趙 娜, 梁嘉誠, 時(shí)麗艷, 呂運(yùn)開, 于麗青*

(1. 河北省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院, 河北 石家莊 050091; 2. 河北大學(xué)化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院, 河北 保定 071000)

抗生素是一類化學(xué)物質(zhì),在低濃度下能殺滅或抑制其他微生物。大量研究表明,抗生素消耗增加會(huì)導(dǎo)致耐藥細(xì)菌的出現(xiàn)和傳播,導(dǎo)致抗生素治療在人類和動(dòng)物中失敗[1]。鑒于抗生素耐藥性的潛在危險(xiǎn),許多國家已經(jīng)制定了限制使用這些藥物的實(shí)用指南[2]。目前被廣泛用于畜禽養(yǎng)殖業(yè)的抗生素按照化學(xué)結(jié)構(gòu)可分為磺胺類、喹諾酮類、四環(huán)素類、氨基糖苷類、大環(huán)內(nèi)酯類、β-內(nèi)酰胺類等[3]。大部分抗生素在動(dòng)物腸道中不能完全被機(jī)體吸收,約60%～90%的抗生素以其原形或者代謝產(chǎn)物被排泄到動(dòng)物的糞便或尿液中[4]。這些動(dòng)物排泄物與植物物質(zhì)結(jié)合,可以人工發(fā)酵成有機(jī)肥料。在有機(jī)肥中,由于代謝物再轉(zhuǎn)化為母體化合物,抗生素非常穩(wěn)定,甚至含量增加。因此,獸藥可以通過農(nóng)業(yè)施用有機(jī)肥到達(dá)土壤環(huán)境,進(jìn)一步影響土壤細(xì)菌群落的結(jié)構(gòu)和功能[5,6]。此外,研究人員還指出,土壤中的獸藥殘留可以被蔬菜吸收,這可能對(duì)人類和動(dòng)物造成潛在的健康風(fēng)險(xiǎn)。因此,建立一種同時(shí)檢測多種獸藥殘留的方法,研究獸藥在有機(jī)肥中的遷移機(jī)理,并獲得更多的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估數(shù)據(jù)是很有必要的。

氟喹諾酮類藥物(fluoroquinolones, FQs)具有廣譜、高效、價(jià)格低廉,殺菌能力強(qiáng)、半衰期長等特點(diǎn),已廣泛用于動(dòng)物和人類感染性疾病的預(yù)防和治療[7,8]。不合理的用藥導(dǎo)致藥物原型或其代謝產(chǎn)物在糞便中殘留,畜禽糞便經(jīng)過發(fā)酵制成有機(jī)肥料施于農(nóng)田土壤,氟喹諾酮進(jìn)而被土壤植物和水生生物所吸收、富集,然后進(jìn)入食物鏈,影響食品安全,最終將不同程度地被人類吸收,產(chǎn)生毒害作用[9]。目前,食品和環(huán)境基質(zhì)(水、土壤和污水污泥)中獸藥含量測定的分析方法已得到很好的發(fā)展[10-13]。然而,很少有人關(guān)注有機(jī)肥(糞肥)中獸藥殘留的分析。目前報(bào)道的有機(jī)肥樣品中獸藥殘留的前處理方法主要包括液液萃取[14]和固相萃取[15-18]等,液液萃取法通常需大量的化學(xué)試劑,且操作復(fù)雜;固相萃取技術(shù)具有操作簡單、價(jià)格低廉、易于自動(dòng)化的優(yōu)點(diǎn),但常規(guī)的固相萃取吸附劑為非特異性吸附,吸附性和選擇性較差,對(duì)復(fù)雜樣品的凈化和富集較難。

有機(jī)肥料的基質(zhì)非常復(fù)雜,目標(biāo)物易被干擾。因此,需要一種準(zhǔn)確、高效和便捷的樣品前處理方法將氟喹諾酮類藥物從有機(jī)肥料中分離出來并富集檢測。分散固相萃取樣品前處理技術(shù)QuEChERS具有快速(quick)、簡便(easy)、廉價(jià)(cheap)、有效(effective)、耐用(rugged)、安全(safe)等優(yōu)點(diǎn),此方法包含一個(gè)液液微萃取過程,可以除去那些會(huì)干擾色譜分析的基質(zhì)成分。因此,QuEChERS技術(shù)具有凈化有機(jī)肥料藥物的潛力。近年來在獸藥殘留檢測中應(yīng)用日趨廣泛[19,20]。

本文采用QuEChERS技術(shù)提取有機(jī)肥料樣品,聯(lián)用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS/MS),實(shí)現(xiàn)了有機(jī)肥料中10種氟喹諾酮類藥物殘留的同時(shí)檢測。該方法具有較高的準(zhǔn)確度和精密度,可為定性和定量分析有機(jī)肥料中氟喹諾酮類藥物提供一種準(zhǔn)確、高效的檢測方法,對(duì)市場上有機(jī)肥料的質(zhì)量安全監(jiān)管也具有較高的應(yīng)用價(jià)值。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國Agilent公司);色譜柱Atlantis T3 C18色譜柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm)(美國Agilent公司); HCT165離心機(jī)(湖南長沙易達(dá)儀器有限公司); CP214電子分析天平(奧豪斯儀器上海有限公司); SK-1快速混勻器(上海上登實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司);氮吹儀(青島?？苾x器有限公司);真空冷凍干燥機(jī)(美國Virtis公司); 0.22 μm有機(jī)相濾膜(美國Pall公司)。

所有化學(xué)試劑無特殊說明外均為分析純。乙腈(色譜純)、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司);檸檬酸、檸檬酸鈉、磷酸、乙二胺四乙酸二鈉(Na2EDTA)(天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司);無水硫酸鎂(天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所);甲酸(色譜純)、氯化鈉(天津市福晨化學(xué)試劑有限公司);西諾沙星(純度≥99.9%)、氧氟沙星(純度≥99.3%)、環(huán)丙沙星(純度≥94.0%)、依諾沙星(純度≥97.5%)、諾氟沙星(純度≥99.1%)、沙拉沙星(純度≥91.2%)、丹諾沙星(純度≥94.0%)、洛美沙星(純度≥99.4%)、二氟沙星(純度≥96.1%)、恩氟沙星(純度≥99.9%)、培氟沙星(純度≥99.0%)(德國Dr. Ehrenstorfer公司)。

1.2 溶液的配制

Na2EDTA-Mcllvaine緩沖溶液(pH=4.0):準(zhǔn)確稱取34.6 g十二水合磷酸氫二鈉、6.45 g檸檬酸和18.6 g乙二胺四乙酸二鈉,置于燒杯內(nèi),加入400 mL超純水,用玻璃棒不停地?cái)嚢?用1 mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至4.0,轉(zhuǎn)移至容量瓶,用超純水定容至500 mL,即為0.1 mol/L的Na2EDTA-Mcllvaine緩沖溶液。

磷酸鹽緩沖溶液(pH=7.2):稱取12.8 g十二水合磷酸氫二鈉和2.18 g二水合磷酸二氫鈉,用超純水溶解后稀釋并定容至500 mL。

標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制:分別稱取20 mg 11種藥物標(biāo)準(zhǔn)品,以0.2%(體積分?jǐn)?shù),下同)的甲酸水溶液做溶劑,配制11種藥物的儲(chǔ)備液(1 000 mg/L),儲(chǔ)存在4 ℃的黑暗環(huán)境中。在實(shí)驗(yàn)前用0.2%甲酸水溶液逐級(jí)稀釋儲(chǔ)備液,得到工作溶液。分別精密吸取10 μL除內(nèi)標(biāo)物(西諾沙星)外的其他10種儲(chǔ)備溶液,加入10 mL容量瓶中,用0.2%甲酸水溶液稀釋、定容,即得質(zhì)量濃度為1.0 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。精密吸取10 μL 11種標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液,加入10 mL容量瓶中,用0.2%甲酸水溶液稀釋至刻度,搖勻,即得質(zhì)量濃度分別為1.0 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)標(biāo)溶液,待用。

1.3 實(shí)驗(yàn)條件

1.3.1色譜條件

色譜柱:Atlantis T3 C18(250 mm×4.6 mm, 5 μm);柱溫:40 ℃;進(jìn)樣量:5 μL;流速:0.5 mL/min;流動(dòng)相:A為乙腈,B為0.2%甲酸水溶液;梯度洗脫程序見表1。

表 1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution programTime/minφ(mobile phase A)/%φ(mobile phase B)/%0138751387104060134060151387251387 Mobile phase A: acetonitrile; mobile phase B: 0.2% (v/v) for-mic acid solution.

1.3.2質(zhì)譜條件

離子源:電噴霧離子(ESI)源,正離子模式;離子源溫度:150 ℃;檢測方式:多反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM);毛細(xì)管電壓:3 500 V;噴霧壓強(qiáng):10.34 kPa;脫溶劑溫度:350 ℃;脫溶劑氣流量:3 L/min。10種獸藥的其他質(zhì)譜參數(shù)見表2。

表 2 10種氟喹諾酮類藥物的質(zhì)譜參數(shù)Table 2 Mass parameters of the ten fluoroquinolones

* Quantitative ion.tR: retention time.

1.4 樣品預(yù)處理

將有機(jī)肥料樣品冷凍干燥后粉碎,準(zhǔn)確稱取1.0 g,置于50 mL聚丙烯離心管中,加入5 mL Na2EDTA-Mcllvaine緩沖液(pH=4.0)和20 mL乙腈溶液,以2 000 r/min的速度渦旋混合,渦旋2 min后,加入1.0 g無水硫酸鎂、0.5 g氯化鈉、0.5 g檸檬酸鈉,充分混勻,超聲提取10 min后,以5 000 r/min的速度離心5 min,取5.0 mL上清液,于50 ℃氮吹至干。

加入0.5 mL流動(dòng)相溶液(流動(dòng)相A∶流動(dòng)相B=4∶6, v/v),超聲溶解,過0.22 μm濾膜后供高效液相色譜-質(zhì)譜儀測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品提取時(shí)緩沖溶液的優(yōu)化

本研究中測定的10種氟喹諾酮類藥物均為酸堿兩性化合物,在酸性或堿性條件下均可進(jìn)行提取[16]。由于有機(jī)肥料基質(zhì)的特殊性,在實(shí)驗(yàn)過程中如果直接向樣品中加入乙腈提取溶液會(huì)使樣品中氟喹諾酮類藥物性質(zhì)發(fā)生改變。因此,在加入乙腈提取溶液前可用緩沖溶液稀釋,使之形成均相體系,以便目標(biāo)化合物的提取。本試驗(yàn)對(duì)比了水和2種緩沖溶液(磷酸鹽緩沖溶液和Na2EDTA-Mcllvaine緩沖溶液)在樣品前處理時(shí)對(duì)目標(biāo)化合物提取得到的色譜峰面積的影響,結(jié)果見表3。由表可知,Na2EDTA-Mcllvaine緩沖溶液提取樣品時(shí)提取效率最高,得到的檢測色譜峰面積最大,故選擇Na2EDTA-Mcllvaine緩沖溶液(pH=4.0)作為樣品提取時(shí)的緩沖溶液。

表 3 水和2種緩沖溶液提取的10種氟喹諾酮類 藥物色譜峰面積Table 3 Peak areas of the ten fluoroquinolones extracted with water and two buffer solutions

2.2 色譜條件的優(yōu)化

選擇甲醇和乙腈作為流動(dòng)相進(jìn)行對(duì)比試驗(yàn)。結(jié)果顯示:甲醇作為流動(dòng)相時(shí),組分色譜峰形易變寬,組分分離度低。而乙腈作為流動(dòng)相時(shí)可明顯改善酸堿化合物的峰形,流動(dòng)相中加入甲酸可增強(qiáng)化合物的保留性,且色譜峰分離程度有所提高,故本試驗(yàn)選用乙腈和0.2%的甲酸水溶液作為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫。色譜條件優(yōu)化后得到的10種氟喹諾酮類藥物的色譜圖見圖1。

圖 1 10種氟喹諾酮類藥物標(biāo)準(zhǔn)溶液(300 μg/L)的色譜圖Fig. 1 Chromatograms of the ten fluoroquinolone standard solutions (300 μg/L) Peak Nos. and retention times: 1. lomefloxacin hydrochloride, 3.2 min; 2. pefloxacin methanesulfonate, 3.8 min; 3. danofloxacin mesylate, 5.0 min; 4. ofloxacin, 6.3 min; 5. sarafloxacin hydrochloride, 6.6 min; 6. norfloxacin, 9.2 min; 7. enoxacin, 11.7 min; 8. difloxacin hydrochloride, 14.1 min; 9. enrofloxacin, 14.5 min; 10. ciprofloxacin hydrochloride, 14.8 min.

2.3 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

氟喹諾酮類藥物的分子結(jié)構(gòu)中含有羧基和叔氨基,具有酸堿兩性,在酸性溶液的條件下呈陽離子狀態(tài),在電噴霧正離子模式下,極易形成[M+H]+準(zhǔn)分子離子。將所研究的10種氟喹諾酮類藥物標(biāo)準(zhǔn)溶液分別單標(biāo)進(jìn)樣,根據(jù)目標(biāo)物的分子結(jié)構(gòu)特征,采用一級(jí)質(zhì)譜對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行母離子全掃描,分析得到[M+H]+分子離子峰,然后二級(jí)質(zhì)譜以分子離子為母離子。通過優(yōu)化10種藥物目標(biāo)物的特征離子對(duì)、毛細(xì)管電壓、霧化室溫度、碰撞電壓等質(zhì)譜條件,選取相對(duì)豐度強(qiáng)、干擾小的離子對(duì)作為定性、定量離子。在進(jìn)行MRM監(jiān)測時(shí)選擇信噪比最高的離子對(duì)進(jìn)行檢測,以提高質(zhì)譜確證的準(zhǔn)確性。

2.4 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)是由基質(zhì)中的共提干擾物與目標(biāo)化合物競爭電離所致。通常會(huì)對(duì)目標(biāo)化合物的靈敏度、準(zhǔn)確度和分析方法的重現(xiàn)性等產(chǎn)生影響。根據(jù)基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線與溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率比值來評(píng)價(jià)基質(zhì)效應(yīng),若比值在0.8～1.2范圍內(nèi),則表明基質(zhì)效應(yīng)不明顯。本文對(duì)10種氟喹諾酮類藥物的基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行了評(píng)價(jià)(見表4),可以看出,基質(zhì)效應(yīng)對(duì)各藥物無明顯影響。

2.5 方法學(xué)驗(yàn)證

2.5.1線性關(guān)系及檢出限

將標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液逐級(jí)稀釋,配制成質(zhì)量濃度分別為20、50、100、200、300和500 μg/kg的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,在優(yōu)化的色譜和質(zhì)譜條件下進(jìn)行分析。以各組分進(jìn)樣質(zhì)量濃度(μg/kg)為橫坐標(biāo)、峰高為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得線性方程(見表5)。由表可知,10種氟喹諾酮類藥物的線性相關(guān)系數(shù)(r)均大于0.993 0,表明各目標(biāo)物在相應(yīng)的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。分別以3倍和10倍信噪比(S/N)確定檢出限(LOD)和定量限(LOQ),分別為0.5～2.5 μg/kg和1.7～8.3 μg/kg。

表 4 10種氟喹諾酮類藥物的回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=3)Table 4 Recoveries and RSDs of the ten fluoroquinolones (n=3)

表 5 10種氟喹諾酮類藥物的線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限Table 5 Linear equations, correlation coefficients (r), limits of detection (LODs) and limits of quantification (LOQs) of the ten fluoroquinolones

Y: peak height response value;X: mass concentration (μg/kg).

2.5.2方法回收率的確定

向有機(jī)肥料空白樣品溶液中添加LOQ水平、50和200 μg/kg 3個(gè)水平的氟喹諾酮類藥物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,每個(gè)濃度水平平行測定3次,以標(biāo)準(zhǔn)曲線定量,實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表4。10種氟喹諾酮類藥物的平均回收率為82.5%～117.1%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.4%～10.2%,結(jié)果表明該方法有良好的重現(xiàn)性。

2.6 實(shí)際樣品的測定

采用本研究建立的QuEChERS聯(lián)用高效液相色譜-質(zhì)譜測定方法,檢測了市場上常見的9種有機(jī)肥料樣品中的氟喹諾酮類藥物殘留濃度。測定結(jié)果(見表6)表明,市場上常見的有機(jī)肥料樣品中藥物殘留主要為恩氟沙星、氧氟沙星、諾氟沙星和環(huán)丙沙星。這4種抗生素在有機(jī)肥料中普遍殘留的質(zhì)量濃度范圍為63.0～1 368.4 μg/kg。為驗(yàn)證本方法的可靠性,對(duì)本方法中氟喹諾酮類藥物的檢出范圍與文獻(xiàn)[21]進(jìn)行對(duì)比,發(fā)現(xiàn)兩種方法的測定結(jié)果非常接近,表明本法適用于有機(jī)肥料中氟喹諾酮類藥物殘留的測定。

3 結(jié)論

本研究采用QuEChERS技術(shù)對(duì)有機(jī)肥料復(fù)雜基質(zhì)樣品進(jìn)行前處理,有效降低了樣品基質(zhì)的干擾,并聯(lián)用高效液相色譜-質(zhì)譜技術(shù),建立了可同時(shí)測定有機(jī)肥料中10種氟喹諾酮類藥物殘留的分析方法。該方法檢測成本低、周期短、準(zhǔn)確度高、重復(fù)性好、操作簡單、快速,適用于有機(jī)肥料質(zhì)量安全監(jiān)測時(shí)大批量樣品中氟喹諾酮類藥物殘留的篩查和確證。