陳嘉飛，周武漢，王金桂

（福建省莆田市第一醫(yī)院 肝膽胰脾外科，福建 莆田 351100）

肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是常見的致死性腫瘤，據(jù)報道每年有約750000新發(fā)HCC病例，過去幾十年隨著診斷技術(shù)和手術(shù)的進(jìn)步，HCC患者的預(yù)后有一定提高，但5年生存率也僅有26%[1]。肝硬化及乙肝病毒導(dǎo)致的慢性炎癥是導(dǎo)致HCC發(fā)生的主要因素[2]。目前，大部分HCC患者在確診前已經(jīng)發(fā)展為遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，只有少部分患者具有有效的治療手段[3]。因此，研究HCC發(fā)生發(fā)展機(jī)制，尋找新的早期診斷和預(yù)后指標(biāo)仍是研究的重點。

輸出蛋白5（exportin 5，XPO5）是一類在大多數(shù)生物體內(nèi)非編碼小RNA前體（pre-miRNA）轉(zhuǎn)運受體所必須的受體蛋白，主要負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)運premiRNA從細(xì)胞核進(jìn)入到細(xì)胞質(zhì)[4-5]。據(jù)報道[6]，碳末端的突變引起XPO5蛋白失活導(dǎo)致包括結(jié)腸癌、胃癌和子宮內(nèi)膜癌中微衛(wèi)星不穩(wěn)定性。有研究[7-9]表明XPO5基因3'端非翻譯區(qū)的rs11077單核苷酸多態(tài)性會增加腎癌、結(jié)腸癌的患病風(fēng)險，并與非小細(xì)胞肺癌患者預(yù)后顯著相關(guān)。這些研究結(jié)果提示，XPO5基因可能參與調(diào)控腫瘤的發(fā)生發(fā)展。然而XPO5蛋白在HCC中的表達(dá)及其與臨床病理特征間的關(guān)系尚不清楚。本文通過研究XPO5蛋白在HCC組織中的表達(dá)，探討了XPO5蛋白表達(dá)與HCC患者臨床病理因素間的關(guān)系及對預(yù)后的影響。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源

收集2014年1月—2015年6月在我院手術(shù)切除的HCC患者標(biāo)本。納入標(biāo)準(zhǔn)：⑴ 具有詳細(xì)完整的臨床病例信息；⑵ 所有病例均由病理醫(yī)師確診為HCC；⑶ 術(shù)前未經(jīng)放化療；⑷ 所有患者均行切除術(shù)，且切緣為陰性。剔除標(biāo)準(zhǔn)：病例隨訪資料或臨床病例信息不全者。手術(shù)后通過電話或門診隨訪獲得腫瘤復(fù)發(fā)和總生存時間，隨訪到2018年6月截止，共得到HCC標(biāo)本92例。組織標(biāo)本經(jīng)手術(shù)切除后迅速分塊，部分經(jīng)過福爾馬林固定后包埋于石蠟中，一部分放入-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。采用液氮研磨法提取?biāo)本中蛋白行Western blot實驗。通過石蠟切片制作4 μm切片行免疫組化檢測XPO5蛋白在組織樣本中的表達(dá)。

1.2 主要試劑

總蛋白提取試劑RIPA裂解液、蛋白酶抑制劑、BCA蛋白濃度測定試劑盒、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒及電泳溶液、超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。GAPDH兔抗人單抗、XPO5兔抗人單抗、山羊抗兔HRP偶聯(lián)標(biāo)記的二抗均購于美國Cell Signaling Technology公司。免疫組化MaxVisionTM試劑盒購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。

1.3 Western blot檢測

-80 ℃冰箱凍存的組織標(biāo)本經(jīng)研磨后加入RIPA裂解液提取蛋白，采用BCA法測定蛋白濃度，取相同總量（30 μg）蛋白加入等體積2×電泳加樣緩沖液煮沸10 min。經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳分離后，濃縮膠50 min，分離膠1 h，轉(zhuǎn)印到PVDF膜。5%脫脂奶粉封閉30 min后，加入XPO5（1:300）或者GAPDH（1:300）一抗4 ℃孵育過夜，室溫下漂洗3次。37 ℃孵育辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的二抗1 h，漂洗3次后，采用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒顯影蛋白條帶。

1.4 免疫組化檢測

免疫組化實驗步驟按免疫組化試劑盒說明書步驟進(jìn)行。組織石蠟切片于67 ℃烘片2 h，經(jīng)二甲苯和梯度酒精脫蠟至水?？乖迯?fù)方法采用檸檬酸鹽緩沖液微波煮沸修復(fù)，自然冷卻后加入阻斷劑阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性，PBST清洗3次。3% BSA封閉1 h后直接滴加XPO5一抗稀釋液（1:300），4 ℃孵育過夜，漂洗3次。37 ℃孵育二抗1 h，PBST清洗3次。DAB顯色試劑顯色，當(dāng)目標(biāo)蛋白出現(xiàn)顯色且相對較弱時終止顯色。根據(jù)陽性細(xì)胞百分比及顯色深淺分級，表達(dá)強(qiáng)度用組織學(xué)評分（∑pi）表示：p代表同一染色強(qiáng)度細(xì)胞所占計數(shù)細(xì)胞百分?jǐn)?shù)（即陽性細(xì)胞百分率），無細(xì)胞顯色或陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)＜5%為0，5%～35%細(xì)胞顯色為1，36%～65%細(xì)胞顯色為2，＞66%細(xì)胞顯色為3；i代表細(xì)胞漿顯色深淺或染色強(qiáng)度，不顯色或顯色不清為0，淺黃色為1，棕黃色為2，深褐色為3。將所有HCC組織標(biāo)本按評分高低分為高表達(dá)組及低表達(dá)組，即評分總和≤3分為低表達(dá)組，＞3分為高表達(dá)組。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS20.0統(tǒng)計軟件，實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，統(tǒng)計處理采用獨立t檢驗對組間進(jìn)行比較；計數(shù)資料采用χ2檢驗。患者總生存率和無瘤生存率均采用Kaplan-Meier分析，單因素和多因素分析采用Cox回歸模型。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 Western blot檢測XPO5在HCC組織中的表達(dá)

Western blot檢測結(jié)果顯示，XPO5蛋白在HCC組織中的表達(dá)量均高于其對應(yīng)癌旁組織（圖1）。

圖1 Western blot檢測XPO5蛋白表達(dá) N：癌旁組織；T：HCC組織Figure1 XPO5 protein expression determined by Western blot N:Ajacent tissues; T:HCC tissue

2.2 免疫組化檢測XPO5在HCC組織中的表達(dá)

免疫組化示，正常肝組織中XPO5表達(dá)強(qiáng)度低，其完全定位在細(xì)胞質(zhì)中（圖2A）；在HCC組織中，XPO5整體表達(dá)高于正常組織。其中XPO5低表達(dá)組織其主要定位在細(xì)胞漿，少部分有細(xì)胞核表達(dá)（圖2B）；而在XPO5高表達(dá)組織，XPO5除了定位在細(xì)胞質(zhì)中，細(xì)胞核也出現(xiàn)表達(dá)（圖2C）。

圖2 免疫組化XPO5蛋白表達(dá)（×100） A：正常肝組織；B：HCC組織XPO5低表達(dá)；C：HCC組織XPO5高表達(dá)Figure2 Immunohistochemistry staining for XPO5 protein expression (×100) A:Normal liver tissue; B:HCC tissue with low XPO5 expression; C:HCC tissue with high XPO5 expression

2.3 XPO5蛋白表達(dá)水平與HCC臨床病理因素的關(guān)系

XPO5蛋白表達(dá)水平與患者性別、年齡、血清AFP水平、HbsAg及血管浸潤、腫瘤部位和血管浸潤無關(guān)（均P＞0.05），與腫瘤大小、分化程度、臨床分期、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及肝硬化有關(guān)（均P＜0.05）（表1）。

2.4 XPO5表達(dá)水平與HCC患者預(yù)后間的關(guān)系

XPO5低表達(dá)組1、5年無瘤生存率高于高表達(dá)組（78.5%vs.46.8%，37.4%vs.20.3%，均P＜0.01）；XPO5低表達(dá)組1、5年總生存率高于高表達(dá)組（91.2%vs.75.9%，58.8%vs.36.1%，均P＜0.01）（圖3）。

表1 XPO5表達(dá)與HCC患者臨床病理特征的關(guān)系[n（%）]Table1 Relations of XP05 expression with clinicopathologic features of HCC patients [n (%)]

圖3 不同XPO5表達(dá)水平HCC患者的生存曲線Figure3 The survival curves of HCC patients with different XPO5 expression levels

2.5 影響HCC患者無瘤生存及總生存的危險因素分析

單因素和多因素Cox風(fēng)險回歸模型分析示，血管浸潤（P=0.032）、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移（P=0.025）及X P O 5表達(dá)（P=0.036）均是影響H C C患者無瘤生存的獨立危險因素（表2）；臨床分期（P=0.012）、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移（P=0.028）及XPO5表達(dá)（P=0.013）是影響HCC患者總生存的獨立危險因素（表3）。

表2 單因素及多因素分析HCC患者無瘤生存期相關(guān)的危險因子Table2 Univariate and multivariate analysis of risk factors for disease-free survival in HCC patients

表3 單因素及多因素分析HCC患者總生存期相關(guān)的危險因子Table3 Univariate and multivariate analysis of risk factors for overall survival of HCC patients

3 討 論

HCC的發(fā)病存在明顯的地域差異，在東亞國家包括中國和南非發(fā)病率尤其高[10]。在過去幾十年，HCC手術(shù)切除后5年復(fù)發(fā)率高達(dá)50%～70%，導(dǎo)致HCC患者生存率仍很低[11-12]。

miRNA是一類非編碼蛋白質(zhì)的RNA，通過結(jié)合靶基因的mRNA導(dǎo)致其降解從而抑制基因表達(dá)[13-14]。miRNA的生物學(xué)合成過程涉及到多個步驟，包括由RNA聚合酶II對原miRNA（primiRNA）的轉(zhuǎn)錄，Drosha對pri-miRNA的剪切成pre-miRNA，再由XPO5將pre-miRNA由細(xì)胞核轉(zhuǎn)運到細(xì)胞質(zhì)中，經(jīng)過Dicer酶的加工形成成熟的miRNA發(fā)揮基因沉默功能[15]。XPO5屬于核轉(zhuǎn)運蛋白β家族成員，其主要功能是將pre-miRNA從細(xì)胞核轉(zhuǎn)運到細(xì)胞質(zhì)中；XPO5在多種底物的核漿運輸中發(fā)揮重要功能[5]。在細(xì)胞周期中，XPO5通過依賴于磷脂酰肌醇3-激酶轉(zhuǎn)錄后機(jī)制迅速提高細(xì)胞整體miRNA水平，抑制XPO5導(dǎo)致細(xì)胞增殖受抑制[16]。除了轉(zhuǎn)運pre-miRNA外，有研究[17-19]證明XPO5還涉及到一些RNA結(jié)合蛋白的轉(zhuǎn)運，比如Staufen同系物2、白介素增強(qiáng)結(jié)合因子3及核糖體60s亞基的運輸。Lee等[20]發(fā)現(xiàn)，當(dāng)XPO5功能異常后，相比于正常細(xì)胞系和組織，在腫瘤細(xì)胞系和組織中存在大量miRNA基因轉(zhuǎn)錄成pre-miRNA，但并不能形成成熟的miRNA。XPO5在腫瘤中異常表達(dá)也有報道，比如Chiosea等[21]發(fā)現(xiàn)XPO5在前列腺癌中高表達(dá)，Varambally等[22]也同樣發(fā)現(xiàn)XPO5高表達(dá)于前列腺癌組織中，并與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，XPO5在HCC組織中的表達(dá)顯著高于癌旁組織，這與之前在其他腫瘤中的報道[8-9]一致。然而，也有文獻(xiàn)[23]報道XPO5在支氣管肺泡癌中呈低表達(dá)狀態(tài)。這種在不同腫瘤中的表達(dá)差異可能跟腫瘤特異性有關(guān)。Shigeyasu等[24]也發(fā)現(xiàn)XPO5在結(jié)腸癌組織中表達(dá)量顯著升高，且XPO5高表達(dá)與患者惡性臨床病理特征和預(yù)后差顯著相關(guān)。本研究結(jié)合臨床病理特征分析也同樣發(fā)現(xiàn)，高表達(dá)XPO5的HCC患者與惡性臨床病理因素呈正相關(guān)。Cox風(fēng)險比例回歸模型單因素和多因素分析提示，XPO5可作為判斷HCC患者術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)和預(yù)后不良的獨立風(fēng)險因子。

Sun等[25]研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶的激活能夠磷酸化XPO5，磷酸化的XPO5其構(gòu)象發(fā)生改變，轉(zhuǎn)運pre-miRNA的能力下降，導(dǎo)致細(xì)胞整體miRNA的水平下降并促進(jìn)腫瘤發(fā)生。本研究僅限于XPO5表達(dá)與HCC患者臨床病理參數(shù)的關(guān)聯(lián)性研究，根據(jù)本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)XPO5在HCC中起到促進(jìn)腫瘤進(jìn)展的作用。結(jié)合之前的報道我們推測，在HCC中XPO5過表達(dá)的原因和可能的促癌功能有下幾點。首先，XPO5可能存在基因突變導(dǎo)致翻譯的蛋白功能喪失，HCC細(xì)胞會通過高表達(dá)該基因企圖來彌補(bǔ)這部分喪失的功能；其次，HCC細(xì)胞高表達(dá)XPO5導(dǎo)致合成轉(zhuǎn)運的促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展的miRNA更快的生物合成，加速腫瘤進(jìn)展。

綜上，XPO5在HCC組織中呈高表達(dá)，并與患者惡性病理特征及預(yù)后差相關(guān)。XPO5蛋白表達(dá)水平可作為判斷HCC患者術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)和不良預(yù)后的重要指標(biāo)，進(jìn)一步深入研究XPO5在HCC中的作用機(jī)制將有望為尋找新的治療靶點提供理論基礎(chǔ)。