何政，吳慧，鄭軍

（三峽大學第一臨床醫(yī)學院宜昌市中心人民醫(yī)院 肝膽胰外科，湖北 宜昌 443002）

原發(fā)性肝癌（primary hepatocellular carcinoma，PHC）是指由肝細胞或肝內(nèi)膽管上皮細胞發(fā)生的惡性腫瘤，其中肝細胞癌占85%以上，是我國第四位常見的惡性腫瘤，病死率位居第三[1]。肝細胞癌惡性程度高，易發(fā)生轉(zhuǎn)移，許多患者確診時已發(fā)展為晚期，5年生存率小于5%[2]。驅(qū)動蛋白超家族（kinesin superfamily proteins，KIFs）是一類分子馬達，通過水解ATP產(chǎn)生能量來進行細胞內(nèi)囊泡、細胞器、RNA等物質(zhì)的運輸[3-4]。驅(qū)動蛋白家族成員15（kinesin family member 15，KIF15）是該家族中的一員，屬于kinesin-12亞家族，又稱hklp2，是除Kinesin-5之外第二個四聚體紡錘體馬達[5-6]。已有研究[7-9]表明，KIF與乳腺癌、肺癌、胰腺癌的發(fā)生發(fā)展過程相關(guān)，然而其在肝癌中的研究尚未報道。本研究通過生物信息學分析KIF15與肝細胞癌的關(guān)系，并通過下調(diào)其表達探究其對肝細胞癌轉(zhuǎn)移侵襲能力的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞株與主要試劑

人肝癌細胞系SMMC-7721由華中科技大學附屬同濟醫(yī)院膽胰外科實驗室饋贈。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Gibco公司，siKIF15購自廣州銳博生物科技有限公司，Lipofectamine2000購自美國賽默飛公司，Transwell小室及六孔板購自美國Corning公司，KIF15、GAPDH抗體購自美國CST公司，CCK-8試劑購自日本Dojindo公司，Matrigel基質(zhì)膠購于美國BD公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 人肝癌細胞系SMMC-7721在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基、37 ℃、5%CO2的條件下，于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，根據(jù)細胞生長情況每2～3天更換新鮮培養(yǎng)基或進行細胞傳代培養(yǎng)。

1.2.2 生物信息學分析 從UCSC Xena網(wǎng)站下載TCGA Liver Cancer肝癌數(shù)據(jù)中KIF15的表達情況及相關(guān)臨床資料[10]?；虮磉_使用標準化高敏熒光序列進行分析，將標準化計數(shù)結(jié)果作為基因表達程度的估計值。分析得到不同TNM分期肝癌患者體內(nèi)KIF15的表達以及肝癌患者的生存曲線。

1.2.3 siRNA轉(zhuǎn)染 選取處于對數(shù)生長期的SMMC-7721細胞制備細胞懸液，取2×105個細胞接種于六孔板中，待細胞貼壁后按照lipofectamine 2000試劑說明書將siKIF15及siControl分別轉(zhuǎn)染入細胞中作為實驗組及對照組。Western blot檢測實驗組及對照組細胞中KIF15表達量。

1.2.4 CCK-8法檢測細胞增殖活性 分別取轉(zhuǎn)染了siKIF15的實驗組及轉(zhuǎn)染了siControl的對照組SMMC-7721細胞，調(diào)整細胞密度為2×104個/mL接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔100 μL，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞完全貼壁后吸去培養(yǎng)液，于貼壁0、24、48、72 h后每孔加入20 μL CCK-8，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，于酶標儀波長450 nm處讀取吸光度（OD）值。

1.2.5 流式細胞術(shù)檢測細胞周期 分別收集實驗組及對照組細胞，PBS洗滌后緩慢滴入預(yù)冷的無水乙醇，調(diào)整乙醇濃度至75%，充分振蕩，-20 ℃固定過夜。800r/min，5 min收集細胞，PBS洗滌后加入 50 μL RNase及 50 μL碘化丙啶（PI），室溫避光孵育30 min。流式細胞儀檢測細胞周期分布，采用CellQuest及ModFit軟件分析實驗結(jié)果。

1.2.6 Trasnwell侵襲實驗 Matrigel基質(zhì)膠用無血清培養(yǎng)基按1:8稀釋，加入小室上室面，4 ℃過夜。第2天于37 ℃ 30 min水化基底膜，同時制備轉(zhuǎn)染48 h后的SMMC-7721細胞懸液（用不含血清的培養(yǎng)基重懸），密度為2×105個/mL，每個小室中加入200 μL，下室加入含10%血清的培養(yǎng)基600 μL，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～36 h后用PBS洗兩遍，4%多聚甲醛固定30 min，0.1%結(jié)晶紫染色30 min，用棉簽擦去上室面細胞，晾干并拍照。

1.3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 23.0對實驗數(shù)據(jù)進行分析、整理。計量資料采用均數(shù)±標準差（±s）表示，兩組比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 KIF15在不同臨床資料分組的肝癌患者中的相對表達情況

通過分析得出，T2～T4分期的肝癌患者中K I F 15相對表達量明顯高于T1分期的患者[（-1.337±2.249）vs.（-1.863±1.924）；t=2.562，P＜0.05]；TNM分期在II～IV期的患者KIF15相對表達量明顯高于TNM分期為I期的患者[（-1.282±2.229）vs.( -1.839±1.921）；t=2.639，P＜0.01]（圖1）。KIF15表達量在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性組和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。

圖1 KIF15在不同臨床資料分組的肝癌患者中的表達比較Figure1 Comparison of KIF15 expressions between patients grouped by different clinical data

2.2 KIF15表達量對肝癌患者生存率的影響

通過繪制生存曲線并進行統(tǒng)計學分析得出，KIF15相對表達量≥-1.45的肝癌患者生存率明顯低于KIF15相對表達量＜-1.45的患者，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（圖2）。

2.3 Western blot檢測KIF15沉默效率

將構(gòu)建好的siKIF15轉(zhuǎn)染入SMMC-7721細胞系中，Western blot檢測轉(zhuǎn)染效率，結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染了siKIF15的細胞KIF15蛋白表達量明顯低于轉(zhuǎn)染siControl的對照組（圖3）。

2.4 沉默KIF15抑制了SMMC-7721的增殖

CCK-8結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染了siKIF15的實驗組SMMC-7721細胞增殖活性較對照組細胞有所降低。其中，實驗組細胞在96 h的吸光度為1.826±0.079，對照組為2.374±0.156，差異有統(tǒng)計學意義（t=3.124，P＜0.05）（圖4）。

圖2 不同KIF15表達量肝癌患者的生存曲線Figure2 Survival curves of liver cancer patients with different KIF15 expressions

圖3 Western blot檢測沉默效率Figure3 Silencing efficiency detection by Western blot

圖4 細胞增殖曲線Figure4 Cell proliferation curves

2.5 沉默KIF15使SMMC-7721阻滯在G0/G1期

流式細胞術(shù)結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染了siKIF 15的實驗組SMMC-7721細胞G1期比例高于對照組，差異具有統(tǒng)計學意義[（81.04±2.47）%vs.（64.98%±2.67）%，t=4.417，P＜0.05]；S期比例低于對照組，差異具有統(tǒng)計學意義[（13.35±2.16）%vs.（28.48±2.14）%，t=4.978，P＜0.01]；G2期比例無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）（圖5）。

圖5 細胞周期分析Figure5 cell cycle analysis

2.6 沉默KIF15降低了SMMC-7721的侵襲能力

Transwell實驗結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染了siKIF15的SMMC-7721細胞侵襲數(shù)目為（417±164）個，明顯低于對照組細胞侵襲數(shù)目（951±159）個，差異有統(tǒng)計學意義（t=4.679，P＜0.01）（圖6）。

圖6 細胞侵襲力檢測Figure6 Determination of invasion ability of the cells

3 討 論

近年來大量研究[11-13]表明，KIFs是一類保守的微管依賴的分子運動蛋白，具有ATP酶活性和運動特征，其與神經(jīng)退行性疾病、代謝性疾病、腎病等多種疾病均有關(guān)聯(lián)。除此之外，KIFs在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中也起到重要作用[14-17]。學者[18-20]認為，在腫瘤細胞進行分裂的過程中，異常表達的KIFs將通過影響染色體的凝集、紡錘體的形成發(fā)生異常，進而影響腫瘤細胞增殖和侵襲轉(zhuǎn)移能力。例如在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中，KIF1B通過誘導(dǎo)膜型基質(zhì)金屬蛋白酶促進膠質(zhì)瘤細胞的遷移和侵襲[21]。在沉默KIF2A后，乳腺癌細胞的增殖和遷移能力被明顯抑制，并且其與乳腺癌的預(yù)后密切相關(guān)[22]。而在肺癌細胞中，下調(diào)KIF23促進凋亡的發(fā)生，其被認為是肺癌患者潛在治療靶點[23]。肝細胞癌是一類惡性程度極高的腫瘤，KIFs對肝癌發(fā)生發(fā)展的作用尚不明確[24]。本研究著重分析TCGA數(shù)據(jù)庫中KIF15的表達與臨床資料的相關(guān)性，探究KIF15對肝癌惡性生物學行為的影響。

本研究首先通過TCGA Liver Cancer肝癌數(shù)據(jù)分析得出KIF15在TNM II～IV期患者的表達量明顯高于TNM I期患者，其中T分期為2～4期的患者KIF15表達量明顯高于T1期患者。而進一步通過繪制生存曲線并統(tǒng)計分析得出KIF15高表達的肝癌患者生存率明顯低于KIF15低表達患者，提示KIF15可以作為判斷肝癌預(yù)后的指標，即KIF15高表達患者臨床預(yù)后較差。在細胞實驗中，將siKIF15導(dǎo)入肝癌細胞并通過Western blot驗證了其沉默效率。CCK-8實驗表明沉默KIF15后肝癌細胞增殖能力明顯降低，進一步分析細胞周期發(fā)現(xiàn)沉默KIF15能夠?qū)⒏伟┘毎芷谧铚贕0/G1期，表明KIF15可以通過促進肝癌細胞的G1/S期轉(zhuǎn)化而加速其增殖。接下來本研究還探討了KIF15與肝癌細胞侵襲能力的關(guān)系，Transwell實驗表明，相比于對照組，沉默KIF15肝癌細胞侵襲能力明顯下降，表明KIF15在肝癌細胞的侵襲過程中發(fā)揮了一定的促進作用。在Eskova等[4]的研究中，KIF15介導(dǎo)網(wǎng)格蛋白Dab2在細胞內(nèi)的定位，調(diào)節(jié)整合素的內(nèi)化過程從而影響了細胞的侵襲能力。Wang等[25]也發(fā)現(xiàn)KIF15通過激活MEK-ERK通路加速了細胞的G1/S期轉(zhuǎn)化，促進了胰腺癌細胞的異常增殖。以上研究結(jié)果均提示KIF15在扮演了促進腫瘤進展的角色。

綜上所述，KIF15在肝癌的增殖和侵襲過程中發(fā)揮了一定的作用，并可以作為判斷肝癌患者預(yù)后的指標，有望成為肝癌早期診斷的標志物及化療的潛在靶點，但其促進肝癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移的具體機制還需進一步深入研究。