龍立梅, 宋沙沙, 曹學(xué)麗

(北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心, 北京工商大學(xué)食品學(xué)院,北京市食品風(fēng)味化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京 100048)

我國是綠茶生產(chǎn)大國,在綠茶的流通和貿(mào)易領(lǐng)域,急需對其品質(zhì)的科學(xué)評定方法。目前主要采用的是感官審評的方法,但該方法對品茶師的經(jīng)驗(yàn)依賴性較強(qiáng),容易出現(xiàn)主觀偏差,執(zhí)行中也存在不規(guī)范、不嚴(yán)格等問題。因而茶葉市場分級混亂,存在以次充好的情況。

在茶葉的感官評審中,香氣對茶葉感官品質(zhì)的貢獻(xiàn)率達(dá)25%～35%[1],因此茶葉香氣成分研究意義重大。指紋圖譜技術(shù)主要應(yīng)用于鑒別中藥真?zhèn)魏唾|(zhì)量控制等,茶葉科研人員借鑒該方法,利用高相液相色譜(HPLC)、氣相色譜(GC)、紅外及近紅外光譜(IR-NIR)、核磁共振(NMR)等技術(shù),得到能夠標(biāo)示茶葉品質(zhì)特征成分的譜圖;然后運(yùn)用多種數(shù)據(jù)信息處理技術(shù)對指紋圖譜進(jìn)行分析,從而對茶葉品質(zhì)做出客觀量化的評價,有效彌補(bǔ)“感官審評”的缺陷[2]。目前茶葉指紋圖譜技術(shù)已用于茶葉的品種鑒別,茶葉原料、半成品及成品茶的質(zhì)量評價等[3-5],但是還沒有在茶葉分等定級中應(yīng)用的報道。

信陽毛尖茶是我國十大名茶之一,具有淡雅、清新的清香,并且香氣持久,是河南省著名的地理標(biāo)志產(chǎn)品之一[6]。本研究以信陽毛尖為研究對象,以茶湯香氣成分為研究目標(biāo),采用頂空固相微萃取與氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù),通過建立綠茶香氣成分GC-MS指紋圖譜,將判別分析法與指紋圖譜相似度法相結(jié)合,用以研究不同等級茶樣之間的差異性,并用于茶樣的等級判別,為綠茶品質(zhì)評價和質(zhì)量監(jiān)控提供了一種科學(xué)量化的方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與儀器

供試茶樣為當(dāng)年4～5月的信陽毛尖茶,均來自信陽市文新茶葉有限責(zé)任公司,包括優(yōu)質(zhì)信陽毛尖茶“道”系列4個等級多個批次的22個茶樣,按等級從高到低依次為觀道(5個批次)、悟道(5個批次)、修道(6個批次)和品道(6個批次);普通信陽毛尖茶“300”系列3個等級多個批次的19個茶樣,按等級從高到低依次為“330”(6個批次)、“320”(7個批次)和“310”(6個批次)。用復(fù)合鋁箔袋密封樣品,保存于4 ℃冰箱中,冷藏待用。正構(gòu)烷烴標(biāo)準(zhǔn)樣品(C7～C40),購至上海安譜科學(xué)儀器有限公司。

QP 2010 Plus氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(日本島津公司);手動固相微萃取進(jìn)樣器、50/30 μm DVB/CAR/PDMS 57328-U萃取頭(美國Supelco公司); HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋(國華電器有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1GC-MS指紋圖譜建立方法

參照中國國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 23776-2009[1]沖泡綠茶的程序,準(zhǔn)確稱取茶葉樣品3.0 g,放入200 mL的三角瓶內(nèi),倒入150 mL沸水,用錫箔紙封口,室溫下靜置5 min,待茶葉香氣充分揮發(fā)和平衡。首先將其置于80 ℃恒溫水浴鍋中,同時將已經(jīng)老化15 min的萃取頭插入三角瓶內(nèi)茶湯的上方,將固相微萃取(SPME)的手柄固定好,推出萃取頭并開始計(jì)時,頂空吸附60 min后取出,立即插入氣相色譜儀進(jìn)樣口,在250 ℃條件下熱脫附5 min,進(jìn)行GC-MS檢測[7]。每份信陽毛尖茶樣品均做5針平行實(shí)驗(yàn)。將所獲得的同一等級的GC-MS總離子流圖導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(版本2012.130723),生成相應(yīng)等級茶葉的GC-MS對應(yīng)指紋圖譜。

GC-MS分析條件如下。Rxi-5 MS彈性石英毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm);升溫程序:初始溫度為40 ℃,保持3 min,以4 ℃/min速率升到80 ℃,保持2 min,再以2 ℃/min速率升到160 ℃,不保持,最后以12 ℃/min速率升到250 ℃,保持3 min,升溫程序結(jié)束;進(jìn)樣口溫度:250 ℃;載氣:高純He(純度99.999%);柱流量:1.0 mL/min;采用不分流進(jìn)樣方式。EI電離源;離子源溫度為200 ℃;離子化電壓為70 eV;質(zhì)譜掃描范圍m/z35～450;檢測器為1.00 kV。在同樣的條件下,對正構(gòu)烷烴混合物進(jìn)行分析,獲得各個正構(gòu)烷烴成分的保留時間。

1.2.2香氣成分的分析及特征成分的篩選

對總離子色譜圖(total ion chromatogram, TIC)各峰積分,積分參數(shù)斜率為5 000/min,半峰寬為2 s,變參時間為1 000 min;得到的色譜質(zhì)譜數(shù)據(jù)與NIST(US National Institute of Standards and Technology)質(zhì)譜庫匹配,挑選出與目標(biāo)物質(zhì)匹配度≥80的色譜峰,并將各峰測定的保留指數(shù)與NIST譜庫提供的保留指數(shù)(RI)進(jìn)行比較,個別與文獻(xiàn)值比較,確定各個色譜峰對應(yīng)物質(zhì)的名稱。用各色譜峰的峰面積與總峰面積之比計(jì)算出各香氣組分的相對含量。

保留指數(shù)的計(jì)算采用以下公式:

(1)

式中,RI是待測組分的保留指數(shù);RTunknown是待測組分的保留時間;RTn、RTn+1分別是待測組分前后正構(gòu)烷烴的保留時間;n為正構(gòu)烷烴的碳原子數(shù)。

綠茶的香氣是其所含的不同芳香物質(zhì)以不同濃度組合的綜合表現(xiàn);一般情況下,含量較多的成分對香氣的貢獻(xiàn)較大,而相對含量較少的物質(zhì)未必對香氣的貢獻(xiàn)較少[8,9]。因此,分別對不同批次、不同等級信陽毛尖茶檢出的所有香氣成分進(jìn)行匯總、分類和篩選,從而確定信陽毛尖茶的共有峰作為香氣指紋圖譜的特征峰,建立特征香氣共有峰指紋圖譜。所篩選出的香氣特征成分總量在檢出的香氣物質(zhì)總量中均達(dá)到70%以上,具有一定的代表性,可以反映指紋圖譜的特征信息。

1.2.3不同等級信陽毛尖茶的判別分析

以信陽毛尖茶2個系列7個等級樣品為研究對象,采用判別分析法對41個茶樣進(jìn)行等級判別。所得到的每個樣品色譜圖中,以最大主峰為參照,計(jì)算相對峰面積,以7個等級41個樣本的23個共有峰的相對峰面積作為原始數(shù)據(jù),采用SPSS 20.0軟件,使用步進(jìn)式方法中的Wilks λ法進(jìn)行逐步判別分析,建立判別方程,并對所建立的判別方程進(jìn)行交叉驗(yàn)證分析,驗(yàn)證判別方程對初識分組的分類結(jié)果[7,10-12]。

1.2.4相似度計(jì)算方法的選擇

相比于綠茶在產(chǎn)地、種類上的差異,同種綠茶的不同等級之間的差異判別屬于小類水平上的區(qū)別,其茶湯香氣成分的物質(zhì)種類大多數(shù)相同,差異主要體現(xiàn)在物質(zhì)成分的含量上。所以選擇適合同種綠茶不同等級的相似度計(jì)算方法是體現(xiàn)差異的關(guān)鍵。綜合考慮現(xiàn)有多種相似度計(jì)算方法后,本文選擇了夾角余弦法[13]、相關(guān)系數(shù)法[14]、新模型負(fù)指數(shù)法[15]、改進(jìn)Nei系數(shù)法[16]、改良程度相似度[17]、新改良程度相似度[18]六種計(jì)算方法,進(jìn)行同種綠茶不同等級之間相似度計(jì)算,這六種方法對應(yīng)的計(jì)算公式如式(2)～(7)所示。

(2)

(3)

改進(jìn)的Nei系數(shù)法[15]:

(4)

(5)

(6)

(7)

以優(yōu)質(zhì)信陽毛尖“道”系列和普通信陽毛尖“300”系列7個等級多個批次樣品的23個特征滋味成分的GC-MS平均峰面積為計(jì)算參數(shù),利用Excel軟件的數(shù)據(jù)處理功能,以最高級別觀道茶樣指紋圖譜為參比,將各級茶樣的23個特征峰的平均峰面積分別代入6種相似度計(jì)算方法的公式中,得到各等級茶樣與最高級別觀道茶樣的指紋圖譜的相似度。

2 結(jié)果與討論

2.1 方法重現(xiàn)性考察

方法的重現(xiàn)性是在相同測量條件下,對同一被測量樣品進(jìn)行連續(xù)多次測量后所得結(jié)果之間的一致性,是衡量實(shí)驗(yàn)方法可行性和適用性的重要指標(biāo)。將同一茶樣在相同實(shí)驗(yàn)條件下重復(fù)分析5次,測定結(jié)果顯示,色譜峰保留時間的RSD均小于0.1%。相對峰面積的RSD,除個別含量較低的色譜峰為10.0%左右,絕大多數(shù)均小于10.0%。結(jié)果說明重現(xiàn)性好,符合指紋圖譜建立的指標(biāo)要求。

圖 1 信陽毛尖茶“道”系列4個等級和“300”系列3個等級的GC-MS指紋圖譜Fig. 1 GC-MS fingerprints of four grades of “Dao” series and three grades of “300” series of Xinyang Maojian tea

2.2 各等級信陽毛尖茶香氣GC-MS指紋圖譜的建立

分別建立了信陽毛尖茶“道”系列4個等級和“300”系列3個等級的香氣成分GC-MS指紋圖譜。圖1中“道”系列4個等級指紋圖譜對比圖,自上而下依次為觀道、悟道、修道和品道;300”系列3個等級指紋圖譜對比圖,自上而下依次為“330”“320”和“310”。

表 1 信陽毛尖茶23個特征香氣成分Table 1 23 characteristic aroma components of Xinyang Maojian tea

2.3 信陽毛尖茶香氣特征成分的確定

根據(jù)信陽毛尖多個批次、不同等級的41個樣品的指紋圖譜,篩選共有峰。41個茶樣中均含有23個主要揮發(fā)性成分(見表1)。所篩選的23個揮發(fā)性成分總量占信陽毛尖茶總揮發(fā)性成分的70%以上,具有一定的代表性,可以反映指紋圖譜的特征信息。

圖 2 基于GC-MS指紋圖譜的信陽毛尖茶“道”系列和“300”系列等級判別分析Fig. 2 Discriminant classification of Xinyang Maojian tea “Dao” series and “300” series based on GC-MS fingerprints

2.4 基于香氣特征成分的信陽毛尖茶等級判別分析

以信陽毛尖茶“道”系列22個樣本和“300”系列19個樣品的23個共有峰的相對峰面積為原始數(shù)據(jù),利用SPSS 20.0軟件建立典型判別函數(shù),對41個樣本的等級區(qū)分正確率為98%。由如圖2可知,兩個系列之間及同一系列內(nèi)不同等級茶樣之間都能實(shí)現(xiàn)很好的判別區(qū)分。對“道”系列22個樣品和“300”系列19個樣品,分別按相同方法分別進(jìn)行判別分析,對初始分組樣品的等級區(qū)分判別正確率均為100%,如圖3所示。分系列進(jìn)行判別分析,等級之間的區(qū)分度更加顯著。結(jié)果表明,采用香氣特征成分可以對信陽毛尖茶樣進(jìn)行很好的等級判別。

表 2 信陽毛尖茶“道”和“300”系列GC-MS指紋圖譜相似度計(jì)算Table 2 Similarity calculation of GC-MS fingerprints for “Dao” series and “300” series of Xinyang Maojian tea

圖 3 分別基于GC-MS指紋圖譜的信陽毛尖茶“道”系列和“300”系列等級判別分析Fig. 3 Discriminant classification of Xinyang Maojian tea “Dao” series and “300” series based on GC-MS fingerprints separately

2.5 不同等級信陽毛尖茶GC-MS指紋圖譜相似度評價

指紋圖譜的相似度評價不僅可以反映不同等級綠茶之間的差異,還可以體現(xiàn)出差異程度的大小,以量化形式表達(dá)等級之間的差異。以信仰毛尖茶最高級別觀道茶樣指紋圖譜為參照,以6種相似度計(jì)算方法計(jì)算7個等級茶樣的相似度,結(jié)果如表2所示。從中可以看出,不同的相似度計(jì)算方法均可以在不同程度上反映等級之間的差距,但是其中夾角余弦法、相關(guān)系數(shù)法、改進(jìn)Nei系數(shù)法3種方法反映出的等級之間的差異區(qū)分度不顯著。從多種相似度計(jì)算方法所得結(jié)果可知,整體上優(yōu)質(zhì)“道”系列茶樣與普通“300”系列茶樣之間有較大的區(qū)分。對于優(yōu)質(zhì)“道”系列4個等級的茶樣,隨著茶葉品質(zhì)從觀、悟、修、品逐級降低,其相似度也呈現(xiàn)下降的趨勢,且以新改良的相似度法區(qū)分度最大。從相似度數(shù)據(jù)可以看出,與頂級的觀道茶相比,悟、修、品級茶在香氣成分上有顯著的差異,三者之間的差異可以區(qū)分等級,但并不顯著。對于普通的“300”系列3個等級茶樣,其相似度值與優(yōu)質(zhì)“道”系列茶樣,尤其是前3個等級的差異較顯著。其3個等級之間存在一定的差異性,但差異程度較小,且出現(xiàn)等級交錯現(xiàn)象。這可能是由于“300”系列茶樣整體級別較低,等級區(qū)分度較小,感官審評不易區(qū)分或分級不嚴(yán)格。

指紋圖譜相似度的大小可以反映該各等級茶樣與最高的參比等級的相似程度。相似度數(shù)值越小,相似程度越低。從計(jì)算結(jié)果可以看出,不同等級茶樣與參比等級茶樣指紋圖譜的相似度值與茶樣所定的等級之間具有較好的相關(guān)性,相似度差異越大,茶樣等級越低。

3 結(jié)論

以信陽毛尖茶“道”系列和“300”系列共7個不同等級41個樣品為主要研究對象,分別建立了每個等級茶樣的香氣GC-MS指紋圖譜,以篩選的23個香氣特征成分的相對含量為原始數(shù)據(jù)進(jìn)行判別分析。結(jié)果顯示,該方法能夠很好地體現(xiàn)出信陽毛尖茶兩個系列不同等級之間的差異性,在各系列茶樣內(nèi)判別分析的區(qū)分度更高。說明采用基于香氣成分GC-MS指紋圖譜特征成分的判別分析,可以對同一品種不同等級茶樣進(jìn)行很好的等級區(qū)別。同時,以23個香氣特征成分為目標(biāo),采用六種指紋圖譜相似度計(jì)算方法,對不同等級茶樣的相似度進(jìn)行評價。結(jié)果顯示,優(yōu)質(zhì)“道”系列茶樣與普通“300”系列茶樣的香氣成分GC-MS指紋圖譜相似度有較大的差異?！暗馈毕盗?個等級的茶樣指紋圖譜相似度與其等級之間有較好的相關(guān)性,隨著茶葉品質(zhì)從觀、悟、修、品逐級降低,其相似度也呈現(xiàn)下降的趨勢。普通信陽毛尖茶“300”系列3個等級茶樣之間存在一定的差異性,但差異程度較小,且出現(xiàn)等級交錯現(xiàn)象?？傮w而言,基于香氣成分GC-MS指紋圖譜的判別分析法與相似度計(jì)算法可以從不同角度、不同層面體現(xiàn)出同一種綠茶不同等級之間的差異性,可以為綠茶的品質(zhì)區(qū)分和分等定級提供一種客觀量化的方法選擇。