劉媛媛，姜永瑋，楊 輝，叢 笑，曹永彤

（1.中日友好臨床醫(yī)學(xué)研究所，北京 100029；2.中日友好醫(yī)院 檢驗(yàn)科，北京 100029）

據(jù)國(guó)際糖尿病聯(lián)盟（IDF）統(tǒng)計(jì)，中國(guó)2017年糖尿?。╠iabetes mellitus，DM）的患病人數(shù)為1.14億，到2045年將達(dá)到1.2億[1]。糖尿病腎病（diabetic kidney disease，DKD）作為糖尿病最嚴(yán)重的慢性并發(fā)癥之一，其患病率也逐年上升，男性的發(fā)病率高于女性[2]。ACE與ACE2表達(dá)失調(diào)被認(rèn)為可能與DKD的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。ACE2基因位于X染色體，相關(guān)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)ACE2缺乏對(duì)不同性別的糖尿病小鼠模型會(huì)產(chǎn)生不同的影響，ACE2基因敲除的雄性小鼠可出現(xiàn)血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）介導(dǎo)的腎小球損傷[3]。目前對(duì)于ACE2基因多態(tài)性的研究較少，本文旨在研究ACE2基因rs2285666多態(tài)與不同性別的2型糖尿?。═2DM）患者并發(fā)DKD的關(guān)系。

1 對(duì)象和方法

1.1 研究對(duì)象

選擇2016年6月～2018年3月中日友好醫(yī)院收治的T2DM患者，年齡在62.3±11歲。T2DM的診斷分型參照1999年世界衛(wèi)生組織（WHO）修訂的糖尿病診斷及分型標(biāo)準(zhǔn)，同時(shí)排除近期內(nèi)用過(guò)腎毒性藥物、妊娠、腫瘤、尿路感染、心力衰竭、活動(dòng)性結(jié)核、精神病等疾病。根據(jù)2014年中華醫(yī)學(xué)會(huì)糖尿病學(xué)分會(huì)（CDS）微血管并發(fā)癥學(xué)組工作建議，將符合以下條件的納入 DKD（+）組：（1）大量白蛋白尿 （診斷標(biāo)準(zhǔn)：ACR＞300，3-6個(gè)月內(nèi)復(fù)查，3次結(jié)果中至少2次查過(guò)臨界值，并排除影響因素如24h內(nèi)劇烈運(yùn)動(dòng)、感染、發(fā)熱、明顯高血糖）；（2）糖尿病視網(wǎng)膜病變合并慢性腎臟病[慢性腎臟病診斷標(biāo)準(zhǔn)：GFR＜60ml/（min·1.73m2），且至少滿足1條腎臟受損標(biāo)志：UACR≥30；尿沉渣異常；腎小管相關(guān)疾病；組織學(xué)異常；影像學(xué)所見(jiàn)結(jié)構(gòu)異常；腎移植病史]；（3）滿足以上任1條并排除其他疾病引起的蛋白尿及腎功能不全：出現(xiàn)腎損傷但不伴糖尿病視網(wǎng)膜病變；蛋白尿急劇增多或腎病綜合征；頑固性高血壓；出現(xiàn)尿活動(dòng)性沉渣等。符合以下條件的納入DKD（-）組：滿足T2DM病程≥10年，且 UACR＜30。

以上全部研究對(duì)象均來(lái)自中國(guó)漢族人群，且無(wú)血緣關(guān)系。本研究通過(guò)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批號(hào)：2016-59），所有研究對(duì)象均簽署臨床研究知情同意書(shū)，入選575例研究對(duì)象，排除32例（包括符合以上排除標(biāo)準(zhǔn)者28例，失訪者4例），共計(jì)納入543例：其中 DKD（+）組 271例，包括男性 145例和女性 126例；DKD（-）組 272例，包括男性134例和女性138例。

1.2 研究方法

1.2.1 臨床及生化指標(biāo)

通過(guò)查詢病歷系統(tǒng)收集患者年齡、性別、身高、體重、體質(zhì)指數(shù)（BMI）、血壓、吸煙史及視網(wǎng)膜病變史等臨床資料。檢索檢驗(yàn)科數(shù)據(jù)庫(kù)收集患者外周血總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白（HDL-C）、低密度脂蛋白（LDL-C）、血肌酐（Scr）、腎小球?yàn)V過(guò)率（eGFR）、內(nèi)生肌酐清除率（Ccr）、尿素（Urea）以及尿 UACR 等檢測(cè)結(jié)果。 以上生化項(xiàng)目由Beckman Coulter AU5800全自動(dòng)生化分析儀（美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司）進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.2 引物設(shè)計(jì)及合成

采集患者空腹外周靜脈血1ml，應(yīng)用全血基因組DNA快速提取試劑盒（廣州美基生物科技有限公司）提取基因組DNA。根據(jù)genbank上ACE2的基因序列，采用引物設(shè)計(jì)軟件primer5設(shè)計(jì)引物， 上游引物 F：5’-TACAATGAGCACCATCTACAGT-3’，下游引物 R：5’-TACAATGAGCACCATCTACAGT-3’。由北京擎科生物公司合成。

1.2.3 PCR-HRM

儀器采用Roche Light Cycler 480實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀 （瑞士羅氏公司）；試劑采用Light CyclerR480 High Resolution Melting Master，Version 07（德國(guó)羅氏公司）。優(yōu)化反應(yīng)條件確定反應(yīng)體系：總體積為 20μl，包含 Master Mix（2×）10μl，MgCl2（25 mmol/L）2μl，上、下游引物（10μmol/L）各 0.5μl，DNA 模板（10ng/μl）5μl，滅菌超純水 2μl補(bǔ)足體系。在Light CyclerR480實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上設(shè)置PCR-HRM反應(yīng)程序如下：①95℃預(yù)變性10min。②40個(gè)循環(huán)的熒光定量Touchdown PCR 程序如下：95℃變性 10s，60℃退火 15s，72℃延伸15s，每次延伸完成后獲取1次熒光信號(hào)。③HRM程序如下：95℃變性1min，40℃退火1min，65℃～97℃上升 0.02℃/s，每上升 1℃獲取 25個(gè)信號(hào)，獲得溶解曲線。④40℃冷卻30s完成實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 目的基因測(cè)序分析

①PCR擴(kuò)增：PCR體系為50 μl，其中包括反應(yīng)混合物Mix（包含Taq DNA聚合酶、dNTPs、Mgcl2、反應(yīng)緩沖液）25μl，引物混合物 4 l，DNA 樣本8μl，滅菌超純水補(bǔ)足體系。采用TC-C1000 Touch熱循環(huán)儀（美國(guó)Bio-Rad公司）進(jìn)行擴(kuò)增，熱循環(huán)參數(shù)為：預(yù)變性95℃ 2min；再按下列程序循環(huán)30次，即 95℃變性 30s，60℃退火 30s，72℃延伸 30s；末次循環(huán)后，72℃延伸5min。擴(kuò)增產(chǎn)物送北京擎科生物公司進(jìn)行測(cè)序。②序列比對(duì)：將獲得的基因序列在PubMed網(wǎng)站的BLAST中進(jìn)行序列比對(duì)，結(jié)合HRM結(jié)果做出最終判斷，以此作為陽(yáng)性對(duì)照進(jìn)行分型。

表1 DKD（-）組與 DKD（+）組臨床資料比較

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

研究數(shù)據(jù)采用SPSS17.0軟件進(jìn)行分析。DKD（+）組和 DKD（-）組 ACE 基因 rs2285666 多態(tài)性基因型分布，采用Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)，采用直接計(jì)數(shù)法計(jì)算各組ACE基因rs2285666多態(tài)性的基因型和等位基因頻率，計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)。對(duì)于符合正態(tài)分布的計(jì)量資料組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；非正態(tài)分布的計(jì)量資料組間比較采用Mann-Whiteney U檢驗(yàn)。各組不同基因型受試者的計(jì)量資料比較，采用單因素方差分析。多因素分析采用非條件Logisitic回歸分析。

2 結(jié)果

2．1 受試者相關(guān)臨床資料比較

DKD（+）組與 DKD（-）組及 2 種基因型的一般臨床資料見(jiàn)表1，2組男性患者臨床資料比較，年齡、BMI DBP、TC、TG、HDL-C、LDL-C、HCY 差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。 DKD（+）組病程、吸煙比例、SBP、HbA1c、Scr水平高于 DKD （-） 組，eGFR、Ccr低于 DKD（-）組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。女性患者中，病程、吸煙比例、SBP、HbA1c、Scr、HCY 高于 DKD （-） 組，eGFR 低于DKD（-）組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其余資料差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.2 2組受試者ACE基因rs2285666多態(tài)性基因型及等位基因頻率比較

本研究女性受試者的ACE2基因rs2285666多態(tài)性分布，均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律 （P＞0.05）。DNA樣品經(jīng)HRM分析結(jié)果見(jiàn)圖1（封三）。抽樣測(cè)序分析結(jié)果見(jiàn)圖2（封三）。2種方法分型結(jié)果保持一致。2組受試者等位基因頻率的比較見(jiàn)表2。男性患者中，DKD（+）組G基因頻率顯著高于 DKD （-） 組 （53.1%比 37.3%，P＜0.01）。 女性患者中，DKD（+）組 GG基因型高于DKD（-）組（28.6%比 15.9%，P＜0.05）。

圖1 DNA樣品HRM分析結(jié)果

圖2 ACE2 G8790A測(cè)序分析結(jié)果

2.3 rs2285666基因分型和DKD的相關(guān)性

使用2種統(tǒng)計(jì)模型，分別是未校正和校正了病程、 吸煙、SBP、HbA1c、Ccr、eGFR 和 HCY 的影響。表3示，ACE2 G8790A變異增加了DKD風(fēng)險(xiǎn)，其中女性患者在加性遺傳模型在DKD（+）和DKD（-）組中的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（校正后OR=1.56，95%CI=1.03～2.37，P＜0.05）。相對(duì)于 AA 和GA基因型，GG基因型在加性遺傳模型中均顯著提升了DKD的患病風(fēng)險(xiǎn)（P＜0.05）。而男性患者中攜帶G等位基因進(jìn)展為DKD的風(fēng)險(xiǎn)顯著高于A等位基因（校正后 OR=1.97，95%CI=1.15～3.37，P＜0.05）。

表2 DKD（+）組和 DKD（-）組患者ACE基因型和等位基因頻率比較 n（%）

表3 T2DM并發(fā)DKD相關(guān)因素的Logistic回歸分析

3 討論

DKD是T2DM最主要、最嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥之一，在發(fā)達(dá)國(guó)家30%～40%的糖尿病患者并發(fā)DKD，是導(dǎo)致終末期腎臟?。╡nd stage renal disease，ESRD）的首要原因[4]。 在中國(guó)，T2DM 并發(fā)DKD是導(dǎo)致ESRD的第二位病因（16.4%）[5]。DKD的發(fā)病機(jī)制尚未明確，主要認(rèn)為是遺傳因素與環(huán)境因素共同作用的結(jié)果。腎素-血管緊張素系統(tǒng)（renin-angiotensin system，RAS）被認(rèn)為可以通過(guò)改變腎臟血流動(dòng)力學(xué)、參與氧化應(yīng)激等多種途徑參與DKD的發(fā)生與進(jìn)展，相關(guān)研究表明DKD患者的腎臟RAS的代償水平存在性別差異[6]。血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2（angiotensin converting enzyme 2，ACE2）是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的RAS系統(tǒng)的新成員，是2000年由Donoghue等[7]從心衰患者心室組織的cDNA文庫(kù)中克隆出一種新的ACE同源物。ACE2基因定位于Xp22，包含18個(gè)外顯子，該基因的突變可能通過(guò)影響性激素而間接影響RAS的表達(dá)，從而引起不同性別的DM患者進(jìn)展為DKD的風(fēng)險(xiǎn)存在差異。Clotet等[8]的實(shí)驗(yàn)表明ACE2基因敲除的雄性小鼠可出現(xiàn)腎ACE水平和活性增高，而雌性小鼠無(wú)差異。ACE2可對(duì)抗ACE與AngⅡ，促進(jìn)Ang-（1-7）的生成，發(fā)揮舒張血管、抗組織纖維化、抗增殖和利尿等作用。在腎臟，局部?jī)?nèi)皮細(xì)胞和腎小管上皮細(xì)胞ACE2活性增高，可調(diào)節(jié)腎血流分布、水電解質(zhì)的平衡，從而在維持血壓穩(wěn)定的同時(shí)保護(hù)腎功能。

既往通過(guò)對(duì)ACE2基因測(cè)序檢出G8790A（rs2285666）多態(tài)位點(diǎn)，即第3個(gè)內(nèi)含子第4個(gè)堿基存在G—A突變，該位點(diǎn)的變異可以改變mRNA的剪接，可能對(duì)基因的功能產(chǎn)生影響，因此可能與疾病遺傳易感性有關(guān)，已有的研究表明該位點(diǎn)多態(tài)性與高血壓伴心功能不全有關(guān)。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)于ACE2基因rs2285666多態(tài)性與DKD的關(guān)系的研究較少，且結(jié)果并不一致，可能與種族差異、研究方法不同有關(guān)。既往有關(guān)ACE2基因G8790A多態(tài)性的研究，多采用PCR-RFLP技術(shù)，技術(shù)操作繁瑣，易造成污染出現(xiàn)假陽(yáng)性，且結(jié)果可能出現(xiàn)拖帶影響判讀，影響結(jié)果的準(zhǔn)確性，故有待于進(jìn)一步改進(jìn)。本研究采用目前檢測(cè)SNP較為新型的HRM法，同時(shí)隨機(jī)抽取30例樣本進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，兩種方法的檢測(cè)結(jié)果保持一致，表明應(yīng)用HRM技術(shù)檢測(cè)ACE2基因G8790A多態(tài)性是可行的。HRM技術(shù)的原理是在PCR擴(kuò)增前在體系中加入飽和熒光染料，該熒光染料可嵌入至雙鏈DNA間，在激發(fā)光的作用下散發(fā)熒光，而該染料不與單鏈DNA結(jié)合，在激發(fā)光的作用下不發(fā)出熒光。隨著溫度逐漸上升，DNA雙鏈漸打開(kāi)，熒光強(qiáng)度漸減弱。不同樣本的DNA雙鏈因GC含量不同，排列順序不同，因而呈現(xiàn)出不同的熔解曲線。由于ACE2基因的第3個(gè)內(nèi)含子第4個(gè)堿基存在G-A突變，GC間氫鍵斷裂所需的能量與AT間氫鍵斷裂所需的能量不同，因此呈現(xiàn)出不同的熔解曲線。HRM技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)在于PCR擴(kuò)增完成后只需運(yùn)行一個(gè)升溫程序即可完成檢測(cè)，且結(jié)果準(zhǔn)確、成本較低、操作簡(jiǎn)便、可以達(dá)到閉管操作從而避免污染，因此是一種快速、準(zhǔn)確檢測(cè)ACE2基因G8790A基因多態(tài)性的優(yōu)選方法。

Frojdo等[9]用PCR-RFLP法分析了芬蘭地區(qū)823例糖尿病患者ACE2基因G8790A多態(tài)性與DKD的關(guān)系，其中包括365例DKD和458例非DKD患者，結(jié)果表明DKD組與非DKD組的基因分布無(wú)明顯差異，該位點(diǎn)突變與DKD無(wú)關(guān)。馬增霞等[10]采用PCR-RFLP法的研究認(rèn)為DKD組男性患者A基因頻率（59.6%）明顯升高，G基因頻率（40.4%）顯著降低（P＜0.05）。攜帶 A 等位基因的T2DM男性患者更易發(fā)生DKD，G等位基因則為保護(hù)性基因。本研究應(yīng)用HRM法對(duì)2型糖尿病合并DKD患者271例及2型糖尿病不伴DKD患者272例進(jìn)行了ACE2基因rs2285666多態(tài)的分析，觀察到男性患者中G等位基因的頻率在DKD患者中明顯升高（P=0.008）。在校正了病程、吸煙 、SBP、HbA1c、Ccr、eGFR 和 HCY 等的 影響后，發(fā)現(xiàn)在女性患者加性遺傳模型中，G等位基因在兩組間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.03），GG基因型在加性遺傳模型中顯著提升了DKD的患病風(fēng)險(xiǎn)（P＜0.05）。 該結(jié)果與 Li等[11]的研究結(jié)果保持一致。在男性患者中，DKD（+）組攜帶G基因頻率顯著高于 DKD（-）組（校正后 P=0.013），因此，G 基因是男性DKD發(fā)病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。本研究對(duì)2型糖尿病合并DKD患者271例及2型糖尿病病程≥10年且不伴DKD患者272例進(jìn)行了ACE2基因rs2285666多態(tài)性的研究，具有比較好的統(tǒng)計(jì)學(xué)效力，但仍有一定局限性。本研究是在漢族2型糖尿病患者中進(jìn)行的，結(jié)果是否可以推廣到其他民族，還需要進(jìn)一步的調(diào)查。本研究為病例對(duì)照研究，還需要開(kāi)展大樣本前瞻性研究，并進(jìn)一步檢測(cè)不同基因型的酶表達(dá)水平來(lái)驗(yàn)證rs2285666基因型與DKD的關(guān)系。

DKD發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，本研究提示遺傳因素在2型糖尿病患者DKD的發(fā)病中具有一定的作用，對(duì)于ACE2基因 rs2285666多態(tài)性的研究有可能為DKD的基因診斷及治療提供依據(jù)，本研究同時(shí)為該多態(tài)性的研究提供了新的方法，只有明確遺傳易感個(gè)體，盡早進(jìn)行相關(guān)的干預(yù)治療，才能控制和延緩DKD進(jìn)展、改善患者的生活質(zhì)量及減輕社會(huì)的的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，ACE2基因rs2285666多態(tài)性與DKD的關(guān)系還需要進(jìn)一步開(kāi)展大樣本前瞻性研究加以驗(yàn)證。