趙宗武 李 琪, 2 張景曉 徐成勛

(1. 中國海洋大學(xué)海水養(yǎng)殖教育部重點實驗室, 青島 266003; 2. 青島海洋科學(xué)與技術(shù)國家實驗室,海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過程功能實驗室, 青島 266200)

長牡蠣(Crassostrea gigasThunberg)又稱太平洋牡蠣, 自然分布于西北太平洋海域, 是一種廣溫、廣鹽性貝類, 具有適應(yīng)性強、生長速度快、營養(yǎng)豐富、肥滿度高等優(yōu)點。長牡蠣在我國北方沿海均有養(yǎng)殖, 但以遼寧、山東、江蘇較多, 2016年我國牡蠣產(chǎn)量4.83×109kg, 占海水貝類養(yǎng)殖產(chǎn)量的34.03%[1]。長牡蠣繁育所需苗種的主要來源是人工育苗, 而育苗親本大都來源于未經(jīng)選育的野生型群體[2]。近年來養(yǎng)殖水域環(huán)境惡化, 長牡蠣出現(xiàn)了種質(zhì)退化、生長緩慢、死亡率高、殼型不規(guī)則等問題, 嚴(yán)重制約著我國牡蠣產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。因此, 進行長牡蠣的遺傳改良工作, 培育具有生長性能好、抗逆性高等特性的新品種, 對促進牡蠣產(chǎn)業(yè)的發(fā)展,打開牡蠣高端市場具有重要意義。

家系選育是開展遺傳育種工作的一種重要技術(shù)手段。群體中含有豐富的基因型, 通過建立家系,對經(jīng)濟性狀進行選擇, 加快目的性狀基因的純化速度, 最終實現(xiàn)水產(chǎn)動物種質(zhì)改良的目的[3]。在一些重要的經(jīng)濟貝類, 如海灣扇貝(Argopecten irradians)[4, 5]、菲律賓蛤仔(Ruditapes philippinarum)[6, 7]、馬氏珠母貝(Pinctada martensii)[8]、青蛤(Cyclina sinensis)[9]等, 已有研究表明家系選育能夠?qū)ω愵惖慕?jīng)濟性狀進行遺傳改良。

在動物遺傳改良過程中, 遺傳參數(shù)的準(zhǔn)確評估對個體遺傳評定、選擇反應(yīng)預(yù)測、育種方案設(shè)計以及選育策略制定有重要的指導(dǎo)意義[10]。關(guān)于長牡蠣遺傳參數(shù)的估計已有相關(guān)報道, Dégremont等[11, 12]、Langdon等[13]和Evans等[14]研究了長牡蠣不同生長階段生長、存活和產(chǎn)量等經(jīng)濟性狀的遺傳參數(shù)。在國內(nèi), 王慶志等[15, 16]報道了長牡蠣幼體和成體生長性狀的遺傳參數(shù), 王雪磊等[17]對殼金品系長牡蠣生長和殼色性狀的遺傳參數(shù)進行了關(guān)聯(lián)分析。

本研究以連續(xù)選育7代的殼白長牡蠣品系為素材, 利用巢式設(shè)計成功構(gòu)建29個全同胞家系, 比較各家系幼體生長存活的差異, 以期篩選出生長和存活性能優(yōu)良的家系材料, 同時進行殼白長牡蠣幼體生長性狀遺傳參數(shù)的評估, 旨在為殼白長牡蠣新品種的培育和選育策略的制定提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 家系構(gòu)建

2017年5月從經(jīng)過4代家系選育和3代群體選育的第7代(F7)殼白長牡蠣品系中, 挑選個體較大、殼型規(guī)整的個體作為親本, 于室內(nèi)進行人工促熟。2017年6月, 殼白長牡蠣性腺發(fā)育成熟, 用解剖法辨別雌雄后, 采用平衡巢式設(shè)計, 一雄配三雌, 將適量的精卵在5 L塑料桶內(nèi)混合, 共構(gòu)建12個半同胞家系, 36個全同胞家系。同時選取3對未經(jīng)選育的普通個體作為親本, 通過單對交配的方式建立對照組。實驗構(gòu)建36個家系, 最終29個家系培育至稚貝。

1.2 孵化及培育

在人工授精完成后, 將殼白家系各組受精卵轉(zhuǎn)移至100 L聚乙烯塑料桶中進行孵化, 3個對照組家系共同置于1個100 L聚乙烯塑料桶中進行孵化, 孵化密度控制在20—40個/mL。在孵化22h后, 發(fā)育至D形幼體, 用300目的篩絹網(wǎng)洗卵, 將各組篩選出的幼體轉(zhuǎn)移至孔徑300目、容積240 L的篩絹網(wǎng)筐中,放置在大池內(nèi)培養(yǎng)。苗種培育方法參考王慶志等[15],并作適當(dāng)調(diào)整, 幼體初始培育密度調(diào)整為10—12個/mL。在幼體培育過程中, 每天早晚各換水1次, 每次1/3; 根據(jù)幼體生長狀況, 投喂適量的等鞭金藻(Isochrysis galbana)和扁藻(Platymonassp.); 根據(jù)日常觀測大小, 將幼體適時轉(zhuǎn)移至230目和160目的篩絹網(wǎng)筐中; 每2天調(diào)整1次密度, 消除培育密度的影響; 控制水溫在23—25℃, 持續(xù)充氣。培育階段, 保持各組管理操作相同, 嚴(yán)格避免家系間交叉污染。

1.3 生長和存活數(shù)據(jù)測定

在受精卵發(fā)育至D形幼體后, 在第3、第7、第11、第15和第19天分別測定各組的幼體密度, 每組重復(fù)測量3次, 計算幼體的存活率; 同時, 從各組隨機選取30個個體, 用盧戈氏液固定, 在顯微鏡下測量其生長大小。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2016和SPSS 20.0軟件對各組的生長和存活數(shù)據(jù)做初步統(tǒng)計處理后, 用單因素方差分析(ANOVA)和Tukey多重比較對數(shù)據(jù)進行分析, 以P＜0.05作為顯著性水平。生長和存活率相對提高率公式如下:

存活率相對提高率(%)=(實驗組存活率-對照組存活率)/對照組存活率×100

生長性狀相對提高率(%)=(實驗組生長性狀-對照組生長性狀)/對照組生長性狀×100

采用ASReml 3.0軟件中約束極大似然法(REML)進行遺傳參數(shù)評估[17], 根據(jù)軟件要求對數(shù)據(jù)進行整理排列, 建立多性狀個體動物模型:

式中,Yijk為性狀測量值,μ表示總體均值,aijk為加性遺傳效應(yīng),fijk為家系效應(yīng)(包括共同環(huán)境效應(yīng)),eijk為隨機殘差。

2 結(jié)果

2.1 幼體存活率比較

在3日齡, 殼白長牡蠣家系和對照組家系的存活率沒有顯著差異(P＞0.05); 隨著幼體培育時間的增加, 各家系存活率均呈現(xiàn)出下降趨勢, 部分家系在7日齡、11日齡出現(xiàn)明顯降低。在整個幼體培養(yǎng)階段, 所有殼白長牡蠣家系的平均存活均高于對照組1.11%—19.26%, 其中, G7、G9和G13家系在3日齡后, 存活率一直保持在較低水平, 其19日齡的存活率分別降低至13.88%、12.29%和13.64%; 而G1、G3、G4、G11、G15、G28、G32和G35家系保持著較高的存活率, 在19日齡時, 這些家系存活率分別為54.17%、31.58%、42.86%、33.33%、32.14%、30.77%、59.15%和36.40%, 并且顯著高于對照組(P＜0.05, 圖 1)。

2.2 幼體生長比較

應(yīng)用單因素方差分析(ANOVA)發(fā)現(xiàn), 不同日齡殼白長牡蠣幼體在父系間、母系間殼高和殼長的F檢驗均達到了極顯著水平(P＜0.01); 均方結(jié)果表明, 父系各組間殼高和殼長的生長存在較大差異,且隨著培育時間的增加, 差異性增大(表 1)。

利用Tukey多重比較分析發(fā)現(xiàn), 在整個幼體培育階段, 殼白長牡蠣家系殼高性狀的平均值均高于對照組3.65%—14.58%。進一步分析發(fā)現(xiàn), 在3、7、11、15和19日齡殼白長牡蠣家系組和對照組生長性狀存在較大差異, 不同家系在同一日齡下的累計生長量并不相同, 在不同日齡家系殼高均值的大小排序也存在不一致性, 其中G4和G21在培育階段生長緩慢, 殼高的累積生長量排在所有家系下游;但部分家系在不同日齡保持著較快生長速度, 排序位于前列, 其中G9、G10、G11、G15、G16和G35生長優(yōu)勢明顯。在19日齡, 這些家系殼高的累積生長量比殼白長牡蠣家系均值分別高33.37%、22.35%、17.03%、11.87%、23.09%和 40.80%, 比對照組高52.81%、40.18%、34.09%、28.18%、41.03%和61.32%(表 2)。

2.3 遺傳參數(shù)

利用多性狀個體模型計算3、7、11、15和19日齡的幼體遺傳力, 結(jié)果顯示在不同日齡殼白長牡蠣幼體殼高和殼長的遺傳力不同。殼高的遺傳力的變化范圍是0.28—0.81, 殼長的遺傳力變化范圍是0.42—0.88, 均屬于中高遺傳力。殼高和殼長遺傳力的最大值分別在3日齡和15日齡, 為0.81±0.15和0.88±0.15; 遺傳力的最小值分別在7日齡和3日齡, 為0.28±0.09和0.42±0.11(表 3)。

根據(jù)軟件中的pin函數(shù)對生長性狀進行相關(guān)性分析, 在3、7、11、15和19日齡, 殼白長牡蠣幼體殼高和殼長的遺傳相關(guān)和表型相關(guān)存在差異, 遺傳相關(guān)和表型相關(guān)的范圍分別為0.35—0.81、0.57—0.85, 均為正相關(guān)(表 4)。

3 討論

3.1 殼白長牡蠣幼體的生長和存活

世界上主要水產(chǎn)養(yǎng)殖國家的育種方式主要以選擇育種和雜交育種為主[18]。其中通過選擇育種技術(shù)來提高選育生物的生長性狀、品質(zhì)性狀和抗逆抗病性狀, 應(yīng)對種質(zhì)退化、環(huán)境惡化等問題, 是目前普遍采用的一種有效的遺傳改良技術(shù)。而家系選育作為選擇育種的重要方法, 能夠高效地利用家系間的遺傳變異, 使控制經(jīng)濟性狀的主效基因和微效基因快速純合, 最終得到選育所需特征的育種材料[19]。

圖 1 長牡蠣幼體不同家系存活率的比較Fig. 1 The survival rate of different families at larval stage of C. gigas

表 1 殼白長牡蠣家系幼體不同生長時期表型變量組成的方差分析Tab. 1 Components of phenotypic variation of white shell families of C. gigas larvae at different stages

貝類具有繁殖力高、生殖周期短、群體遺傳變異大等特點[20], 特別適合開展選擇育種工作。生長和存活是評估生物體選育的2個重要指標(biāo), 直接影響著最終產(chǎn)量, 通過家系選育的方法, 可望獲得長牡蠣高產(chǎn)抗逆的家系。Langdon等[13]發(fā)現(xiàn)經(jīng)過一代家系選育后, 長牡蠣的產(chǎn)量比未經(jīng)選育的增加了9.5%; Taris等[21]通過建立30個全同胞家系, 發(fā)現(xiàn)長牡蠣生長性狀有較大遺傳變異, 選育潛力大, 選育組比對照組的生長提高了近10.0%, 發(fā)育至附著變態(tài)的時間減少12%, 死亡率低14.2%。Dégremont等[11]在夏季高溫時期建立43個長牡蠣全同胞家系,發(fā)現(xiàn)經(jīng)過逐代篩選, 長牡蠣在高溫季節(jié)存活率得到改良; 王雪磊等[22]建立了25個殼金長牡蠣家系, 發(fā)現(xiàn)在幼體時期, 選育組比對照組生長和存活分別提高了2.27%—16.67%和1.72%—9.40%。本研究比較分析了殼白長牡蠣家系和對照組幼體的生長和存活, 發(fā)現(xiàn)在不同日齡, 殼白長牡蠣家系殼高的平均值均高于對照組, 且不同家系間差異顯著, G9、G10、G11、G15、G16和G35六個家系在整個幼體培養(yǎng)階段均表現(xiàn)出生長優(yōu)勢; 同時, 殼白長牡蠣所有家系存活率的平均值比對照組有所提高, 其中G1、G3、G4、G11、G15、G28、G32和G35家系相較于家系均值和對照組保持著較高優(yōu)勢, 表明殼白長牡蠣經(jīng)過7代選育后, 其生長性狀和存活率都得到了一定程度的改良, 并具有較高的遺傳變異,作為一個新品系選育潛力較大。其中G11、G15和G35家系在生長和存活率方面均有較大優(yōu)勢, 可以繼續(xù)觀測其稚貝和成體的生長情況, 作為良種培育的備選材料。

表 2 幼體期不同家系殼高生長的比較Tab. 2 The shell height of different families at larval stage of C. gigas

表 3 殼白長牡蠣幼體不同時期生長性狀的遺傳力Tab. 3 Heritabilities of growth traits in white shell C. gigas larvae at different stages

表 4 殼白長牡蠣幼體不同時期生長性狀的遺傳相關(guān)和表型相關(guān)Tab. 4 Genetic and phenotypic correlations of growth traits in white shell C. gigas larvae at different stages

3.2 殼白長牡蠣幼體生長性狀的遺傳參數(shù)

遺傳力是生物性狀所特有的遺傳特性, 反映了性狀遺傳能力的大小。研究建立了29個殼白長牡蠣全同胞家系, 利用多性狀動物模型, 評估了殼白長牡蠣幼體殼高和殼長在3、7、11、15和19日齡的遺傳力, 結(jié)果顯示分別為0.28—0.81、0.42—0.88,屬于中高遺傳力, 與之前的研究報道相似[15]。國內(nèi)外學(xué)者對長牡蠣經(jīng)濟性狀遺傳參數(shù)評估的報道較多, Hedgecock等[23]估算了長牡蠣收獲時肉重的狹義遺傳力約為0.20; Lannan[24]利用11—15個全同胞家系評估了18月齡長牡蠣生長性狀的遺傳力, 結(jié)果顯示殼高、總重、殼重和肉重的遺傳力依次是0.15、0.33、0.32和0.37; Dégremont等[11]利用巢式設(shè)計建立了43個全同胞家系, 結(jié)果表明6—8月齡長牡蠣存活率的狹義遺傳力為0.47—1.08; Kong等[25]的研究結(jié)果表明, 12月齡長牡蠣殼高、殼長、殼寬和總重的遺傳力分別為0.49±0.25、0.36±0.19、0.45±0.23和0.35±0.17; 王慶志等[16]利用連續(xù)兩年建立的24個和36個全同胞家系, 對360日齡長牡蠣生長性狀的遺傳參數(shù)進行了評估, 發(fā)現(xiàn)殼高和總重的遺傳力為中高遺傳力, 繼續(xù)進行群體選育, 預(yù)期會得到較好的選育效果。

生物體的數(shù)量性狀之間大多相互關(guān)聯(lián), 這種情況的根本原因可能是生物體在長期的系統(tǒng)發(fā)育過程中由基因連鎖和基因的多效性引起的, 也可能是各性狀受到相同的環(huán)境因素的影響。因此可以利用性狀間的相關(guān)性, 在選擇育種工作中進行間接選擇, 提高選種的效率。然而, 我們通常觀測到的性狀間的表型相關(guān), 是由遺傳相關(guān)和環(huán)境相關(guān)共同作用產(chǎn)生的, 因此只有性狀間的遺傳相關(guān)較大時, 才會得到比較好的相互選擇效果[10]。Losee[26]報道了美洲牡蠣(Crossostrea virginica)幼體和成體的生長速度之間存在顯著的遺傳正相關(guān); Newkirk和Haley[27]的研究結(jié)果表明歐洲牡蠣(Ostrea edulis)幼體和1齡稚貝的殼長存在顯著的遺傳負相關(guān); Collet等[28]對長牡蠣變態(tài)前后的生長速度做了相關(guān)性分析, 結(jié)果顯示存在顯著的遺傳正相關(guān); Ernande等[29]的研究結(jié)果表明長牡蠣幼體生長速度與附著規(guī)格存在遺傳正相關(guān), 并且提出選育可以優(yōu)化附著的時間和大小。本研究得到的殼白長牡蠣幼體在不同日齡殼高和殼長的遺傳相關(guān)范圍在0.35—0.81, 均為正相關(guān), 表明二者之間可以相互選擇。但隨著時間發(fā)展,發(fā)現(xiàn)遺傳相關(guān)有逐漸降低的趨勢, 這可能是殼白長牡蠣后期生長差異大的原因之一。

4 結(jié)論

本研究通過比較分析殼白長牡蠣家系和對照組幼體時期的生長、存活情況, 發(fā)現(xiàn)G11、G15和G35家系具有突出的生長和存活優(yōu)勢, 在19日齡, 其殼高的累積生長量與殼白家系平均值相比提高11.87%—30.32%, 與對照組相比提高28.18%—49.31%; 存活率水平較家系均值和對照組提高了30%以上。因此, G11、G15和G35家系可以作為良種培育的備選育種材料。進一步對殼白長牡蠣幼體殼高和殼長的遺傳力進行了評估, 發(fā)現(xiàn)均屬于中高遺傳力, 有較大的遺傳改良潛力, 可以進行進一步的選育工作。本研究為培育生長性能優(yōu)良和存活率高的殼白長牡蠣品系提供了基礎(chǔ)材料。