于保旭 李鐵成

(錦州醫(yī)科大學附屬第三醫(yī)院,錦州121000)

隨著心臟介入手術(shù)的廣泛開展，在治療以急性心梗為代表的心血管疾病上取得了巨大進步，然而，再灌注損傷帶來的弊端也讓我們臨床工作者不容忽視[1]。硫唑嘌呤(Azathioprine,AZA)是臨床上常用的免疫抑制劑，其作用機制主要體現(xiàn)在阻礙嘌呤核苷生成。但是AZA在心肌缺血再灌注損傷是否也具有保護作用，其保護作用具體體現(xiàn)在哪一種機制上到目前為止尚無確切定論[2]。本研究以心肌缺血再灌注損傷為切入點，研究硫唑嘌呤預處理對MIRI大鼠模型的保護作用，探討硫唑嘌呤在心肌缺血再灌注損傷中的分子機制和其與TLR4信號通路之間的內(nèi)在聯(lián)系，為硫唑嘌呤的臨床療效提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 SPF級SD大鼠30只，12周齡、雄性、體質(zhì)量180～220 g，購自錦州醫(yī)科大學實驗動物中心。

1.1.2主要試劑 硫唑嘌呤(C9H7N7O2S，分子量277.27)購自上海意杰生物科技有限公司；MDA、SOD、MPO、TNF-α和IL-6試劑盒購自南京建成生物工程研究所；TLR4抗體及鼠單克隆抗β-actin購自武漢博士德公司；其他試劑由錦州醫(yī)科大學生命科學院實驗室提供。

1.2方法

1.2.1動物模型的建立 SD大鼠用3%戊巴比妥鈉以50 mg/kg劑量腹腔注射麻醉，固定四肢后安裝心電監(jiān)護儀，氣管插管并連接動物呼吸機(潮氣量為1.5 ml/100 g，頻率60次/min)，用針型電極記錄大鼠心電圖。之后切開大鼠皮膚：以胸骨中線為基準，起于胸鎖關(guān)節(jié)平線止于劍突上方。鈍性分離肌群，剪斷胸骨左緣處第2～4根肋骨，開胸器撐開，將心包剪開暴露心臟。分離左冠狀動脈前降支，用2/0-T號線在冠脈左前降支1～2 mm處穿線結(jié)扎[3]。各組(假手術(shù)組除外)用一凹形乳膠管墊在血管與結(jié)扎線之間，自心肌缺血在心電圖中顯示開始，30 min 后將結(jié)扎線順著凹形乳膠管剪掉，使心肌血流恢復，隨后保持120 min再灌注。結(jié)扎冠狀脈期間，以心電圖改變確定缺血再灌注造模成功[4]：冠狀動脈左前降支結(jié)扎，ST段明顯抬高；再灌注時，ST段抬高后回落，回落幅度不低于50%。

1.2.2實驗分組 將SD大鼠隨機分為模型組、硫唑嘌呤組和假手術(shù)組，每組10只。模型組(Model)：結(jié)扎30 min以上，保持120 min再灌注，且冠脈下穿線。硫唑嘌呤組(AzA)：硫唑嘌呤以3 mg/kg 劑量于手術(shù)前5 d每天灌胃給藥，5 d后的處理同模型組。假手術(shù)組(Sham)：保持不結(jié)扎狀態(tài)，且穿線位置設定為冠狀動脈左前降支1～2 mm 處。

1.2.3標本采集 造模完畢，大鼠麻醉并消毒后快速于頸總動脈處取血并摘除心臟。血液以3 000 r/min 離心10 min取上清于EP管中。

1.2.4實驗指標檢測

1.2.4.1心肌梗死面積測定 取心臟后，將右心室心肌和心房去除，預冷PBS清洗，-20℃ 20 min后取出心臟，按管狀結(jié)扎線下方與冠狀溝平行的方向?qū)⑿氖仪谐珊穸认嗟鹊?片，置于0.5%NBT溶液中，在37℃水浴中染色，PBS清洗，拍攝并分析。梗死區(qū)面積(%)=梗死區(qū)面積/全部心臟面積[5]。

1.2.4.2電鏡下心肌細胞超微觀察 標本送至錦州醫(yī)科大學實驗室由科研老師幫助完成。

1.2.4.3血液檢測 采用全自動生化分析儀檢測血清中CK-MB、cTnⅠ含量；試劑盒檢測SOD、MPO活力及MDA、TNF-α、IL-6水平。操作步驟按說明書進行。

1.2.4.4Western blot方法檢測心肌組織TLR4蛋白表達 心肌組織剪碎后，加入裂解液再用超聲波粉碎，4℃ 10 000 r/min離心20 min，取上清進行BSA定量。上清液100℃ 10 min蛋白變性，配制分離膠(12%)和濃縮膠(5%)。加樣15 μl，電壓調(diào)至80 V，電泳20 min，條帶剛跑過分離膠時調(diào)電壓至110 V，待所檢測條帶跑至適合的位置(根據(jù)marker判斷)停止電泳。120 mA恒流120 min轉(zhuǎn)膜，5%BSA封閉，室溫1 h，搖床。加1∶500 TLR4/1∶500 β-actin一抗稀釋液后，用自封袋壓膜，封好后4℃搖床過夜。加1∶5 000羊抗兔IgG二抗，室溫孵育1 h。ECL發(fā)光，8 bit存圖。Image J軟件分析。

1.2.4.5免疫組化法對TLR4定位 石蠟常規(guī)脫蠟透明；組織抗原修復：放入抗原修復儀中，內(nèi)含檸檬酸Ag修復液，94℃ 20 min，PBS沖洗 5 min/次×3次；3%H2O2室溫10 min，PBS沖洗5 min/次×3次；羊血清工作液室溫1 h；滴加一抗TLR4(1∶200)，4℃過夜；PBS沖洗5 min/次×3次；滴加PV9001二抗試劑(1)/(2)，37℃ 20 min，PBS沖洗5 min/次×3次；DAB顯色液約5～10 min，ddH2O洗滌5 min/次×3次；蘇木素復染5～7 min，流水沖洗 5 min，根據(jù)染色情況進行1%鹽酸酒精分化；酒精二甲苯透明后封片。Ipwin32軟件分析。

2 結(jié)果

2.1大鼠心肌梗死面積的測定 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠心肌梗死面積顯著增大(P<0.01)；與模型組比較，硫唑嘌呤組大鼠心肌梗死面積呈降低趨勢(P<0.01)。由此可見，在缺血再灌注條件下，經(jīng)硫唑嘌呤預處理，心肌遭受破壞的狀況明顯改善。見圖1、表1。

2.2心肌組織電鏡下改變 假手術(shù)組心肌間質(zhì)正常，細胞各結(jié)構(gòu)無水腫，電子分布較深且均勻，心肌纖維呈有序排列。模型組心肌細胞膜表面有致密電子陰影，細胞水腫嚴重，部分細胞器崩解，且心肌纖維呈無序斷裂狀。相較于模型組，硫唑嘌呤組心肌細胞水腫壞死狀況有所改善，細胞膜表面可見少量電子陰影，心肌纖維基本正常。見圖2。

圖1 三組大鼠心肌梗死面積Fig.1 Myocardial infarct size in three groups of rats

2.3血清CK-MB和cTnⅠ含量 與假手術(shù)組比較，模型組SD大鼠血清CM-MB及cTnⅠ水平呈增高趨勢(P<0.01)；與模型組比較，硫唑嘌呤組大鼠血清CK-MB及cTnⅠ水平呈降低趨勢(P<0.01)。見表2。

2.4SOD活性和MDA含量 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清SOD含量均降低且MDA水平上升(P<0.01)；與模型組比較，硫唑嘌呤組大鼠SOD水平升高而MDA降低(P<0.01)。見表3。

GroupsDosage(mg/kg)Infarctsize(%)Sham group-0.36±0.04Model group-32.98±4.681)AZA group3 15.13±2.142)

Note：1)P<0.01 vs sham group;2)P<0.01 vs model group.

圖2 電鏡下心肌超微結(jié)構(gòu)變化Fig.2 Ultrastructure changes of myocardium by electr-on microscopy

GroupsDosage(mg/kg)CK-MB(ng/ml)cTnⅠ(ng/ml)Sham group-27.41±3.703.62±0.51Model group-86.35±7.901)11.46±0.911)AZA group345.33±6.802) 5.52±0.742)

Note：1)P<0.01 vs sham group;2)P<0.01 vs model group.

GroupsDosage(mg/kg)SOD(U/ml)MDA(nmol/ml)Sham group-178.63±22.202.21±0.32Model group-131.32±17.301)3.54±0.421)AZA group3162.37±16.802) 2.80±0.292)

Note：1)P<0.01 vs sham group;2)P<0.01 vs model group.

2.5大鼠MPO含量 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清MPO水平顯著增高(P<0.01)；與模型組比較，硫唑嘌呤組大鼠MPO水平有一定程度的下調(diào)(P<0.01)。由此可知，硫唑嘌呤預處理方式可減輕由心肌缺血所致的心肌組織破壞程度。見表4。

2.6TNF-α和IL-6含量 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清TNF-α和IL-6水平均上升(P<0.01)；與模型組比較，硫唑嘌呤組大鼠TNF-α和IL-6水平呈降低趨勢(P<0.01)。見表5。

GroupsDosage(mg/kg)MPO(U/g protein)Sham group-5.83±0.75Model group-15.50±1.331)AZA group3 9.31±0.852)

Note：1)P<0.01 vs sham group;2)P<0.01 vs model group.

GroupsDosage(mg/kg)TNF-α(ng/L)IL-6(ng/L)Sham group-26.20±3.6170.20±8.47Model group-92.82±13.551)211.81±26.741)AZA group350.30±6.922) 139.62±23.762)

Note：1)P<0.01 vs sham group;2)P<0.01 vs model group.

圖3 心肌組織TLR4定位Fig.3 Location of TLR4 in myocardial tissue

圖4 心肌組織TLR4蛋白表達Fig.4 Expression of TLR4 in myocardial tissue

2.7大鼠心肌組織TLR4蛋白表達 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠TLR4蛋白顯著增高上調(diào)(P<0.01)；與模型組比較，硫唑嘌呤組大鼠TLR4蛋白呈降低趨勢(P<0.01)。見圖3、4。

3 討論

心肌缺血再灌注損傷的發(fā)病機制具有一定的復雜性，其病理生理因素涉及氧化應激、內(nèi)皮細胞功能紊亂、炎癥反應、細胞凋亡等多個環(huán)節(jié)[5]。丙二醛(MDA)是脂質(zhì)過氧化的主要產(chǎn)物，直接反映機體氧化應激程度，并間接體現(xiàn)氧自由基對組織的損傷水平。超氧化物酶(SOD)作為氧自由基清除酶，能夠清除氧自由基及脂質(zhì)過氧化物，緩解氧自由基誘導的組織損傷，并在一定程度上修復受損組織細胞[6]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，炎癥反應是導致心肌缺血再灌注損傷的主要環(huán)節(jié)，TLR4/NF-κBp65通路是細胞間信息交流的主要路徑，此通路活化能促進炎癥因子生成，加快缺血再灌注損傷的發(fā)展進程[7]。

本研究發(fā)現(xiàn)，硫唑嘌呤預處理能顯著降低血清中CK-MB、cTnⅠ活性及減小心肌梗死灶面積。由此可見，硫唑嘌呤能抑制心肌損傷所致的生物膜系統(tǒng)損傷，減少收縮蛋白cTnⅠ及肌細胞特有酶CK-MB從損傷的心肌內(nèi)部進入到血液中，客觀證實了硫唑嘌呤能有效改善心肌損傷情況。電鏡結(jié)果顯示模型組心肌纖維斷裂，分列紊亂，細胞腫脹壞死，嚴重者局灶性壞死，并有炎性細胞侵潤。硫唑嘌呤可使肌纖維排列趨于正常，降低炎性細胞侵潤程度，減輕細胞腫脹和壞死，提示硫唑嘌呤預處理可改善缺血再灌注損傷的心肌形態(tài)，對MIRI大鼠的心肌具有保護作用。

有研究表明心肌缺血再灌注損傷打破機體原有的氧自由基生成和清除的動態(tài)平衡，當機體血流供應恢復之后氧自由基大幅度生成導致細胞出現(xiàn)急、慢性損傷[8,9]。本實驗結(jié)果顯示，缺血再灌注損傷導致機體自由基水平升高同時清除能力下降，而硫唑嘌呤處理降低脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA水平，上調(diào)抗氧化物SOD活性，改善氧化應激水平，促進機體氧化-抗氧化平衡。同時硫唑嘌呤預處理使MPO含量下降，即氧化損傷明顯減輕，也說明了硫唑嘌呤可能通過減輕氧化應激，進而緩解心肌缺血再灌注損傷。

近年大量研究證實TLR4信號轉(zhuǎn)導通路是造成心肌缺血再灌注損傷的一項重要的信號途徑，其與氧自由基的形成有十分密切的聯(lián)系，同時還能夠激活中性粒細胞，加強缺血區(qū)域的炎癥反應強度[10,11]。本實驗發(fā)現(xiàn)，硫唑嘌呤預處理可以明顯降低由缺血再灌注導致的TLR4蛋白表達增加及細胞炎癥因子TNF-α、IL-6水平，進一步說明硫唑嘌呤預處理對缺血再灌注心肌炎癥反應有抑制作用。Chong等[12]研究采用野生型(C3H/HeN)小鼠和TLR4基因缺陷小鼠(C3H/Hej)建立心肌缺血再灌注損傷模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)C3H/Hej小鼠的炎癥反應強度低于C3H/HeN小鼠，同時心肌梗死灶面積也減少40%。Oyama等[13]采用相同的動物建立心肌缺血再灌注損傷模型，發(fā)現(xiàn)基因缺陷性小鼠心肌缺血梗死灶面積、補體沉積以及脂質(zhì)過氧化水平、中性粒細胞浸潤水平均明顯低于野生型小鼠。由此可見，TLR4參與心肌缺血再灌注損傷時中性粒細胞的聚集效應，促進缺血缺氧區(qū)域的炎癥反應，激活下游細胞因子發(fā)揮損傷效應。而硫唑嘌呤預處理可以明顯抑制缺血再灌注激活的TLR4通路，下調(diào)下游炎癥細胞因子TNF-α、IL-6表達，改善缺血再灌注引起的心肌炎癥反應，從而降低再灌注損傷。

綜上所述，硫唑嘌呤預處理通過下調(diào)TLR4信號通路，抑制心肌缺血再灌注導致的過度氧化應激反應及炎癥反應，促進氧化-抗氧化平衡，在一定程度上緩解缺血再灌注引起的心肌損傷進程，為心肌缺血再灌注損傷的臨床治療提供新思路。