因素方差分析(ANOVA)和Tukey’s HSD法檢驗(yàn)差異顯著性。各組數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示, 顯著性水平設(shè)在P＜0.05。

2 結(jié)果

2.1 PFOS對RMR的影響

暴露濃度對實(shí)驗(yàn)魚RMR的影響顯著(F=5.04,P=0.002), 高濃度處理導(dǎo)致RMR顯著升高 (表 1)。

2.2 PFOS對爆發(fā)游泳能力的影響

暴露濃度對實(shí)驗(yàn)魚的Uburst和rUburst均影響顯著(Uburst,F=4.92,P=0.002;rUburst,F=3.59,P=0.011),高濃度處理導(dǎo)致Uburst和rUburst均顯著降低(圖 1); 然而, 在最低劑量PFOS暴露下Uburst和rUburst亦有下降的趨勢(圖 1), 0.8和0.32 mg/LPFOS暴露組相比,rUburst顯著升高(P=0.013), 5和0.8 mg/LPFOS暴露組相比,rUburst顯著下降(P=0.002)。

2.3 PFOS對運(yùn)動力竭后代謝恢復(fù)特征的影響

不同濃度PFOS處理的實(shí)驗(yàn)魚在運(yùn)動力竭后的代謝恢復(fù)特征見圖 2, 所有處理組的代謝率都快速上升達(dá)到峰值, 隨后逐步下降并逐步恢復(fù)到運(yùn)動前水平。PFOS對實(shí)驗(yàn)魚的MMR、MS、F-MS、EPOC均無顯著影響(P＞0.05)(表 1)。

3 討論

3.1 PFOS對爆發(fā)游泳能力的影響

游泳能力作為表征魚類達(dá)爾文適合度的重要指標(biāo), 通常被用來預(yù)測魚類的生態(tài)表現(xiàn)及其棲息地的生態(tài)適宜性[23—26]。在本研究中, 高濃度(5 mg/L)PFOS暴露導(dǎo)致中華倒刺鲃幼魚的Uburst和rUburst分別下降了17.4%和10.8%, 提示PFOS污染將可能對魚類捕食——逃避捕食者、穿越激流尋找適宜生境等生存關(guān)聯(lián)的生命活動起到負(fù)面影響[16, 17]。前期研究表明, PFOS可對中華倒刺鲃幼魚的臨界游泳速度[4]以及快速啟動游泳能力[5]等均產(chǎn)生重要的負(fù)面效應(yīng), 結(jié)合本研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出, 該物種的多種游泳性能均對水體PFOS污染較為敏感, 可作為PFOS污染重要的生態(tài)指示。此外, 值得關(guān)注的是, 在最低劑量PFOS暴露下Uburst和rUburst亦有下降的趨勢(圖 1), 表現(xiàn)出潛在的“低劑量效應(yīng)”;PFOS對rUburst的影響還表現(xiàn)出一定的“非單調(diào)劑量效應(yīng)”, 即隨著PFOS濃度升高,rUburst表現(xiàn)出先降后升再降的趨勢。PFOS毒理學(xué)作用的非單調(diào)劑量效應(yīng)已引起研究者的較大關(guān)注[27—30]。例如, 有研究發(fā)現(xiàn), 己烯雌酚(Diethylstilboestrol)對小鼠前列腺發(fā)育的影響呈現(xiàn)低劑量增殖高劑量抑制的“倒U形”劑量-效應(yīng)關(guān)系[27]; 斑馬魚(Danio rerio)仔魚的吻寬/體長隨著PFOS暴露濃度的升高, 呈現(xiàn)出先下降后升高的趨勢, 0.1 mg/L PFOS暴露導(dǎo)致斑馬魚仔魚吻寬/體長顯著下降, 而1 mg/L PFOS暴露與對照組相比無顯著性差異[2]。PFOS非單調(diào)劑量-效應(yīng)的作用機(jī)制尚不清楚, Welshons等[31]用“游離受體假說”解釋這種毒理學(xué)作用效應(yīng), 認(rèn)為這些具有環(huán)境內(nèi)分泌干擾作用的污染物在較低濃度下與其相對應(yīng)的游離受體發(fā)生反應(yīng), 但當(dāng)其相應(yīng)的受體達(dá)到飽和以后,便又有可能與其他受體發(fā)生反應(yīng)或引發(fā)其他方面的生物學(xué)效應(yīng)。

3.2 PFOS對RMR及運(yùn)動后代謝恢復(fù)的影響

RMR為魚體在靜止并且空腹?fàn)顟B(tài)下的代謝率,在一定程度上反映了機(jī)體運(yùn)行基本生理功能的維持能量消耗和整體生理狀況, 在魚類生理生態(tài)學(xué)研究中受到廣泛關(guān)注。在本研究中, PFOS對中華倒刺鲃幼魚的RMR影響顯著, 高濃度(5 mg/L)PFOS暴露導(dǎo)致RMR顯著升高 了25.7%, 提示遭遇污染環(huán)境下的實(shí)驗(yàn)魚需要花費(fèi)更多的能量用于“解毒”、機(jī)體修復(fù)以及維持內(nèi)穩(wěn)態(tài)[25, 32]。RMR升高可能主要與PFOS暴露致使機(jī)體糖代謝功能紊亂有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn), PFOS暴露可以抑制許氏平鲉(Sebastes schlegeli)鰓組織Na+-K+ATP酶活性并降低血糖水平[33];1 mg/L PFOS暴露即可導(dǎo)致杜父魚(Cottus gobio)線粒體細(xì)胞色素c氧化酶(Cytochromecoxidase)活性降低40.2%、檸檬酸合成酶(Citrate synthase)活性顯著提升19.9%, 并影響鰓組織能量代謝相關(guān)的蛋白的表達(dá)[34]。值得關(guān)注的是, 盡管RMR受PFOS暴露的影響顯著, PFOS對實(shí)驗(yàn)魚的MMR、MS、FMS、EPOC均無顯著影響。MMR的非顯著性變化提示水體PFOS污染主要是改變實(shí)驗(yàn)魚能量代謝水平的

表 1 PFOS對中華倒刺鲃幼魚RMR和力竭運(yùn)動后代謝恢復(fù)的影響Tab. 1 The effects of PFOS on RMR and metabolic recovery after exhaustive swimming in juvenile Spinibarbus sinensis

圖 1 PFOS對中華倒刺鲃幼魚爆發(fā)游泳能力的影響Fig. 1 The effects of PFOS on the Uburst (A) and rUburst (B) in juvenile Spinibarbus sinensis

圖 2 不同濃度PFOS處理下實(shí)驗(yàn)魚在運(yùn)動力竭后的代謝恢復(fù)特征Fig. 2 Metabolic recovery after exhaustive swimming in juvenile Spinibarbus sinensis upon exposure to different PFOS concentrations

下限, 而對其能量代謝水平的上限無明顯的限制性作用。MS和F-MS的非顯著性變化則表明PFOS對實(shí)驗(yàn)魚的代謝空間無顯著影響, 研究結(jié)果與Xia等[4]一致。EPOC是動物運(yùn)動后恢復(fù)期超過靜止?fàn)顟B(tài)耗氧量水平的額外耗氧量, 體現(xiàn)了魚類的無氧代謝及其代謝恢復(fù)能力; 通常EPOC越大, 魚類的無氧代謝能力也越強(qiáng)[35]。力竭運(yùn)動后EPOC的變化主要與魚體白肌中能量代謝底物恢復(fù)和代謝廢物的清楚速率等有關(guān)[21, 36], 在本研究中, 中華倒刺鲃幼魚的EPOC不受PFOS暴露的影響, 提示PFOS可能對其無氧代謝關(guān)聯(lián)的代謝恢復(fù)能力無顯著的生態(tài)毒理效應(yīng)。