趙 娜, 梁嘉誠, 時麗艷, 呂運開, 于麗青*

(1. 河北省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗研究院, 河北 石家莊 050091; 2. 河北大學(xué)化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院, 河北 保定 071000)

抗生素是一類化學(xué)物質(zhì),在低濃度下能殺滅或抑制其他微生物。大量研究表明,抗生素消耗增加會導(dǎo)致耐藥細菌的出現(xiàn)和傳播,導(dǎo)致抗生素治療在人類和動物中失敗[1]。鑒于抗生素耐藥性的潛在危險,許多國家已經(jīng)制定了限制使用這些藥物的實用指南[2]。目前被廣泛用于畜禽養(yǎng)殖業(yè)的抗生素按照化學(xué)結(jié)構(gòu)可分為磺胺類、喹諾酮類、四環(huán)素類、氨基糖苷類、大環(huán)內(nèi)酯類、β-內(nèi)酰胺類等[3]。大部分抗生素在動物腸道中不能完全被機體吸收,約60%～90%的抗生素以其原形或者代謝產(chǎn)物被排泄到動物的糞便或尿液中[4]。這些動物排泄物與植物物質(zhì)結(jié)合,可以人工發(fā)酵成有機肥料。在有機肥中,由于代謝物再轉(zhuǎn)化為母體化合物,抗生素非常穩(wěn)定,甚至含量增加。因此,獸藥可以通過農(nóng)業(yè)施用有機肥到達土壤環(huán)境,進一步影響土壤細菌群落的結(jié)構(gòu)和功能[5,6]。此外,研究人員還指出,土壤中的獸藥殘留可以被蔬菜吸收,這可能對人類和動物造成潛在的健康風(fēng)險。因此,建立一種同時檢測多種獸藥殘留的方法,研究獸藥在有機肥中的遷移機理,并獲得更多的風(fēng)險評估數(shù)據(jù)是很有必要的。

氟喹諾酮類藥物(fluoroquinolones, FQs)具有廣譜、高效、價格低廉,殺菌能力強、半衰期長等特點,已廣泛用于動物和人類感染性疾病的預(yù)防和治療[7,8]。不合理的用藥導(dǎo)致藥物原型或其代謝產(chǎn)物在糞便中殘留,畜禽糞便經(jīng)過發(fā)酵制成有機肥料施于農(nóng)田土壤,氟喹諾酮進而被土壤植物和水生生物所吸收、富集,然后進入食物鏈,影響食品安全,最終將不同程度地被人類吸收,產(chǎn)生毒害作用[9]。目前,食品和環(huán)境基質(zhì)(水、土壤和污水污泥)中獸藥含量測定的分析方法已得到很好的發(fā)展[10-13]。然而,很少有人關(guān)注有機肥(糞肥)中獸藥殘留的分析。目前報道的有機肥樣品中獸藥殘留的前處理方法主要包括液液萃取[14]和固相萃取[15-18]等,液液萃取法通常需大量的化學(xué)試劑,且操作復(fù)雜;固相萃取技術(shù)具有操作簡單、價格低廉、易于自動化的優(yōu)點,但常規(guī)的固相萃取吸附劑為非特異性吸附,吸附性和選擇性較差,對復(fù)雜樣品的凈化和富集較難。

有機肥料的基質(zhì)非常復(fù)雜,目標物易被干擾。因此,需要一種準確、高效和便捷的樣品前處理方法將氟喹諾酮類藥物從有機肥料中分離出來并富集檢測。分散固相萃取樣品前處理技術(shù)QuEChERS具有快速(quick)、簡便(easy)、廉價(cheap)、有效(effective)、耐用(rugged)、安全(safe)等優(yōu)點,此方法包含一個液液微萃取過程,可以除去那些會干擾色譜分析的基質(zhì)成分。因此,QuEChERS技術(shù)具有凈化有機肥料藥物的潛力。近年來在獸藥殘留檢測中應(yīng)用日趨廣泛[19,20]。

本文采用QuEChERS技術(shù)提取有機肥料樣品,聯(lián)用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS/MS),實現(xiàn)了有機肥料中10種氟喹諾酮類藥物殘留的同時檢測。該方法具有較高的準確度和精密度,可為定性和定量分析有機肥料中氟喹諾酮類藥物提供一種準確、高效的檢測方法,對市場上有機肥料的質(zhì)量安全監(jiān)管也具有較高的應(yīng)用價值。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國Agilent公司);色譜柱Atlantis T3 C18色譜柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm)(美國Agilent公司); HCT165離心機(湖南長沙易達儀器有限公司); CP214電子分析天平(奧豪斯儀器上海有限公司); SK-1快速混勻器(上海上登實驗設(shè)備有限公司);氮吹儀(青島海科儀器有限公司);真空冷凍干燥機(美國Virtis公司); 0.22 μm有機相濾膜(美國Pall公司)。

所有化學(xué)試劑無特殊說明外均為分析純。乙腈(色譜純)、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司);檸檬酸、檸檬酸鈉、磷酸、乙二胺四乙酸二鈉(Na2EDTA)(天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司);無水硫酸鎂(天津市光復(fù)精細化工研究所);甲酸(色譜純)、氯化鈉(天津市福晨化學(xué)試劑有限公司);西諾沙星(純度≥99.9%)、氧氟沙星(純度≥99.3%)、環(huán)丙沙星(純度≥94.0%)、依諾沙星(純度≥97.5%)、諾氟沙星(純度≥99.1%)、沙拉沙星(純度≥91.2%)、丹諾沙星(純度≥94.0%)、洛美沙星(純度≥99.4%)、二氟沙星(純度≥96.1%)、恩氟沙星(純度≥99.9%)、培氟沙星(純度≥99.0%)(德國Dr. Ehrenstorfer公司)。

1.2 溶液的配制

Na2EDTA-Mcllvaine緩沖溶液(pH=4.0):準確稱取34.6 g十二水合磷酸氫二鈉、6.45 g檸檬酸和18.6 g乙二胺四乙酸二鈉,置于燒杯內(nèi),加入400 mL超純水,用玻璃棒不停地攪拌,用1 mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至4.0,轉(zhuǎn)移至容量瓶,用超純水定容至500 mL,即為0.1 mol/L的Na2EDTA-Mcllvaine緩沖溶液。

磷酸鹽緩沖溶液(pH=7.2):稱取12.8 g十二水合磷酸氫二鈉和2.18 g二水合磷酸二氫鈉,用超純水溶解后稀釋并定容至500 mL。

標準溶液的配制:分別稱取20 mg 11種藥物標準品,以0.2%(體積分數(shù),下同)的甲酸水溶液做溶劑,配制11種藥物的儲備液(1 000 mg/L),儲存在4 ℃的黑暗環(huán)境中。在實驗前用0.2%甲酸水溶液逐級稀釋儲備液,得到工作溶液。分別精密吸取10 μL除內(nèi)標物(西諾沙星)外的其他10種儲備溶液,加入10 mL容量瓶中,用0.2%甲酸水溶液稀釋、定容,即得質(zhì)量濃度為1.0 mg/L的混合標準工作液。精密吸取10 μL 11種標準儲備溶液,加入10 mL容量瓶中,用0.2%甲酸水溶液稀釋至刻度,搖勻,即得質(zhì)量濃度分別為1.0 mg/L的混合標準內(nèi)標溶液,待用。

1.3 實驗條件

1.3.1色譜條件

色譜柱:Atlantis T3 C18(250 mm×4.6 mm, 5 μm);柱溫:40 ℃;進樣量:5 μL;流速:0.5 mL/min;流動相:A為乙腈,B為0.2%甲酸水溶液;梯度洗脫程序見表1。

表 1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution programTime/minφ(mobile phase A)/%φ(mobile phase B)/%0138751387104060134060151387251387 Mobile phase A: acetonitrile; mobile phase B: 0.2% (v/v) for-mic acid solution.

1.3.2質(zhì)譜條件

離子源:電噴霧離子(ESI)源,正離子模式;離子源溫度:150 ℃;檢測方式:多反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM);毛細管電壓:3 500 V;噴霧壓強:10.34 kPa;脫溶劑溫度:350 ℃;脫溶劑氣流量:3 L/min。10種獸藥的其他質(zhì)譜參數(shù)見表2。

表 2 10種氟喹諾酮類藥物的質(zhì)譜參數(shù)Table 2 Mass parameters of the ten fluoroquinolones

* Quantitative ion.tR: retention time.

1.4 樣品預(yù)處理

將有機肥料樣品冷凍干燥后粉碎,準確稱取1.0 g,置于50 mL聚丙烯離心管中,加入5 mL Na2EDTA-Mcllvaine緩沖液(pH=4.0)和20 mL乙腈溶液,以2 000 r/min的速度渦旋混合,渦旋2 min后,加入1.0 g無水硫酸鎂、0.5 g氯化鈉、0.5 g檸檬酸鈉,充分混勻,超聲提取10 min后,以5 000 r/min的速度離心5 min,取5.0 mL上清液,于50 ℃氮吹至干。

加入0.5 mL流動相溶液(流動相A∶流動相B=4∶6, v/v),超聲溶解,過0.22 μm濾膜后供高效液相色譜-質(zhì)譜儀測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品提取時緩沖溶液的優(yōu)化

本研究中測定的10種氟喹諾酮類藥物均為酸堿兩性化合物,在酸性或堿性條件下均可進行提取[16]。由于有機肥料基質(zhì)的特殊性,在實驗過程中如果直接向樣品中加入乙腈提取溶液會使樣品中氟喹諾酮類藥物性質(zhì)發(fā)生改變。因此,在加入乙腈提取溶液前可用緩沖溶液稀釋,使之形成均相體系,以便目標化合物的提取。本試驗對比了水和2種緩沖溶液(磷酸鹽緩沖溶液和Na2EDTA-Mcllvaine緩沖溶液)在樣品前處理時對目標化合物提取得到的色譜峰面積的影響,結(jié)果見表3。由表可知,Na2EDTA-Mcllvaine緩沖溶液提取樣品時提取效率最高,得到的檢測色譜峰面積最大,故選擇Na2EDTA-Mcllvaine緩沖溶液(pH=4.0)作為樣品提取時的緩沖溶液。

表 3 水和2種緩沖溶液提取的10種氟喹諾酮類 藥物色譜峰面積Table 3 Peak areas of the ten fluoroquinolones extracted with water and two buffer solutions

2.2 色譜條件的優(yōu)化

選擇甲醇和乙腈作為流動相進行對比試驗。結(jié)果顯示:甲醇作為流動相時,組分色譜峰形易變寬,組分分離度低。而乙腈作為流動相時可明顯改善酸堿化合物的峰形,流動相中加入甲酸可增強化合物的保留性,且色譜峰分離程度有所提高,故本試驗選用乙腈和0.2%的甲酸水溶液作為流動相進行梯度洗脫。色譜條件優(yōu)化后得到的10種氟喹諾酮類藥物的色譜圖見圖1。

圖 1 10種氟喹諾酮類藥物標準溶液(300 μg/L)的色譜圖Fig. 1 Chromatograms of the ten fluoroquinolone standard solutions (300 μg/L) Peak Nos. and retention times: 1. lomefloxacin hydrochloride, 3.2 min; 2. pefloxacin methanesulfonate, 3.8 min; 3. danofloxacin mesylate, 5.0 min; 4. ofloxacin, 6.3 min; 5. sarafloxacin hydrochloride, 6.6 min; 6. norfloxacin, 9.2 min; 7. enoxacin, 11.7 min; 8. difloxacin hydrochloride, 14.1 min; 9. enrofloxacin, 14.5 min; 10. ciprofloxacin hydrochloride, 14.8 min.

2.3 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

氟喹諾酮類藥物的分子結(jié)構(gòu)中含有羧基和叔氨基,具有酸堿兩性,在酸性溶液的條件下呈陽離子狀態(tài),在電噴霧正離子模式下,極易形成[M+H]+準分子離子。將所研究的10種氟喹諾酮類藥物標準溶液分別單標進樣,根據(jù)目標物的分子結(jié)構(gòu)特征,采用一級質(zhì)譜對目標物進行母離子全掃描,分析得到[M+H]+分子離子峰,然后二級質(zhì)譜以分子離子為母離子。通過優(yōu)化10種藥物目標物的特征離子對、毛細管電壓、霧化室溫度、碰撞電壓等質(zhì)譜條件,選取相對豐度強、干擾小的離子對作為定性、定量離子。在進行MRM監(jiān)測時選擇信噪比最高的離子對進行檢測,以提高質(zhì)譜確證的準確性。

2.4 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)是由基質(zhì)中的共提干擾物與目標化合物競爭電離所致。通常會對目標化合物的靈敏度、準確度和分析方法的重現(xiàn)性等產(chǎn)生影響。根據(jù)基質(zhì)標準曲線與溶劑標準曲線的斜率比值來評價基質(zhì)效應(yīng),若比值在0.8～1.2范圍內(nèi),則表明基質(zhì)效應(yīng)不明顯。本文對10種氟喹諾酮類藥物的基質(zhì)效應(yīng)進行了評價(見表4),可以看出,基質(zhì)效應(yīng)對各藥物無明顯影響。

2.5 方法學(xué)驗證

2.5.1線性關(guān)系及檢出限

將標準儲備溶液逐級稀釋,配制成質(zhì)量濃度分別為20、50、100、200、300和500 μg/kg的混合標準溶液,在優(yōu)化的色譜和質(zhì)譜條件下進行分析。以各組分進樣質(zhì)量濃度(μg/kg)為橫坐標、峰高為縱坐標繪制標準曲線,得線性方程(見表5)。由表可知,10種氟喹諾酮類藥物的線性相關(guān)系數(shù)(r)均大于0.993 0,表明各目標物在相應(yīng)的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。分別以3倍和10倍信噪比(S/N)確定檢出限(LOD)和定量限(LOQ),分別為0.5～2.5 μg/kg和1.7～8.3 μg/kg。

表 4 10種氟喹諾酮類藥物的回收率和相對標準偏差(n=3)Table 4 Recoveries and RSDs of the ten fluoroquinolones (n=3)

表 5 10種氟喹諾酮類藥物的線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限Table 5 Linear equations, correlation coefficients (r), limits of detection (LODs) and limits of quantification (LOQs) of the ten fluoroquinolones

Y: peak height response value;X: mass concentration (μg/kg).

2.5.2方法回收率的確定

向有機肥料空白樣品溶液中添加LOQ水平、50和200 μg/kg 3個水平的氟喹諾酮類藥物混合標準溶液,每個濃度水平平行測定3次,以標準曲線定量,實驗結(jié)果見表4。10種氟喹諾酮類藥物的平均回收率為82.5%～117.1%,相對標準偏差為3.4%～10.2%,結(jié)果表明該方法有良好的重現(xiàn)性。

2.6 實際樣品的測定

采用本研究建立的QuEChERS聯(lián)用高效液相色譜-質(zhì)譜測定方法,檢測了市場上常見的9種有機肥料樣品中的氟喹諾酮類藥物殘留濃度。測定結(jié)果(見表6)表明,市場上常見的有機肥料樣品中藥物殘留主要為恩氟沙星、氧氟沙星、諾氟沙星和環(huán)丙沙星。這4種抗生素在有機肥料中普遍殘留的質(zhì)量濃度范圍為63.0～1 368.4 μg/kg。為驗證本方法的可靠性,對本方法中氟喹諾酮類藥物的檢出范圍與文獻[21]進行對比,發(fā)現(xiàn)兩種方法的測定結(jié)果非常接近,表明本法適用于有機肥料中氟喹諾酮類藥物殘留的測定。

3 結(jié)論

本研究采用QuEChERS技術(shù)對有機肥料復(fù)雜基質(zhì)樣品進行前處理,有效降低了樣品基質(zhì)的干擾,并聯(lián)用高效液相色譜-質(zhì)譜技術(shù),建立了可同時測定有機肥料中10種氟喹諾酮類藥物殘留的分析方法。該方法檢測成本低、周期短、準確度高、重復(fù)性好、操作簡單、快速,適用于有機肥料質(zhì)量安全監(jiān)測時大批量樣品中氟喹諾酮類藥物殘留的篩查和確證。