江丹丹, 馬玖彤, 賈 瓊

(吉林大學化學學院, 吉林 長春 130012)

蛋白質磷酸化是最重要和最普遍的翻譯后修飾之一,在細胞增殖、代謝、分化、轉錄和信號轉導等許多過程中起著重要的調節(jié)作用[1]。蛋白質磷酸化的測定對于全面了解生物過程中的磷酸化途徑至關重要。目前,質譜技術已成為分析蛋白質磷酸化的重要手段。然而,由于磷酸化肽固有的低豐度和低電離效率,以及非磷酸化肽共存所造成的嚴重抑制,使得直接質譜分析仍然是一個挑戰(zhàn)[2]。因此,在質譜分析之前應首先對磷酸化肽進行富集[3,4]。

金屬氧化物親和色譜(MOAC)是磷酸化蛋白質組學中常用的一種富集技術[5],其中金屬氧化物由于存在兩性表面而與磷酸酯基團產(chǎn)生很強的可逆結合力。常用的金屬氧化物一般為二氧化鈦(TiO2)、二氧化鋯(ZrO2)、五氧化二鈮(Nb2O5)和五氧化二鉭(Ta2O5)等價態(tài)較高的金屬氧化物[6,7]。近年來,基于多金屬氧酸鹽(POM)的磁性材料在蛋白質吸附方面顯示出了潛在的應用前景[8]。POM是過渡金屬離子的高氧化態(tài)(如釩(V)、鉬(Mo)、鎢(W)等)與氧形成的納米級金屬-氧簇類化合物,由于其獨特的納米分子結構和廣泛的物理和化學性質,引起了人們極大的興趣[9]。POM具有金屬氧化物表面的顯著特征和豐富的化學位點,適合作為光電材料、催化劑和吸附劑[10]。

本工作提出了一種基于POM磁性納米粒子(MNPs)材料富集磷酸化肽的方法[11,12]。首先,制備半胱胺修飾的殼聚糖(CYECS)[13],以提高殼聚糖(CS)的正電性和溶解性,進而采用層層自組裝技術[14]制備POM/CYECS磁性材料,結合基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(MALDI-TOF MS)檢測手段,用于對磷酸化肽的富集。這種POM/CYECS磁性材料結合了磁響應快速、親水性、正電性和金屬氧化物表面大等優(yōu)點,對磷酸化肽具有高富集選擇性。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

Nicolet is5型傅里葉變換紅外光譜儀(FT-IR, Thermo Nicolet公司,美國); X射線光電子能譜儀(XPS, Thermo Electron公司,美國); X射線衍射儀(XRD, PANalytical公司,荷蘭); 5800基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜儀(Applied Biosystems 公司，美國); KQ2200DB型數(shù)控超聲清洗器(湖南長沙超聲儀器有限公司); JJ-1型磁力攪拌器(江蘇江南儀器廠)。

鎢酸鈉二水合物(Na2WO4·2H2O)、氯化釓六水合物(GdCl3·6H2O)、三氟乙酸(TFA)、硅酸四乙酯(TEOS)、3-(甲基丙烯酸酰氧)丙基三甲氧基硅烷(APTES)、水合肼(N2H4·H2O)和乙腈(ACN)(上海阿拉丁生化科技股份有限公司);三氯化鐵六水合物(FeCl3·6H2O)、醋酸鈉(NaAc)、氨水(NH3·H2O)、碳酸氫銨(NH4HCO3)、氫氧化鉀(KOH)、醋酸(HAc)、殼聚糖(CS)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、N-鄰苯二甲酸酐(N-Phth)、環(huán)氧氯丙烷(EN)、異丙醇(IPA)、三乙胺(TEA)、戊二醛(GA)、半胱胺鹽酸鹽(CYE)、乙二醇、甲酸、乙醇和甲醇(北京化學試劑公司);胰蛋白酶、β-酪蛋白、牛血清蛋白、卵清蛋白(Sigma Aldrich公司,美國)。

1.2 MNPs-(POM/CYECS)的合成

準確稱取1.037 5 g Na2WO4·2H2O,分散到20 mL水中,調節(jié)溶液pH至7.5。隨后加入0.12 g GdCl3·6H2O,攪拌條件下加熱至85 ℃,得到Gd-POM固體。

稱取0.34 g CS和0.83 gN-Phth,溶解至6 mL DMF中,在氮氣氛圍下攪拌加熱至120 ℃,保持8 h。最后傾入冰水,得到灰褐色固體,即N-鄰苯二甲酸酐保護殼聚糖(N-PhthCS)。

稱取0.34 gN-PhthCS和0.52 g EN,溶解至10 mL DMF中,攪拌加熱至60 ℃,保持0.5 h。然后加入IPA和KOH繼續(xù)攪拌12 h,得到環(huán)氧基功能化N-保護殼聚糖(ENCS)。

稱取0.3 g ENCS和0.6 g CYE,溶解至10 mL DMF中,攪拌條件下加熱至25 ℃,保持1 h,再加入4 mL TEA，繼續(xù)攪拌8 h。將得到的產(chǎn)物用大量甲醇清洗,重新分散至20 mL N2H4·H2O中,攪拌加熱至60 ℃,保持6 h,得到CYECS,最后于60 ℃真空干燥。

稱取1.35 g FeCl3·6H2O,溶于75 mL乙二醇中,加入3.60 g NaAc,攪拌形成均勻的黃色黏稠溶液,將該溶液轉移至高壓不銹鋼反應釜中,在烘箱中于200 ℃加熱12 h,用乙醇和水沖洗3次,在外界磁鐵的幫助下分離產(chǎn)物,得到Fe3O4納米粒子。

將350 mg Fe3O4納米粒子分散于220 mL乙醇、55 mL水和1.4 mL 25%(v/v) NH3·H2O中,超聲處理分散15 min,加入1 mL TEOS,在室溫下攪拌10 h,得到Fe3O4@SiO2。

將100 mg Fe3O4@SiO2分散至30 mL乙醇中,加入1.3 mL APTES,攪拌加熱至25 ℃,保持1 h,用乙醇沖洗3次,在外界磁鐵的幫助下分離產(chǎn)物,得到MNPs-NH2納米粒子。

將MNPs-NH2納米粒子分散至30 mL 3 mg/mL Gd-POM甲醇溶液中,攪拌加熱至50 ℃,保持3 h,得到MNPs-POM1。將MNPs-POM1分散至30 mL 3 mg/mL醋酸溶液中,然后加入GA,攪拌加熱至50 ℃,并保持1 h,得到MNPs-(POM1/CYECS1)。重復上述自組裝過程4次,得到多層修飾的MNPs-(POM/CYECS)產(chǎn)物。

1.3 樣品前處理

稱取1 mgβ-酪蛋白樣品,溶解于1 mL 50 mmol/mL碳酸氫銨溶液中,于100 ℃加熱變性10 min,冷卻至室溫,加入20 μL 1 mg/mL胰蛋白酶,于37 ℃水浴條件下酶解16 h,然后在室溫下加入2 μL甲酸終止反應。酶解液置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 磷酸化肽的富集過程

將0.5 mg MNPs-(POM/CYECS)加入到100 μL含有肽的緩沖水溶液(50%( v/v)ACN和0.1%(v/v)TFA)中,超聲處理30 min,在外界磁鐵的幫助下分離MNPs-(POM/CYECS)。去除上清液后,用100 μL緩沖溶液洗滌3次。然后用30 μL 5% (v/v)NH3·H2O超聲處理10 min以洗脫捕獲的磷酸化肽,將得到的洗脫液進行質譜分析。

1.5 MALDI-TOF質譜條件

離子源:電噴霧電離源,正離子模式(ESI+);離子源溫度:110 ℃;電噴霧電壓:2.3 kV;掃描范圍:m/z1 000～3 500;毛細管電壓:3 500 V;碰撞解離能量:10 eV;去溶劑氣體:氮氣;去溶劑溫度:200 ℃;去溶劑氣體流速:8 L/min。

2 結果與討論

2.1 MNPs-(POM/CYECS)的表征

2.1.1CYECS的表征

圖1為CYECS制備過程的示意圖。本實驗首先合成N-PhthCS和ENCS,并用紅外光譜對CS、N-PhthCS、ENCS和CYECS進行了表征。結果表明,N-PhthCS和ENCS具有CS的所有特征峰;N-PhthCS在1 715 cm-1和1 770 cm-1處出現(xiàn)了吸收峰,可以歸因于C=O的振動,證實了N-Phth的成功引入;ENCS在1275 cm-1處的峰為C-O-C的振動峰;與ENCS相比,CYECS光譜中C=O的振動強度降低。這些結果表明已成功合成了CYECS。另外,對產(chǎn)物進行了元素分析,結果表明，CYECS中C、H、N和S的含量分別為47.48%、6.72%、5.95%和3.89%。

2.1.2Gd-POM的表征

已有文獻[15]報道釓氧化物對磷酸化肽具有很好的富集效果,因此本工作選用了Gd-POM,并用FT-IR表征Gd-POM的結構特征。在755、850和940 cm-1處分別出現(xiàn)了吸收峰,與文獻[16]報道一致。另外,用XPS對Gd-POM的元素組成進行表征,W 4f、Gd 4d、Gd 3d、O 1s和Na 1s的峰值分別對應35.4、141.6、418.4、530.6和1072.2 eV,表明Gd-POM被成功合成。

2.1.3MNPs-(POM/CYECS)的表征

CYECS和Gd-POM經(jīng)層層自組裝后制備得到MNPs-(POM/CYECS)磁性材料。用XPS對MNPs進行表征,在MNPs的譜圖中,出現(xiàn)了Fe 2p(711.04 eV)和O 1s(532.89 eV)峰,而在MNPs-(POM/CYECS)的譜圖中還出現(xiàn)了W 4f、Si 2p、Gd 4d、C 1s、N 1s和Na 1s峰,表明POM/CYECS殼被成功封裝在MNPs表面上。實驗還采用XRD對MNPs-(POM/CYECS)進行表征,在MNPs-(POM/CYECS)的譜圖中出現(xiàn)了30.27°、35.66°、43.30°、53.58°、57.21°、62.78°的2θ衍射峰,與MNPs的衍射峰吻合,說明MNPs的晶體結構在制備過程中沒有被破壞。

2.2 MNPs-(POM/CYECS)對磷酸化肽的富集

實驗考察了MNPs-(POM/CYECS)對β-酪蛋白酶解液中磷酸化肽的富集性能。首先研究和優(yōu)化了富集和解吸條件,確定含50%(v/v) ACN和0.1%(v/v)TFA的水溶液為緩沖溶液，5%(v/v)NH3·H2O為解吸液。在此條件下,比較了富集前和經(jīng)過MNPs-(POM/CYECS)富集后的磷酸化肽的質譜圖(見圖2)。通過直接分析,大量的非磷酸化肽信號出現(xiàn)在質譜圖中(見圖2a)。經(jīng)MNPs-(POM/CYECS)富集后,非磷酸化肽的信號顯著降低,可以明顯觀察到磷酸化肽的信號(見圖2b)。富集到的磷酸化肽的詳細序列信息見表1。結果表明,本工作制備的磁性材料能夠有效捕獲磷酸化肽。相比之下,單獨的釓酸鹽材料由于具有負電性,不利于同樣帶負電的磷酸化肽的吸附[17]。另外,與其他基于殼聚糖的磁性材料相比,本實驗制備的磁性材料對磷酸化肽具有更高的選擇性和靈敏度[18,19]。

圖 1 CYECS的合成路線Fig. 1 Synthetic scheme of cysteamine hydrochloride-modified chitosan (CYECS)CS: chitosan; N-PhthCS: phthalic anhydride modified chitosan; ENCS: epichlorohydrin modified chitosan.

圖 2 β-酪蛋白酶解液(4 pmol)經(jīng)MNPs-(POM/CYECS)富集(a)前、(b)后的MALDI-TOF質譜圖Fig. 2 MALDI-TOF mass spectra of β-casein digests (4 pmol) (a) before and (b) after enrichment with polyoxometalate-CYECS magnetic nanoparticles (MNPs-(POM/CYECS)) # Dephosphorylated fragments. Peaks 1-10 indicated phosphopeptides that could be seen in Table 1.

由于復雜生物樣品中磷酸化肽的濃度較低,因此要求方法具有較高的檢測靈敏度。為了評價本實驗設計基于MNPs-(POM/CYECS)富集的MALDI-TOF MS方法的靈敏度,分別選取20、2、0.2和0.02 fmol的β-酪蛋白的胰蛋白酶解液作為檢測樣品。結果表明,當β-酪蛋白的濃度為0.02 fmol時,仍可以觀察到具有較強信號的磷酸化肽。說明檢出限低至0.02 fmol,證明本實驗方法具有較高靈敏度。

實驗還考察了MNPs-(POM/CYECS)的使用重復性。以β-酪蛋白的胰蛋白酶解液作為檢測樣品,使用MNPs-(POM/CYECS)20次后，富集后得到磷酸化肽的信號強度和第1次使用后得到的幾乎無差別(見圖3),表明該磁性材料具有很好的使用重復性。

表1β-酪蛋白酶解液經(jīng)MNPs-(POM/CYECS)富集得到的磷酸化肽序列信息

Table1Informationoftheenrichedphosphopeptidesfromβ-caseindigestswithMNPs-(POM/CYECS)

No.Observed m/zNumber of phosphorylation sitePeptide sequence11030.51FQ[pS]EEQQQTEDELQDK21155.62[pS][pS]EEKFLR31253.11TVD[Mo]ME[pS]TEVF41466.21TVDME[pS]TEVFTK51561.54RELEELNVPGEIVESL[pS][pS][pS]EE[pS]ITR61943.12DIG[pS]E[pS]TEDQA[Mo]EDIK72061.91FQ[pS]EEQQQTEDELQDK82556.11FQ[pS]EEQQQTEDELQDKIHPF92966.24ELEELNVPGEIVE[pS]L[pS][pS][pS]EESITR103122.14RELEELNVPGEIVE[pS]L[pS][pS][pS]EESITR

Nos. 1-10 were the same as that in Fig. 2.

圖 3 β-酪蛋白酶解液(4 pmol)經(jīng)MNPs-(POM/CYECS)富集后的MALDI-TOF質譜圖Fig. 3 MALDI-TOF mass spectra of β-casein digests (4 pmol) after enrichment with MNPs-(POM/CYECS) Peaks 1-10 and # were the same as that in Fig. 1.

為了考察MNPs-(POM/CYECS)對磷酸化肽的富集選擇性,選取β-酪蛋白、牛血清白蛋白和卵清蛋白的混合物(物質的量之比1∶2 000∶2 000)作為分析物。通過直接分析,沒有觀察到磷酸化肽的質譜峰。然而,經(jīng)MNPs-(POM/CYECS)富集后,質譜圖中出現(xiàn)了10條磷酸化肽的信號,證明了此磁性材料對磷酸化肽的高選擇性富集性能。將本工作與最近報道的磁性材料進行比較,結果見表2,說明本實驗制備的磁性材料對磷酸化肽具有令人滿意的選擇性及靈敏度。

表 2 本工作與其他報道的材料的磷酸化肽富集效果的比較Table 2 Comparison of enrichment efficiency of the other materials for phosphopeptides with reported materials

MG@mSiO2-ATP-Ti4+: adenosine phosphate-Ti4+functionalized magnetic mesoporous graphene oxide nanocomposite; Fe3O4@SiO2@(HA/CS)10-Ti4+: titanium phosphate moiety on a multilayer polysaccharide (hyaluronate and chitosan) coated Fe3O4@SiO2nanoparticle; mag GO-CS-Ti4+: Ti4+ions immobilization on crosslinked chitosan loaded on the surface of magnetic graphene oxide; Fe3O4@MIL-101(Fe): metal-organic frameworks shell onto Fe3O4nanoparticles; DFMMOF: dual-metal centered zirconium-organic framework; Fe3O4/PDA/PAMA-Arg: Fe3O4/polydopamine/poly(2-aminoethyl methacrylate hydrochloride)/arginine; BSA: bovine serum albumin.

3 結論

本文通過層層自組裝技術制備了多金屬氧酸鹽-殼聚糖復合吸附磁性材料,結合MALDI-TOF MS檢測手段,成功用于磷酸化肽的富集。該磁性材料具有快速磁響應、親水性、正電性的特點,增強了對磷酸化肽的富集效率和選擇性。本工作不僅提供了一種新型高效富集磷酸化肽的磁性材料,還進一步開拓了多金屬氧酸鹽的應用領域。