劉照虎，曹 龍，馬梓承，王宏宇，孟凡亮，劉思當(dāng)，李寶全

（山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院臨床病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室，山東 泰安 271018）

1 診斷

1.1 發(fā)病背景

該豬場(chǎng)為1 000頭不同階段育肥豬豬場(chǎng)，在4月初相鄰的30日齡左右的育肥豬舍出現(xiàn)過豬瘟疫情的散發(fā)，采用豬瘟疫苗緊急免疫和藥物控制等措施兩周內(nèi)止住了疫情。從4月中下旬開始在50至70日齡的育肥豬舍出現(xiàn)了疫情，發(fā)病率和死亡率超過50%。發(fā)病情況：50日齡病豬病程7 d左右，病豬耳尖及肢體末端的皮膚有大面積的出血，氣喘呼吸困難，食欲減退消瘦腹瀉，藥物控制沒有明顯效果。豬場(chǎng)疫苗注射情況：2日齡豬偽狂犬病疫苗滴鼻，豬圓環(huán)疫苗14日齡首免，豬藍(lán)耳病疫苗21日齡首免，豬瘟疫苗28日齡首免，35日齡免疫口蹄疫疫苗，在60日齡時(shí)再加強(qiáng)免疫一次豬瘟疫苗，但是疫情未見減輕跡象。

1.2 剖檢病變

首先可見病豬耳部及臀部皮膚呈紅紫色，尤其是四肢末端及豬耳尖的皮膚部分存在大面積出血；剖開可以直觀從胸腔看到心耳密布出血點(diǎn)和心外膜有零散出血點(diǎn)分布，肺部表面有少量血斑存在；從腹腔可以看到脾臟淤血腫大且邊緣梗死有丘疹狀出血灶，腎臟為典型的 雀斑腎 密布針尖狀大小的出血點(diǎn)，結(jié)腸壁淋巴小結(jié)腫脹，漿膜和黏膜廣泛性出血，回盲瓣腫大充血和散布潰瘍?cè)?，膀胱里面積尿且膀胱壁上面存在大批出血灶；其他還有出現(xiàn)全身淋巴結(jié)出血腫大，切面大理石狀，扁桃體散落化膿灶等。解剖病變?nèi)鐖D1、圖2、圖3、圖4。

1.3 制定確診方案

從發(fā)病背景和剖檢病變及本實(shí)驗(yàn)室調(diào)查的山東地區(qū)豬瘟疫病流行情況上看，初診確定是豬瘟病毒感染。為了確診是豬瘟和解決該問題制定了以下方案：首先PCR檢測(cè)和病理組織學(xué)觀察確定病原，病原檢測(cè)檢測(cè)項(xiàng)目為CSFVPRV gEPCVPRRSV。然后對(duì)免疫二次豬瘟疫苗的豬群（健康豬和非健康豬各10頭）進(jìn)行抗體檢測(cè)以評(píng)價(jià)疫苗免疫效果，抗體檢測(cè)項(xiàng)目為CSFVPRV gEPRRSV，最后進(jìn)行綜合分析。

圖2 雀斑腎 腎臟上密布出血點(diǎn)

圖3 心耳及心外膜有出血點(diǎn)

圖4 全身淋巴結(jié)均見充血、出血、腫大

2 材料與方法

2.1 樣品來源

樣品來源與處理，2018年4月下旬，從山東省泰安市汶口地區(qū)1 000頭育肥豬的中小規(guī)模豬場(chǎng)（僅育肥），采集血樣20份和2份病料，血清分離6 000 r/min，離心5 min，病料取肝、肺、脾、腎、淋巴結(jié)等有眼觀病變的部位加入PBS后研磨,9 000 r/min，離心3 min，置于-20 ℃冰箱凍存待檢。血樣采集來源為加強(qiáng)免疫后的發(fā)病育肥豬群中健康狀況良好的和出現(xiàn)臨床癥狀的豬只各10頭。

2.2 主要儀器及試劑

DL 2 0 0 0 DNA M a r ke r、2hGC buffer、dNTP、rTaq 酶、ddH2O；Easy Pure Viral RNA/DNA Extraction kit；進(jìn)口 MEDIAN 公司豬瘟病毒、豬藍(lán)耳病毒、豬偽狂犬gE抗體檢測(cè)試劑盒，96孔血凝稀釋板，Eppendorf 移液器，酶標(biāo)儀等。

2.3 病原檢測(cè)

處理過的病料組織-80 ℃反復(fù)凍融3次，4 ℃離心機(jī)3 000 r/min高速離心，然后取上清使用杭州睿博興科DNA/RNA Extraction kit（批號(hào)：BSC67M1）提取病毒核酸。以提取的核酸作為模板，用豬圓環(huán)2型病毒、豬瘟病毒、豬偽狂犬病病毒gE基因、豬藍(lán)耳病病毒的鑒別引物進(jìn)行PT-PCR擴(kuò)增。將擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物置于1%的凝膠瓊脂中電泳，將電泳完的凝膠進(jìn)行照膠。

2.4 病理組織學(xué)檢查

將被剖檢豬只新鮮的組織器官如脾臟、腎臟、淋巴結(jié)、心臟等，分別取有明顯病變的厚度為硬幣大小的組織塊置于10%福爾馬林溶液中固定，沖水，過酒精，包埋，石蠟切片，HE染色，鏡檢。

2.5 抗體檢測(cè)

2.5.1 檢測(cè)方法

嚴(yán)格按照試劑盒內(nèi)所附說明書進(jìn)行操作，置于450 nm波長下讀數(shù)。

2.5.2 判定標(biāo)準(zhǔn)

PRRSV(豬藍(lán)耳病病毒）：陽性判定標(biāo)準(zhǔn)為S/P值大于等于0.4；陰性判定標(biāo)準(zhǔn)為S/P值小于0.4；PRV gE（豬偽狂犬病野毒）：陽性判定標(biāo)準(zhǔn)為S/N值大于等于0.6；陰性判定標(biāo)準(zhǔn)為S/P值小于0.6；CSFV（豬瘟病毒）：陽性判定標(biāo)準(zhǔn)為阻斷率大于40%；陰性判定標(biāo)準(zhǔn)為阻斷率小于40%。

3 結(jié)果與分析

3.1 病原檢查結(jié)果

用前面處理過的研磨液提取DNA/RNA后進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，結(jié)果為兩份病料只有豬瘟病毒出現(xiàn)陽性條帶，見圖5。

圖5 瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

3.2 病理組織學(xué)結(jié)果

鏡下觀察結(jié)果為肝臟有大量淋巴壞死和肝臟淋巴壞死有嗜中性粒細(xì)胞浸潤、腦有血栓和腦血管有 袖套 現(xiàn)象、心肌充血出血、 腎間質(zhì)充血出血、肝門淋巴結(jié)出血性壞死等出血壞死性病變，符合豬瘟鏡下病理變化特征。

3.3 抗體檢測(cè)結(jié)果

根據(jù)臨床表現(xiàn)將豬群分為非健康與健康(1號(hào)為非健康，2號(hào)為健康），對(duì)兩個(gè)群體分別進(jìn)行抗體檢測(cè)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表1。

統(tǒng)計(jì)結(jié)果可以得出健康豬群和非健康豬群的豬瘟抗體陽性率不高存在陰性豬只，抗體平均值只有40%多與國家的豬瘟免疫標(biāo)準(zhǔn)存在較大差距[2]。2個(gè)組的豬藍(lán)耳病抗體陽性率分別為90%和100%，平均值分別為1.18和1.46，離散度稍微偏高，完全符合國家豬藍(lán)耳病免疫標(biāo)準(zhǔn)。豬偽狂犬病陽性率為0，抗體平均值都在0.8以上，免疫效果很好，完全符合國家豬偽狂犬病免疫標(biāo)準(zhǔn)。說明豬瘟疫苗免疫操作或疫苗本身存在問題。

圖6 心肌充血出血 H E，×400

圖7 腎間質(zhì)充血出血 H E，×400

圖8 肝門淋巴結(jié)出血性壞死 H E，×400

圖9 肝臟有大量淋巴壞死 H E，×400

表1 3種抗體檢測(cè)統(tǒng)計(jì)表

4 結(jié)論

根據(jù)臨床表現(xiàn)、剖檢病變、病理組織學(xué)檢查及病原學(xué)檢查和血清學(xué)檢測(cè)，最后診斷確定為豬瘟病毒感染。病原學(xué)檢查豬瘟單一陽性，血清學(xué)檢測(cè)豬藍(lán)耳病和豬偽狂犬病抗體水平較好完全符合國家免疫標(biāo)準(zhǔn)。豬瘟疫苗免疫一般情況下，抗體水平達(dá)到較高水平可以為豬群提供足夠保護(hù)力[3]，但本豬群在豬瘟疫苗二次免疫兩周后的豬瘟抗體水平仍然較低，不能夠?yàn)樨i群提供應(yīng)有的保護(hù)，造成豬群大量感染豬瘟病毒，繼而出現(xiàn)高發(fā)病率、高死亡率?？梢酝茰y(cè)為豬瘟疫苗免疫效果不佳，另外也不能排除免疫抑制的情況。建議豬場(chǎng)將豬瘟疫苗送專業(yè)機(jī)構(gòu)進(jìn)行疫苗測(cè)評(píng)，同時(shí)可以將一小部分健康豬只緊急免疫另一種豬瘟疫苗，在飼料中添加恩諾沙星和維生素C等提高免疫力，加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，嚴(yán)格消毒，防止繼發(fā)感染其他病原。

豬瘟病毒、豬藍(lán)耳病病毒、豬偽狂犬病病毒和豬圓環(huán)病毒4類病毒目前仍是我國豬場(chǎng)最難應(yīng)對(duì)的病原，這4類病毒一但在豬場(chǎng)流行就會(huì)造成大規(guī)模的傷亡，尤其中小規(guī)模豬場(chǎng)缺乏技術(shù)指導(dǎo)，在豬場(chǎng)暴發(fā)大規(guī)模流行病時(shí)，往往出現(xiàn)應(yīng)對(duì)措施不足和找不到發(fā)病原因。所以本實(shí)驗(yàn)針對(duì)該類問題制定的診斷方案，通過3種檢測(cè)方法嚴(yán)格驗(yàn)證了該豬場(chǎng)感染了豬瘟病毒，并且將問題根源鎖定在免疫和疫苗方面。提供的診斷方案和解決措施也為出現(xiàn)該類情況的豬場(chǎng)提供了應(yīng)對(duì)措施方面的參考。