陳云茹，丹增措姆，白文東，李青，涂康生

（西安交通大學第一附屬醫(yī)院 1. 感染科 4. 肝膽外科，陜西 西安 710061；2. 西藏自治區(qū)人民醫(yī)院 婦產科，西藏 拉薩850000；3. 中國人民解放軍九四三五三部隊 衛(wèi)生隊，河南 商丘 476100）

肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是我國高發(fā)的惡性腫瘤，預后差，病死率高，對其研究一直是熱點[1]。對HCC患者早診斷、早治療及有效監(jiān)測是延長患者生存期的有效手段[2-3]。目前，僅有甲胎蛋白（AFP）是廣泛應用于臨床的監(jiān)測肝細胞癌預后的血清學指標，但對于AFP陰性的HCC患者不敏感，因此，尋找新的診斷指標及治療靶點具有重要意義[4-5]。脯氨酸、谷氨酰胺的剪接因子（splicing factor proline- and glutaminerich，SFPQ）是一種DNA及RNA結合的核蛋白，由707個氨基酸組成，分子量為72 kD，堿基序列中GC含量豐富，對DNA的修復、細胞凋亡、轉錄調控和RNA的轉運起到至關重要的作用[6-7]。近年來，對SFPQ的研究日益豐富，一些結果表明SFPQ的表達在一些癌組織低于正常組織[8]。然而，有趣的是，筆者對HCC組織的研究發(fā)現(xiàn)，SFPQ在HCC組織中呈高表達，為進一步探討SFPQ在HCC組織中的表達水平、臨床意義及其作用機制，本研究應用實時定量PCR法及Western blot法檢測了SFPQ在HCC及癌旁組織中的表達，并利用生物信息學分析其表達水平與HCC組織學分級、臨床分期及患者生存期的相關性[9-12]；同時通過小干擾RNA技術體外敲低SFPQ在HCC細胞株中的表達，明確SFPQ對HCC細胞增殖的影響及其可能機制。

1 材料與方法

1.1 病例資料

收集2016年1月—2016年12月西安交通大學第一附屬醫(yī)院肝膽外科手術切除的HCC及癌旁組織標本39例。所有標本的病理診斷均由3位以上高年資病理醫(yī)師進行診斷核對。每例患者術前均未接受任何抗腫瘤治療，采集癌組織及相應癌旁組織（距腫瘤邊緣2 cm）各200 g，立即置于液氮中保存。所取標本均經患者本人及家屬同意。

1.2 主要材料

HCC細胞HepG2及Hep3B均為本實驗室存儲。DMEM高糖培養(yǎng)液購自Hyclone公司；胎牛血清（FBS）購自Gibco公司；0.25%胰酶-EDTA，青霉素、鏈霉素溶液購自Hyclone公司；MTT試劑購自Abcam公司；反轉錄試劑盒、SYBR Premix EX Taq實時定量PCR試劑盒購自TaKaRa公司，TRIzol試劑、Lipofectamine 2000、無核酶水購自Invitrogen公司， SFPQ基因PCR引物（HPLC級制品）由TaKaRa公司設計、合成；SFPQ抗體購自Abcam公司，GAPDH抗體購自Sigma公司；二抗羊抗鼠IgG及羊抗兔購自Thermo Fisher Scientific公司；SFPQ siRNA購自GenePharma公司。

1.3 肝組織和肝細胞中SFPQ基因、蛋白的檢測

1.3.1 實時定量PCR檢測 將39例HCC及相應癌旁組織用于實時定量PCR檢測。用TRIzol試劑提取總RNA，參照反轉錄試劑盒說明合成cDNA。人SFPQ正向引物：5'-ATG TCT CGG GAT CGG TTC CGG A-3'， 反 向 引 物：5'-CCA ACA AAC AAC CGA CAT CGC TG-3'；GAPDH正向引物：5'-TGC ACC ACC AAC TGC TTA GC-3'，反向引物：5'-GGC ATG GAC TGT GGT CAT GAG-3'。參照SYBR Premix EX Taq實時熒光定量PCR試劑盒使用說明，應用ABI-PCR儀行實時PCR反應，每個模板設3個復孔，取平均CT值，以2-ΔCT（ΔCT=CTSFPQ-CTβ-actin）表示SFPQ基因的相對表達量。

1.3.2 Western blot檢測 將6份HCC及癌旁組織用于Western blot檢測。RIPA裂解液提取上述各組織和細胞中的總蛋白，BCA法分別測其濃度，加2×上樣緩沖液后100 ℃ 5 min煮沸。行SDS-PAGE后，濕轉至硝酸纖維素膜，將膜用5%脫脂奶粉封閉2 h，加入SFPQ一抗（1:1000，Abcam）、GAPDH一 抗（1:10000，Sigma） 于4 ℃共同孵育過夜，加入二抗（羊抗鼠抗體，1:1000和羊抗兔抗體1:1000，Thermo Fisher Scientific公司）室溫孵育1 h，ECL增強發(fā)光，應用凝膠成像儀（Amersham? Imager 600）拍照。

1.4 SFPQ基因在組織中的表達分析

從R2一個基因分析和可視化平臺（http://r2.amc.nl）下載2個不同的G E O數據集（GSE45436和GSE54236），GSE45436數據包含39例正常組織及95例HCC組織，GSE54236包含80例正常組織及81例HCC組織，比較不同組織中SFPQ mRNA的表達情況。

1.5 SFPQ基因在HCC中的表達及生存期分析

從R2網站下載GEO數據庫GSE6764，比較早期HCC及晚期HCC組織中SFPQ基因的表達差異；同時獲得TCGA數據庫中的366例HCC樣本，提取臨床分期、組織學分級及患者的生存期等資料，根據臨床分期及組織學分級，比較SFPQ的表達水平；應用survival選項分析360例樣本中SFPQ表達與生存時間的 Kaplan Meier關系圖。

1.6 SFPQ基因與增殖及細胞周期基因的相關性

從R2網站下載TCGA數據庫中的371例HCC標本的基因芯片數據，比較SFPQ與增殖相關基因PCNA和Ki-67的相關性，以及與細胞周期相關基因CCNE1和CDK2的相關性。

1.7 細胞基因干擾

SFPQ的小干擾RNA（siRNA）、陰性對照siRNA由GenePharma公司設計、合成。特異性SFPQ-siRNA正義鏈：5'-GAC GAC AGG AAG AAU UAA GTT-3'。陰性對照siRNA正義鏈：5'-CCU ACG CCA CCA AUU UCG U-3'。HepG2及Hep3B細胞接種于10%FBS的DMEM培養(yǎng)基中，37 ℃、50 mL/L CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，至對數生長期用于實驗。細胞鋪于6孔板中，待細胞長 至70%密度時根據Lipofectamine 2000說明書轉染等量的對照SFPQ和SFPQ siRNA，6 h后換成2% FBS 培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h后檢測蛋白 SFPQ的表達。

1.8 細胞增殖與細胞周期的測定

1.8.1 細胞增殖測定 將HCC細胞以3000/100 μL的密度接種于96孔板，設3個分組（空白組、干擾組、對照組），每組設8個復孔。采用MTT法連續(xù)3 d檢測各組細胞的光密度（D450）值。以D450值為縱坐標、時間為橫坐標繪制細胞生長曲線圖。

1.8.2 平板克隆形成實驗法檢測細胞增殖能力將對數生長期的轉染后HepG2及Hep3B細胞用胰蛋白酶消化制備細胞懸液，調整細胞密度，接種到6孔板中，每組細胞接種3個孔，500個/孔，輕輕晃動6孔板使細胞分散均勻，于37 ℃、50 mL/L CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)約10 d，出現(xiàn)肉眼可見的克隆，棄去培養(yǎng)液，PBS小心沖洗細胞2次，甲醛固定15 min，0.4%結晶紫染色10 min，流水緩慢洗去染色液，空氣干燥，鏡下計數＞50個細胞的克隆數，并按公式計算克隆形成率：克隆形成率=（克隆數/接種細胞數）×100%。

1.8.3 流式細胞術分析細胞周期 用0.25%胰酶消化并收集轉染后的細胞，用PBS洗滌細胞1次，2000r/min，5 min離心，棄上清，取細胞沉淀，加500 μL的700 mL/L乙醇固定細胞，室溫放置3 h。PBS洗滌細胞，2000r/min，5 min離心，棄上清，每 管 加 100 μL的 RNaseA，37 ℃ 水 浴 30 min，再加入400 μL的PI染色混勻，4 ℃，避光放置30 min。上流式檢測，記錄激發(fā)波長488 nm處紅色熒光，實驗重復3次，進行統(tǒng)計學分析處理。

1.9 統(tǒng)計學處理

實驗結果采用GraphPad Prism 6.0軟件進行統(tǒng)計學處理。組間比較采用Dunnet-t檢驗；采用雙側性檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 SFPQ在人HCC組織中的表達變化

實時定量P C R結果顯示，39例H C C組織中S F P Q的表達明顯高于相應的癌旁組織[（8.302±0.740）vs.(7.833±0.782），P=0.0081]，Western blot結果顯示，6例HCC組織中SFPQ蛋白水平均明顯高于相應的癌旁組織[（0.6±0.06）vs.(1.06±0.11)，P=0.0224]（圖1A）。利用TCGA數據庫檢索到50例正常組織及371例HCC組織，SFPQ mRNA的表達豐度在正常肝組織明顯低于HCC組織，GEO數據庫檢索到的數據集（GSE45436和GSE54236）顯示，SFPQ在HCC組織中的mRNA水平亦明顯高于正常肝組織（P=0.0064、0.0011）（圖1B）。

2.2 SFPQ表達與臨床分期、病理分級及生存率的關系

基于GEO和TCGA數據庫分析SFPQ表達與HCC臨床分期、病理分級、TNM分期以及患者預后的關系。結果顯示：進展期HCC組織中SFPQ mRNA水平明顯高于早期HCC組織（P＜0.0001）；SFPQ mRNA水平在高病理分級（G3+G4）HCC組織中表達水平明顯高于低病理分級（G1+G2）HCC組織（P＜0.0001）；SFPQ mRNA水平在高TNM分期（III+IV）HCC組織中表達水平明顯高于低TNM分期（I+II）HCC組織（P=0.0090）；生存期分析顯示，SFPQ低表達組患者的總生存時間明顯高于SFPQ高表達組（P＜0.0001）（圖2）。

2.3 SFPQ基因與其他細胞增殖基因的相關性

下載TCGA數據庫中371例HCC組織基因芯片數據，比較SFPQ 與增殖基因及細胞周期基因的相關性，結果顯示：SFPQ與增殖基因PCNA和Ki-67及細胞周期相關基因CCNE1和CDK2的表達均具有強的正相關性（r=0.486、0.553、0.443、0.523，均P＜0.05）（圖3）。

圖2 SFPQ表達與HCC患者臨床分期、病理分級及生存率的關系Figure2 Relations of SFPQ expression with clinical stage, histopathological grade and survival rate of the HCC patients

圖3 SFPQ表達與增殖基因及細胞周期蛋白的相關性分析Figure3 Correlation analysis of SFPQ expression with proliferation genes and cell cycle proteins

2.4 干擾效果驗證

使用Lipofectamine 2000瞬時轉染SFPQ siRNA至HepG2及Hep3B細胞中，轉染48 h后采用Western blot驗證了對照組與干擾組HepG2及Hep3B細胞中SFPQ蛋白的表達情況。結果顯示，采用siRNA成功干擾了HepG2及Hep3B細胞中SFPQ的表達（圖4）。

圖4 Western blot檢測siRNA轉染后SFPQ的表達Figure4 Western blot analysis of SFPQ expressions after siRNA transfection

2.5 干擾SFPQ表達對HCC細胞增殖的影響

采用MTT法檢測細胞生長曲線，結果顯示，干擾SFPQ的表達后，隨著時間的延長，與對照組相比，HepG2及Hep3B細胞的生長明顯受到抑制，與對照組差異有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）（圖5）。

圖5 細胞增殖曲線Figure5 Proliferation curves

2.6 平板克隆形成實驗法檢測細胞增殖能力

通過平板克隆形成實驗法，并采用Image J軟件掃描克隆點大小，重復3次，統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，轉染siRNA組HepG2及Hep3B細胞克隆形成數與對照組相比明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義（t=14.22，P＜0.01；t=10.92，P＜0.01）（圖6）。

2.7 流式細胞術檢測細胞周期結果

轉染siRNA組HepG2及Hep3B的G1期細胞比例增多、S期細胞比例減少，與對照組相比差異有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）（圖7）。

圖6 平板克隆實驗檢測細胞增殖能力Figure6 Plate clone formation assay for cell proliferative ability

圖7 流式細胞術檢測細胞周期Figure7 Cell cycle analysis by flow cytometry

3 討 論

SFPQ是一種分布廣泛的核蛋白，存在DNA結合域和RNA 結合域[13]。其可與許多基因啟動子的dsDNA相結合而影響基因的轉錄調節(jié)。同時，SFPQ可直接定位于受損DNA位點并與之結合，參與DNA修復，亦可與某些基因的長鏈非編碼RNA（lncRNA）結合，參與腫瘤的形成及轉移[14-17]。因此，近年來，SFPQ的研究越來越受到重視。有學者[18]應用蛋白組學技術比較了人惡性腫瘤細胞株（人肉瘤細胞株RD，U-2 OS和SK-UT-1B）、非惡性細胞株（人腎腺瘤細胞株A-498，769-P和OKP-GS）及兩株前列腺癌細胞株（DU-145和PC-3）中SFPQ的表達，發(fā)現(xiàn)在所有惡性細胞株中，SFPQ均為高表達，但非惡性細胞中，均未見SFPQ的表達。此外，有研究[19]表明，SFPQ主要通過參與PPARγ的細胞增殖、腫瘤生長的信號通路影響細胞凋亡，從而調節(jié)結腸癌細胞的生長和存活?？紤]到SFPQ在腫瘤細胞中似乎具有促進增殖的作用，且目前在HCC中SFPQ的表達以及細胞學影響等方面的研究較少，為此，本研究應用分子生物學技術及生物信息學初步探索了SFPQ與HCC的相關性。

本研究首先應用實時定量PCR法檢測了39對HCC組織及癌旁組織的SFPQ mRNA水平，應用Western blot法檢測了6對HCC組織及癌旁組織的SFPQ蛋白水平，發(fā)現(xiàn)在人HCC組織中的SFPQ基因表達明顯高于癌旁組織，這與莊雄標等[20]的研究結果相符合。此外，本研究通過數據庫調取了100余例HCC患者數據，通過統(tǒng)計學分析發(fā)現(xiàn)，SFPQ基因在HCC組織中均高于正常組織及肝硬化組織，與本研究的臨床標本數據相符，提示HCC組織中存在SFPQ的高表達。為進一步研究SFPQ基因與HCC嚴重程度及預后的相關性，根據HCC的臨床分期和組織病理學分級，應用TCGA數據庫，分別比較了早期HCC和晚期HCC、（G1+G2）級和（G3+G4）級以及（I+II）期和（III+IV）期患者數據，同時進行了HCC組織中SFPQ mRNA的表達水平及患者生存率的相關性分析，結果提示，SFPQ基因表達與HCC的嚴重程度成正相關，與患者生存率負相關，提示SFPQ基因參與了HCC的形成及發(fā)展。

為明確SFPQ基因調控HCC的機制，我們選取增殖細胞核抗原PCNA及Ki-67，細胞周期蛋白CCNE1及CDK2，通過TCGA數據庫調取HCC患者基因芯片數據，相關性分析顯示SFPQ基因與PCNA、Ki-67，CCNE1及CDK2均具有正相關性，提示SFPQ基因可能通過調控細胞周期及增殖活性發(fā)揮促癌作用[21-24]。為此，本研究利用siRNA敲低HepG2及Hep3BHCC細胞SFPQ的表達，發(fā)現(xiàn)細胞增殖及有絲分裂均受到抑制，說明SFPQ基因可以通過調控細胞周期促進HCC細胞的生長，下一步需要更深入的探索SFPQ基因調控細胞周期及增殖的信號通路，為后期SFPQ基因的臨床應用奠定基礎。

綜上所述，我們的研究發(fā)現(xiàn)，SFPQ基因可能通過促進HCC細胞的有絲分裂導致其增殖加快，促進HCC的發(fā)生發(fā)展，可能成為HCC的治療靶點及預后指標。

（本文編輯 宋濤）