裴亞利,張寶善*,韋露莎,王敏,朱莉莉,周琦,付軍偉
1(陜西師范大學(xué) 食品工程與營(yíng)養(yǎng)科學(xué)學(xué)院,陜西 西安,710062) 2(陜西省果蔬深加工工程技術(shù)研究中心,陜西 西安,710119)
中國(guó)是世界上最大的紅棗生產(chǎn)國(guó)和出口國(guó)[1],2015年紅棗產(chǎn)量已達(dá)900萬(wàn)t,占世界總產(chǎn)量的95%以上[1-2],傳統(tǒng)的紅棗加工業(yè)主要以干制產(chǎn)品為主。近年來(lái),隨著對(duì)紅棗資源的研究與開(kāi)發(fā),市場(chǎng)出現(xiàn)了多種多樣的紅棗果汁、果酒和發(fā)酵類(lèi)飲品[3-4],在這些產(chǎn)品加工中,會(huì)產(chǎn)生大量果渣、果泥等廢棄物。以紅棗提取果汁為例,果渣約占原料的50%以上[5-6],這些副產(chǎn)物部分加工為低價(jià)飼料或直接丟棄,技術(shù)手段落后,產(chǎn)品附加值低,造成資源嚴(yán)重浪費(fèi)和環(huán)境污染[6-7]。因紅棗果渣中較高含量的纖維類(lèi)物質(zhì)[8],有學(xué)者研究用其制備膳食纖維[9],但極少投入在實(shí)際生產(chǎn)實(shí)踐中。近年來(lái)越來(lái)越多的學(xué)者研究開(kāi)發(fā)利用生物質(zhì)資源,紅棗果渣和木本生物質(zhì)結(jié)構(gòu)相似,可通過(guò)預(yù)處理技術(shù)提高生物酶水解效率[10-12],制備發(fā)酵糖單體,進(jìn)而發(fā)酵生產(chǎn)有機(jī)酸等高附加值產(chǎn)品。因此,選擇適宜的紅棗果渣預(yù)處理技術(shù),提高紅棗果渣酶解后還原糖含量對(duì)于紅棗果渣的再利用至關(guān)重要。
據(jù)國(guó)內(nèi)外研究報(bào)道,木質(zhì)纖維素結(jié)構(gòu)中的木質(zhì)素是阻礙纖維素酶與底物接觸的最大因素[13-14],極大地影響酶解效果。研究表明,在酶解過(guò)程中使用堿性雙氧水可破壞木質(zhì)素結(jié)構(gòu),增加底物與生物酶的結(jié)合,顯著提升酶解糖得率[12-15]。但是,有關(guān)用堿性雙氧水處理紅棗果渣的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。鑒于此,本研究以紅棗汁加工過(guò)程中的廢棄物紅棗果渣為材料,進(jìn)行堿性雙氧水預(yù)處理,研究其對(duì)果渣酶解影響規(guī)律,結(jié)合電鏡觀察、紅外光譜掃描及X-射線雙晶衍射分析,優(yōu)化預(yù)處理工藝參數(shù),揭示雙氧水預(yù)處理對(duì)果渣微觀結(jié)構(gòu)的作用機(jī)制,以期為紅棗資源的綜合利用提供理論依據(jù)。
紅棗果渣:棗汁生產(chǎn)中廢棄的棗渣(還原糖含量低于1%),50 ℃烘干后,過(guò)40目篩,4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>
化學(xué)試劑:30%雙氧水(H2O2)、檸檬酸、檸檬酸鈉、KBr、NaOH等分析純?cè)噭?,?gòu)于西安晶博生物科技有限公司;纖維素酶、木聚糖酶,購(gòu)于諾維信生物科技有限公司。
Quanta 200環(huán)境掃描電子顯微鏡,荷蘭FEI有限公司;Tensor27傅里葉紅外光譜儀,德國(guó)布魯克有限公司;粉末X-射線衍射儀,德國(guó)布魯克有限公司;UNICO2000型可見(jiàn)光分光光度計(jì),上海儀器有限公司;Anke TGL-16G 飛鴿離心機(jī),上海安亭科學(xué)儀器廠;水浴鍋,上海?,攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;PL203分析天平,梅特勒-托利多儀器有限公司。
1.3.1 復(fù)合酶水解試驗(yàn)
紅棗果渣酶解條件:搖床轉(zhuǎn)速150 r/min,溫度50 ℃,時(shí)間48 h,纖維素酶用量10 FPU/g(果渣質(zhì)量),木聚糖酶用量150 IU/g(果渣質(zhì)量)。反應(yīng)結(jié)束后煮沸5 min,使酶失活。
1.3.2 單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)
使用6 mol/L NaOH調(diào)節(jié)雙氧水pH至11.5。紅棗果渣與調(diào)好pH的堿性雙氧水溶液按固液比(1∶20)混合再在靜置條件下進(jìn)行預(yù)處理。在預(yù)試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,選取影響雙氧水預(yù)處理單因素試驗(yàn)的因素為:溫度、時(shí)間和雙氧水用量,考察單因素變化對(duì)紅棗果渣中木質(zhì)素去除率和酶解后還原糖含量的影響規(guī)律。單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)如下:
(1)溫度:預(yù)處理時(shí)間為180 min,雙氧水用量為4%,溫度分別設(shè)定為20、30、40、50、60、70 ℃。
(2)時(shí)間:預(yù)處理溫度為50 ℃,雙氧水用量為4%,處理時(shí)間分別設(shè)定為60、120、180、240、300 min。
(3)雙氧水用量(體積分?jǐn)?shù)):預(yù)處理溫度為50 ℃, 時(shí)間為180 min,H2O2用量分別設(shè)定為1%、2%、3%、4%、5%、6%。
依據(jù)上述單因素試驗(yàn),選取適宜的溫度(A)、時(shí)間(B)和雙氧水用量(C)范圍,以還原糖含量為觀察指標(biāo),根據(jù)Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)原理,設(shè)計(jì)3因素3水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn),確定最佳預(yù)處理工藝,因素水平編碼表如表1。
表1 因素水平編碼表Table 1 Experimental factors and coding levels in response surface design
1.4.1 木質(zhì)素含量測(cè)定
參考文獻(xiàn)[16]的方法測(cè)定木質(zhì)素含量。
1.4.2 還原糖含量測(cè)定
參考文獻(xiàn)[17]。準(zhǔn)確吸取0.2、0.4、0.6、0.8、1.2、 1.4、1.6和1.8 mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液(1 mg/mL)于25 mL刻度試管中,補(bǔ)蒸餾水至2 mL,加入1.5 mL 3 ,5-二硝基水楊酸試劑(DNS:3,5-Dinitrosalicylic acid),混合均勻,沸水浴5 min,冷水冷卻到室溫,再向每管加入21.5 mL蒸餾水,充分搖勻,540 nm測(cè)吸光值。以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo),吸光值為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,并得回歸方程:y=0.685 8x-0.079 6,R2=0.997。 取果渣酶解液10 mL,5 000 r/min離心10 min,DNS比色法測(cè)定樣品還原糖含量。
1.4.3 掃描電子顯微鏡分析
參照文獻(xiàn)[4],采用掃描電子顯微鏡分析紅棗果渣預(yù)處理前后的形態(tài)學(xué)變化,利用離子濺射的方法在紅棗果渣樣品表面鍍1層鉑金,在20 kV的加速電壓下運(yùn)行。
1.4.4 紅外光譜分析
參考文獻(xiàn)[18]。取1 mg紅棗果渣粉末,加入質(zhì)量大約為樣品 100 倍的 KBr 粉末(100 mg),在紅外燈照射下研磨粉碎,加入壓模器制成具有一定厚度的透明薄片;薄片置于紅外光譜儀中掃描,波長(zhǎng)范圍4 000~500 cm-1,掃描次數(shù) 16 次,掃描分辨率2 cm-1。
1.4.5 粉末X射線分析
取少量樣品磨細(xì)加入樣品槽,壓實(shí)樣品表面使其附著在槽內(nèi)不脫落;測(cè)試條件:加載電壓 30 kV,步寬0.02°,掃描速率 4°/min,掃描角度 5°~60°。采用Jade軟件對(duì)圖譜進(jìn)行分縫、擬合并計(jì)算雙氧水處理前后紅棗果渣的結(jié)晶度。
單因素試驗(yàn)采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行結(jié)果分析,使用Origin8.5繪制相關(guān)圖形;響應(yīng)面試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Design-expert.v10.01.1軟件處理,測(cè)定指標(biāo)均做3次重復(fù),結(jié)果取平均值。
2.1.1 預(yù)處理溫度對(duì)木質(zhì)素去除率和酶解還原糖含量的影響
預(yù)處理溫度對(duì)紅棗果渣中木質(zhì)素去除率和酶解后還原糖含量的影響見(jiàn)圖1。
圖1 預(yù)處理溫度對(duì)木質(zhì)素去除率和酶解還原糖含量的影響Fig.1 The influence of pretreatment temperature on the lignin removal rate and reducing sugar content after enzymolysis
由圖1可以看出,預(yù)處理溫度由20 ℃增加到50 ℃ 時(shí),木質(zhì)素的去除率顯著增加(P<0.05),提高了27.59%;而溫度從50 ℃升到70 ℃過(guò)程中木質(zhì)素去除率趨于穩(wěn)定無(wú)顯著增加(P>0.05)。隨著溫度的升高,50 ℃時(shí)樣品的木質(zhì)素去除率達(dá)58.82%。20 ℃時(shí)樣品酶解后還原糖含量為14.59%,溫度由20 ℃上升到50 ℃的過(guò)程中其含量顯著增加(P<0.05),在50 ℃時(shí)可達(dá)18.18%;而50~70 ℃時(shí)無(wú)顯著性變化(P>0.05)。隨樣品中木質(zhì)素去除率增加,其酶解還原糖含量隨之增加,這可能是由于木質(zhì)素的降解增大了生物酶與底物的接觸面積和幾率,這與尤毅娜等[15]的研究相一致;而木質(zhì)素去除率受溫度影響較大,這是由于在一定的水解條件下,溫度升高會(huì)加快雙氧水的分解速率,產(chǎn)生過(guò)氧離子的速率加快,進(jìn)而增強(qiáng)木質(zhì)素的降解作用,使其去除率增加[19-20]。因此,預(yù)處理溫度變化范圍可確定為40~60 ℃,進(jìn)行后續(xù)響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。
2.1.2 預(yù)處理時(shí)間對(duì)木質(zhì)素去除率和酶解還原糖含量的影響
預(yù)處理時(shí)間對(duì)紅棗果渣木質(zhì)素去除率和酶解還原糖含量的影響,見(jiàn)圖2。
圖2 預(yù)處理時(shí)間對(duì)木質(zhì)素去除率和酶解還原糖含量的影響Fig.2 The influence of pretreatment time of lignin removal rate and reducing sugar content after enzymolysis
由圖2可知,紅棗果渣木質(zhì)素去除率隨著時(shí)間的延長(zhǎng)先增大后降低,隨著時(shí)間的增加(60~180 min)木質(zhì)素去除率顯著增加(P<0.05),在180 min時(shí)可得最佳去除率,達(dá)到66.82%;在180~300 min,木質(zhì)素去除率降低(P<0.05)。這可能是由于開(kāi)始?jí)A性較強(qiáng),促使雙氧水分解成過(guò)氧離子和超氧自由基,氧化木質(zhì)素,隨著溶液堿性的減弱,從而導(dǎo)致木質(zhì)素降解率降低[20-21]。預(yù)處理后樣品酶解還原糖含量隨時(shí)間呈先顯著增加后降低的趨勢(shì)(P<0.05),其中時(shí)間為180 min時(shí)酶解還原糖含量達(dá)到最高20.05%。因此,時(shí)間對(duì)預(yù)處理效果顯著影響的范圍可確定為 120~240 min。
2.1.3 雙氧水用量對(duì)木質(zhì)素去除率和酶解還原糖含量的影響
雙氧水用量分別設(shè)定1%、2%、3%、4%、5%、6%,紅棗果渣木質(zhì)素的去除率變化如圖3。
圖3 雙氧水用量對(duì)木質(zhì)素去除率和酶解還原糖含量的影響Fig.3 The influence of H2O2 on the lignin removal rate and reducing sugar content after enzymolysis
由圖3可知,紅棗果渣在溫度50 ℃,保溫180 min 時(shí),木質(zhì)素的去除率隨著雙氧水用量的增加呈先增加后保持穩(wěn)定的趨勢(shì)。雙氧水用量在1%~4%時(shí),隨著雙氧水用量增加,木質(zhì)素的氧化作用加強(qiáng),去除率顯著增加(P<0.05),增加了18.16%;而用量在4%~6%時(shí),木質(zhì)素的去除率無(wú)顯著變化(P>0.05)。雙氧水用量由1%上升至4%,樣品酶解后還原糖含量由14.92%升高至18.75%,隨后在4%~6%時(shí)還原糖含量無(wú)顯著增加(P>0.05)。為此,雙氧水用量的水平值范圍可確定為3%~5%。
為了優(yōu)化預(yù)處理工藝,在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上,選取適宜的預(yù)處理溫度、時(shí)間和雙氧水用量范圍[22]。響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見(jiàn)表2。利用還原糖含量數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合,建立的二次回歸模型為:Y=20.63+1.32A+1.16B+0.39C+1.89AB-0.067AC-0.72BC-1.75A2-2.97B2-2.75C2。由表3的回歸模型方差分析可知,該模型達(dá)到極顯著水平(P<0.01),失擬項(xiàng)P=0.101 5>0.05,具有不顯著性,說(shuō)明該方程擬合度較高。相關(guān)系數(shù)R2=0.989 5,可較好地反映雙氧水預(yù)處理溫度、時(shí)間及用量與酶解還原糖含量之間的關(guān)系。對(duì)各項(xiàng)F值檢驗(yàn)可知,各因素中一次項(xiàng)溫度、時(shí)間、雙氧水用量,二次項(xiàng)溫度、時(shí)間、雙氧水用量均為顯著影響因素,而溫度和時(shí)間、時(shí)間和雙氧水用量的交互作用對(duì)試驗(yàn)結(jié)果也有顯著影響。由表中P值可知,各因素對(duì)紅棗果渣酶解后還原糖含量的影響程度從強(qiáng)到弱依次為:溫度>時(shí)間>雙氧水用量。
表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Experimental design and results of response surface
表3 回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance with regression model
注:*代表P<0.05,表示有顯著影響;**代表P<0.01,表示有極顯著影響。
根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)和響應(yīng)面分析得出,預(yù)處理溫度55.83 ℃、時(shí)間202.8 min,雙氧水用量4.01%時(shí),紅棗果渣酶解后還原糖含量預(yù)測(cè)為21.24%。在實(shí)際操作中稍作調(diào)整,最終確定的最佳工藝為:預(yù)處理溫度56 ℃、時(shí)間200 min,雙氧水用量4%,在此條件下進(jìn)行3組重復(fù)試驗(yàn)得到還原糖含量為21.16%,此結(jié)果與理論預(yù)測(cè)接近。故該模型可以用于本工藝的實(shí)際推測(cè)。相比于未處理紅棗果渣14.28%的還原糖含量,雙氧水預(yù)處理效果顯著,酶解后還原糖含量顯著增加。
2.3.1 超微結(jié)構(gòu)分析
掃描電鏡圖像分別在1 000倍、1 500倍和2 000倍條件下拍攝,結(jié)果如圖4所示。
A-未處理樣品;B-處理后樣品;1-放大倍數(shù)1 000;2-放大倍數(shù)1 500;3-放大倍數(shù)2 000圖4 紅棗果渣的掃描電鏡圖像Fig.4 SEM images of Ziziphus jujube residues
與未處理組(A組)相比,雙氧水處理(B組)對(duì)紅棗果渣表面結(jié)構(gòu)影響顯著。未經(jīng)處理的紅棗果渣表面結(jié)構(gòu)完整,而經(jīng)雙氧水處理后的果渣呈現(xiàn)不規(guī)則的疏松多孔結(jié)構(gòu),纖維外表面積明顯增大[15]。1 000倍電鏡照片下觀察到處理后的紅棗果渣纖維顆粒度降低,稍大的纖維顆粒蓬松度增加;1 500倍和2 000倍電鏡下還可以觀察到雙氧水預(yù)處理后的紅棗果渣顆粒表面有明顯的裂痕,斷層現(xiàn)象纖維表面呈寬松而粗糙狀[23-24]。說(shuō)明通過(guò)雙氧水預(yù)處理,紅棗果渣顆粒表面結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化,原致密結(jié)構(gòu)變得多孔蓬松,生物酶接觸纖維素的表面積顯著增大,同時(shí)有研究表明提高原料的空隙性能顯著提高酶解效率[13]。
2.3.2 傅里葉紅外分析
采用波長(zhǎng)范圍在4 000~500 cm-1的紅外光譜掃描紅棗果渣,分析雙氧水處理前后其成分變化。如圖5所示,處理前后紅棗果渣的紅外光譜呈現(xiàn)出纖維類(lèi)多糖特征吸收峰,其中纖維素、半纖維素和木質(zhì)素等主要化學(xué)物質(zhì)的條帶發(fā)生明顯變化。
圖5 處理前后紅棗果渣的傅里葉紅外分析Fig.5 FTIR analysis of before and after treatment Ziziphus jujube residues注:A-未處理,B-處理后,下圖同。
未處理的紅棗果渣(圖5-A)在3 414.03 cm-1處有很強(qiáng)的O—H伸縮振動(dòng),在2 924.47、2 855.93 cm-1處有強(qiáng)烈的C—H伸縮振動(dòng)。雙氧水處理后的紅棗果渣(圖5-B)中可以觀察到相同的伸縮特征,O—H和C—H的伸縮振動(dòng)分別在3 443.40 cm-1和2 924.47/2 865.72 cm-1處,說(shuō)明處理前后樣品中都含有氫鍵和飽和烴[15]。而2 924.47 cm-1處的透過(guò)率可以反映樣品結(jié)晶度[25],紅棗果渣經(jīng)過(guò)雙氧水處理后在該處透過(guò)率增大,這說(shuō)明處理后的紅棗果渣纖維結(jié)晶度有所降低。從圖中可以看出雙氧水處理前后的紅棗果渣分別在1 729.93 cm-1處有一個(gè)小吸收峰,這是木聚糖C=O伸縮振動(dòng)引起的,是半纖維素的特征吸收峰[26]。在木質(zhì)素存在的雙鍵振動(dòng)區(qū)[27],未處理紅棗果渣于1 632.02、1 524.32和1 445.99 cm-1處有明顯的吸收峰,而雙氧水處理后的樣品僅在1 543.90 cm-1處有微弱的吸收峰且該區(qū)域透過(guò)率明顯增加,所以可以確定處理后樣品中木質(zhì)素含量有所降低。
2.3.3 X-射線衍射表征
處理前后的樣品進(jìn)行X-射線衍射掃描檢測(cè),得到明顯的002峰位置變化及衍射強(qiáng)度變化。紅棗果渣原樣與預(yù)處理后的射線衍射峰相比變化不大,從圖6可以看出,101、002和040峰衍射角分別為15.78°,21.69°和34.88°,這是典型的纖維素I的特征[28]。未處理的紅棗果渣對(duì)應(yīng)的曲線A峰形尖銳程度較大,根據(jù)Jade分峰、擬合計(jì)算得到結(jié)晶度為20.82%;而雙氧水處理后的紅棗果渣曲線B的結(jié)晶度為13.63%, 降低了7.19%。最佳預(yù)處理?xiàng)l件下,紅棗果渣結(jié)晶度的降低可以有效地提高酶解效率,是由于預(yù)處理過(guò)程中纖維素結(jié)晶區(qū)溶脹程度增加,空隙變大,結(jié)晶度降低[20],這與掃描電鏡和傅里葉紅外光譜掃描結(jié)果分析相一致。
圖6 處理前后紅棗果渣結(jié)晶指數(shù)分析Fig.6 Crystallization index analysis of before and after treatment Ziziphus jujube residues
紅棗果渣致密復(fù)雜的空間結(jié)構(gòu),在利用時(shí)合理有效的預(yù)處理方法[29],可提高酶解后可發(fā)酵糖得率。ZHOU等[30]利用稀酸化學(xué)試劑預(yù)處理原料,但由于試劑腐蝕性高、污染性大很難用于實(shí)踐。本研究結(jié)果表明,雙氧水處理過(guò)程中的反應(yīng)溫度、時(shí)間及雙氧水用量對(duì)紅棗果渣中木質(zhì)素去除率影響顯著,這與尤毅娜等[15]利用雙氧水處理蘋(píng)果渣結(jié)果相吻合。在最優(yōu)預(yù)處理?xiàng)l件下,紅棗果渣酶解后還原糖含量相比未處理組顯著提高。鄭英等[20]研究雙氧水處理木薯渣,酶解液中還原糖溶出率可達(dá)85.02%。雙氧水技術(shù)預(yù)處理紅棗果渣,過(guò)程操作簡(jiǎn)單,反應(yīng)迅速且對(duì)裝置設(shè)備要求低[12],具有一定工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。
試驗(yàn)探索了雙氧水處理前后紅棗果渣的結(jié)構(gòu)變化以及酶解效果提高的原因。掃描電鏡可直接清晰呈現(xiàn)樣品表面的微觀結(jié)構(gòu),在較高的放大倍數(shù)下進(jìn)行組織形貌的觀察[31]。本試驗(yàn)直觀了解到雙氧水可破壞果渣微觀結(jié)構(gòu),增大生物酶與底物的接觸面積。依據(jù)物質(zhì)的紅外光譜圖,可對(duì)其分子結(jié)構(gòu)及組分進(jìn)行定性定量的分析[32]。雙氧水預(yù)處理紅棗果渣后,特征官能團(tuán)和化學(xué)鍵的吸收峰位置發(fā)生明顯改變,木質(zhì)素的官能團(tuán)吸收區(qū)極大減弱,有效地解釋了酶解后還原糖含量提高的原因。分析X-射線衍射圖譜,可以獲得物質(zhì)內(nèi)部的結(jié)晶狀態(tài)[33]。本研究結(jié)果表明,經(jīng)雙氧水處理后果渣結(jié)晶度減小,纖維素結(jié)晶區(qū)被破壞,而非結(jié)晶區(qū)的木質(zhì)素含量降低,生物酶的可及性提高。
采用單因素和響應(yīng)面試驗(yàn)對(duì)堿性雙氧水預(yù)處理紅棗果渣的工藝進(jìn)行優(yōu)化,得到最優(yōu)預(yù)處理?xiàng)l件為處理溫度56 ℃,時(shí)間200 min,雙氧水用量4%。此預(yù)處理?xiàng)l件下酶解紅棗果渣得還原糖含量顯著增加,達(dá)到21.16%。掃描電子顯微鏡圖像、紅外光譜及X-射線衍射圖譜結(jié)果表明,堿性雙氧水預(yù)處理顯著改變紅棗果渣物理結(jié)構(gòu)及化學(xué)組分,使其表面呈粗糙疏松狀,木質(zhì)素含量降低,結(jié)晶度減小。因此,將堿性雙氧水預(yù)處理技術(shù)應(yīng)用于紅棗果渣酶解過(guò)程中,為今后提高果渣酶解糖得率,提高紅棗資源的利用價(jià)值等研究提供了理論依據(jù)。