周新麗，申炳陽(yáng)，孔兵，高麗娟，馮羅蘭，王振華,3，葉嘉明,3*

1(上海理工大學(xué) 醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海，200093) 2(浙江清華長(zhǎng)三角研究院 分析測(cè)試中心，浙江 嘉興，314006) 3(國(guó)家食品安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中心 應(yīng)用技術(shù)合作中心，浙江 嘉興，314006)

水產(chǎn)品營(yíng)養(yǎng)豐富、味道鮮美，是人類(lèi)食物的重要來(lái)源。近年來(lái)，隨著人們生活水平的提高，在注重水產(chǎn)品營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的同時(shí)，其安全性也越來(lái)越受到人們的關(guān)注[1]。目前我國(guó)水產(chǎn)品質(zhì)量安全存在的問(wèn)題主要是違規(guī)加入非法添加物，以及過(guò)量使用食品添加劑。

食品中非法添加物是指國(guó)家食品安全標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定添加范圍之外而添加到食品中的物質(zhì)[2]，比如向水產(chǎn)品中加入甲醛、雙氧水等非法添加物，可以延長(zhǎng)保質(zhì)期，增加持水性和韌性，同時(shí)也增加了水產(chǎn)品的毒性，誤食可使人致癌，嚴(yán)重時(shí)致人死亡[3-4]。食品添加劑是為改善食品品質(zhì)和色、香、味以及為防腐、保鮮和加工工藝的需要而加入食品中的人工合成或者天然物質(zhì)，國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)頒布的《GB 2760—2014食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》規(guī)定了食品添加劑的使用原則、允許使用的食品添加劑品種、使用范圍及最大使用量或殘留量[5]。在水產(chǎn)品中加入SO2食品添加劑，可以達(dá)到保鮮、延長(zhǎng)貨架期的目的，但如果人體過(guò)量攝入SO2，會(huì)影響Ca、P吸收，導(dǎo)致免疫力低下，SO2還可與血液中的硫胺素結(jié)合，導(dǎo)致腦、肝、脾等器官發(fā)生病變[6-7]。

用于食品中添加物檢測(cè)的方法有兩大類(lèi)，一類(lèi)是精密儀器分析方法，主要包括高效液相色譜法、色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、離子色譜法、毛細(xì)管電泳法等[8-12]；另一類(lèi)是快速檢測(cè)方法，以分光光度法、比色法為代表。精密儀器分析方法具有較高的精度和靈敏度，但存在檢測(cè)成本高、步驟繁瑣、檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)、需要專(zhuān)業(yè)人員操作等問(wèn)題，難以滿(mǎn)足對(duì)添加物進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)、快速、微量化、便攜化的檢測(cè)需要[13-14]?，F(xiàn)有的快速檢測(cè)方法主要是基于理化顯色反應(yīng)，結(jié)合光度分析原理進(jìn)行檢測(cè)，一般采用比色卡人眼判讀結(jié)果，可用于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)，但準(zhǔn)確度差，只能用于定性分析；而采用分光光度法雖能實(shí)現(xiàn)定量分析，但檢測(cè)步驟略繁瑣，并需要專(zhuān)業(yè)人員操作。更主要的是，上述2種快速檢測(cè)方法檢測(cè)指標(biāo)單一，難以實(shí)現(xiàn)水產(chǎn)品中添加物的多指標(biāo)同時(shí)測(cè)定。相比之下，近幾年發(fā)展起來(lái)的微流控芯片技術(shù)，不僅能夠極大降低試劑的消耗量，同時(shí)還具有分析速度快、檢測(cè)通量高、設(shè)備體積小、自動(dòng)化程度高、非專(zhuān)業(yè)人員使用、成本低等優(yōu)點(diǎn)，有望在食品安全快速檢測(cè)領(lǐng)域獲得廣泛的應(yīng)用[15-19]。

本文將微流控技術(shù)用于水產(chǎn)品中甲醛、雙氧水和SO2的快速檢測(cè)，使用一次性的扇形高聚物微流控芯片，配合自行研制的便攜式微流控速測(cè)儀，旨在實(shí)現(xiàn)對(duì)水產(chǎn)品中添加物的全自動(dòng)、高通量、低成本的快速檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

芯片材料：光學(xué)級(jí)聚甲基丙烯酸甲酯(polymethylmethacrylate，PMMA)板材，0.5 mm、4.0 mm兩種厚度規(guī)格，購(gòu)于蘇州揚(yáng)清芯片科技有限公司。

試劑：甲醛、雙氧水、SO2標(biāo)準(zhǔn)品，均采購(gòu)自國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心；NaOH，購(gòu)自無(wú)錫市佳妮化工有限公司；間苯三酚，購(gòu)自麥克林公司；雙氧水、吊白塊快速檢測(cè)試劑盒，均購(gòu)自杭州天邁生物科技有限公司。

間苯三酚堿溶液：稱(chēng)取8.0 g NaOH，溶于25 mL蒸餾水中，待完全冷卻后，加入0.810 7 g間苯三酚充分溶解，最后轉(zhuǎn)移到50 mL容量瓶中定容，混勻備用。

1.2 儀器與設(shè)備

YoungLaser-V12型二氧化碳激光芯片雕刻機(jī)，蘇州揚(yáng)清芯片科技有限公司；DW系列超低溫保存箱(-86 ℃)，海爾生物醫(yī)療公司；Scientz-N型真空冷凍干燥機(jī)，寧波新芝生物技術(shù)股份有限公司；FA 1604電子天平，上海精科實(shí)業(yè)有限公司；Milli-Q超純水系統(tǒng)(18 MΩ)，美國(guó)Millipore公司；U-2900型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，日立高新技術(shù)公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 檢測(cè)原理

根據(jù)分光光度原理，甲醛在堿性條件下與間苯三酚發(fā)生縮合反應(yīng)生成橘紅色化合物，可以在便攜式微流控速測(cè)儀上測(cè)定470 nm處的吸光度來(lái)定量分析甲醛含量[20]。同理，根據(jù)雙氧水快速檢測(cè)試劑盒的操作說(shuō)明書(shū)，雙氧水在酸性溶液中與鈦離子生成穩(wěn)定的橙色絡(luò)合物，可在便攜式微流控速測(cè)儀上測(cè)定410 nm處的吸光度來(lái)定量分析雙氧水含量[21]；根據(jù)吊白塊快速檢測(cè)試劑盒的操作說(shuō)明書(shū)，SO2溶于水后生成的亞硫酸根離子將二價(jià)銅離子還原為亞銅離子，亞銅離子和新銅試劑形成黃色配合物，可在速測(cè)儀上測(cè)定410 nm處的吸光度來(lái)定量分析SO2含量[22]。

1.3.2 芯片的設(shè)計(jì)與制作

如圖1-A所示，本實(shí)驗(yàn)所設(shè)計(jì)的扇形微流控芯片由3層基片組成，扇形半徑48 mm，蓋板、通道層、底板分別為厚度0.5、4.0、0.5 mm的PMMA基片。扇形微流控芯片由芯片固定孔、進(jìn)樣區(qū)、儲(chǔ)液區(qū)、檢測(cè)區(qū)、球閥、廢液區(qū)、通氣孔和進(jìn)樣孔構(gòu)成(圖1-B)，其中，進(jìn)樣區(qū)、儲(chǔ)液區(qū)、檢測(cè)區(qū)、廢液區(qū)的體積分別為360、100、100、120 μL。

芯片的制作過(guò)程如下：首先，用SolidWorks軟件設(shè)計(jì)芯片各層的結(jié)構(gòu)圖案；其次，通過(guò)二氧化碳激光芯片雕刻機(jī)直接在PMMA基片上加工結(jié)構(gòu)圖案和微通道，同時(shí)切割獲得蓋板基片和底板基片；最后，將蓋板基片、通道層基片和底板基片鍵合，制得一次性扇形微流控芯片。

1-芯片固定孔；2-進(jìn)樣區(qū)；3-儲(chǔ)液區(qū)；4a-甲醛檢測(cè)區(qū)；4b-雙氧水檢測(cè)區(qū)；4c-SO2檢測(cè)區(qū)；5-球閥；6-廢液區(qū)； 7-通氣孔；8-進(jìn)樣孔圖1 扇形微流控芯片三維結(jié)構(gòu)示意圖(A)和平面結(jié)構(gòu)示意圖(B)Fig.1 Three-dimensional structure schematic diagram of fan-shaped microfluidic chip(A) and schematic diagram of plane structure(B)

1.3.3 試劑預(yù)存儲(chǔ)

鍵合芯片之前，采用真空冷凍干燥法將所需試劑預(yù)先固定在芯片檢測(cè)區(qū)中[23]，具體操作方法如下：在圖1-B所示芯片的檢測(cè)區(qū)4a、4b、4c中依次加入3 μL間苯三酚堿溶液、10 μL雙氧水快速檢測(cè)試劑盒中的試劑A、10 μL吊白塊快速檢測(cè)試劑盒中的試劑D，分別用于甲醛，雙氧水和SO2的快速檢測(cè)，在超低溫保存箱-80 ℃下預(yù)凍30 min，之后置于真空冷凍干燥機(jī)內(nèi)冷凍干燥2 h，獲得預(yù)存儲(chǔ)檢測(cè)試劑的微流控芯片。

1.3.4 自行研制的便攜式微流控速測(cè)儀

便攜式微流控速測(cè)儀如圖2-A所示，其基本組成包括光電檢測(cè)模塊、旋轉(zhuǎn)系統(tǒng)(離心模塊)和數(shù)據(jù)處理等模塊(圖2-B)。其中，光電檢測(cè)模塊由LED光源、光通路和光電池感應(yīng)器組成；旋轉(zhuǎn)系統(tǒng)包括電機(jī)和芯軸。應(yīng)用時(shí)，旋轉(zhuǎn)系統(tǒng)帶動(dòng)微流控芯片轉(zhuǎn)動(dòng)，一定時(shí)間后轉(zhuǎn)動(dòng)停止，LED光源將會(huì)與芯片上特定的檢測(cè)區(qū)對(duì)準(zhǔn)，通過(guò)光電池感應(yīng)器讀取信號(hào)，再經(jīng)過(guò)數(shù)據(jù)處理模塊，得到檢測(cè)區(qū)的吸光度值。

注：1-微流控芯片；2-芯軸；3-電機(jī)；4-LED光源；5-光通路；6-光電池感應(yīng)器圖2 便攜式微流控速測(cè)儀外觀(A)及系統(tǒng)組成示意圖(B)Fig.2 Appearance of portable microfluidic tachymeter(A) and schematic diagram of the system composition(B)

1.3.5 流體的操控

微流控芯片的基本特征是集成多種操作單元于整體可控的微小平臺(tái)上，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)微量液體在芯片內(nèi)部的精密、可控轉(zhuǎn)移[24]。如圖3所示，用移液槍將待檢液加入進(jìn)樣區(qū)(步驟1)；通過(guò)調(diào)節(jié)離心模塊的旋轉(zhuǎn)方向及轉(zhuǎn)速大小，精準(zhǔn)地操控待檢液等量分成3份轉(zhuǎn)移至儲(chǔ)液區(qū)，多余的待檢液將被轉(zhuǎn)移至廢液區(qū)(步驟2)；最后，儲(chǔ)液區(qū)的待檢液離心至檢測(cè)區(qū)，進(jìn)行顯色反應(yīng)及檢測(cè)(步驟3)，從而完成樣品的檢測(cè)過(guò)程。

圖3 微流控芯片上的流體驅(qū)動(dòng)過(guò)程Fig.3 Fluid-driven process on microfluidic chips

1.3.6 反應(yīng)動(dòng)力學(xué)

甲醛、雙氧水、SO2的實(shí)驗(yàn)濃度分別選擇5、5、1 mg/L， 以添加物反應(yīng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制3種添加物的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)曲線，選擇動(dòng)力學(xué)曲線上的合適時(shí)間為系統(tǒng)的檢測(cè)時(shí)間。

1.3.7 系統(tǒng)考察

1.3.7.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

分別采用不同濃度的甲醛、雙氧水、SO2溶液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)考察，以添加物濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，使用Origin 9.0軟件進(jìn)行線性擬合分析，繪制3種添加物的標(biāo)準(zhǔn)曲線，并確定3種添加物的線性范圍，以12次空白實(shí)驗(yàn)測(cè)得值的3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差(standard deviation，SD)與其添加物標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率的比值作為檢出限[25-27]。

1.3.7.2 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)

為了考察方法的可靠性，進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)。取水產(chǎn)品的陰性樣品溶液，添加3種添加物——甲醛、雙氧水、SO2標(biāo)準(zhǔn)品濃度分別至5、10、20 mg/L，每個(gè)加標(biāo)濃度做6個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)，采用微流控芯片系統(tǒng)測(cè)定各樣品的濃度。計(jì)算3種添加物的6次測(cè)量濃度結(jié)果的均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差，以回收率、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation，RSD)作為考察系統(tǒng)準(zhǔn)確度和精密度的標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 芯片結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)及微流體操控

基于吸光度檢測(cè)原理，芯片檢測(cè)區(qū)的深度即光程長(zhǎng)短對(duì)光學(xué)檢測(cè)結(jié)果有較大的影響，根據(jù)朗伯比爾定律，增大光程可以有效提高檢測(cè)靈敏度，另一方面，增大光程也提高了芯片材料成本和試劑消耗量[28]。綜合考慮檢測(cè)靈敏度、芯片材料成本以及試劑消耗量，選擇蓋板、通道層、底板分別為厚度0.5、4.0、0.5 mm的PMMA基片。根據(jù)多指標(biāo)的檢測(cè)需要，在微流控芯片上設(shè)計(jì)了“進(jìn)樣區(qū)—儲(chǔ)液區(qū)—檢測(cè)區(qū)”的串聯(lián)結(jié)構(gòu)，其中檢測(cè)區(qū)底部固定檢測(cè)試劑，儲(chǔ)液區(qū)和檢測(cè)區(qū)之間以短通道連接，該通道起到“毛細(xì)管閥”的作用。為進(jìn)一步避免試劑污染及各反應(yīng)間的相互干擾，同時(shí)還在短通道中間加工球閥結(jié)構(gòu)。

通過(guò)調(diào)節(jié)離心模塊的旋轉(zhuǎn)方向及轉(zhuǎn)速大小來(lái)操控微流體，如圖4-A所示，芯片上定量加樣360 μL時(shí)，待檢液充滿(mǎn)整個(gè)進(jìn)樣區(qū)；當(dāng)離心模塊處于低速(600～1 000 r/min，逆時(shí)針)運(yùn)行狀態(tài)時(shí)，待檢液等量分成3份轉(zhuǎn)移至儲(chǔ)液區(qū)，但無(wú)法突破“毛細(xì)管閥”，而多余的待檢液將被轉(zhuǎn)移至廢液區(qū)(圖4-B)；當(dāng)離心模塊處于高速(大于1 300 r/min，逆時(shí)針)運(yùn)行狀態(tài)時(shí)，儲(chǔ)液區(qū)的待檢液將完全突破“毛線管閥”，進(jìn)入并充滿(mǎn)檢測(cè)區(qū)(圖4-C)。

圖4 不同下?tīng)顟B(tài)下的微流控芯片(A)加樣狀態(tài)(B)低速離心狀態(tài)(C)高速離心狀態(tài)Fig.4 Microfluidic chips under different states(A) sampling state(B) low velocity centrifugal state(C) high velocity centrifugal state

2.2 反應(yīng)動(dòng)力學(xué)考察

圖5顯示了微流控芯片中3種添加物的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)曲線。甲醛(5 mg/L)的吸光度隨反應(yīng)時(shí)間先增大后減小，吸光度在反應(yīng)90 s時(shí)達(dá)到最大值，此時(shí)反應(yīng)最為充分，90 s后吸光度值呈現(xiàn)下降趨勢(shì)；雙氧水(5 mg/L)的吸光度比較穩(wěn)定，反應(yīng)30 s后處于穩(wěn)定狀態(tài)；SO2(1 mg/L)的吸光度在反應(yīng)60 s時(shí)到達(dá)最大值，之后保持相對(duì)穩(wěn)定狀態(tài)。綜合考慮3種添加物反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)曲線，并盡可能保證整體檢測(cè)的準(zhǔn)確度，確定合適的檢測(cè)時(shí)間為60～90 s。

圖5 微流控芯片中3種添加物的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)曲線Fig.5 Reaction kinetics curves of three additives in microfluidic chips

2.3 系統(tǒng)考察

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

圖6顯示了微流控芯片中3種添加物的標(biāo)準(zhǔn)曲線，甲醛、雙氧水、SO2的決定系數(shù)R2分別為0.998 7、0.999 4、0.999 1，擬合度較好，可用于添加物的定量檢測(cè)分析。

甲醛、雙氧水、SO2的檢出限分別為0.3、0.4、0.2 mg/L，與精密分光光度計(jì)的檢出限相差不大。

圖6 微流控芯片中3種添加物的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.6 Standard curves of three kinds of additives in microfluidic chips

甲醛、雙氧水的線性范圍較寬，分別為0.5～50 mg/L、1～50 mg/L，SO2的線性范圍為0.5～30 mg/L，能夠滿(mǎn)足日常檢測(cè)需要。

2.3.2 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)

表1列出了微流控芯片上的加標(biāo)回收結(jié)果，所測(cè)得3種添加物的回收率在92.38%～107.98%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均低于4%，表明微流控芯片系統(tǒng)的準(zhǔn)確度和精密度較好，因此，便攜式微流控芯片系統(tǒng)可以用來(lái)進(jìn)行水產(chǎn)品中添加物的快速、準(zhǔn)確檢測(cè)。

表1 微流控芯片上的加標(biāo)回收結(jié)果Table 1 Recoveries from spiked sample in microfluidic chips

2.3.3 方法對(duì)比

傳統(tǒng)快速檢測(cè)方法一般采用的是快速檢測(cè)試劑盒結(jié)合分光光度計(jì)，法測(cè)定本文提出的方法是微流控芯片結(jié)合便攜式微流控速測(cè)儀。由表2可以看出，對(duì)比傳統(tǒng)快速檢測(cè)方法，微流控芯片可直接將檢測(cè)試劑預(yù)存儲(chǔ)在芯片上，無(wú)需現(xiàn)場(chǎng)配制溶液，且加樣后自動(dòng)完成整個(gè)檢測(cè)過(guò)程，操作簡(jiǎn)便。一次性扇形微流控芯片可以同時(shí)檢測(cè)3種指標(biāo)，檢測(cè)時(shí)間約為傳統(tǒng)快速檢測(cè)的1/4，極大地提高了檢測(cè)效率，縮短了檢測(cè)時(shí)間；樣本用量約為傳統(tǒng)快速檢測(cè)的1/4，試劑用量約為傳統(tǒng)快速檢測(cè)的1/8，但靈敏度與傳統(tǒng)的精密分光光度計(jì)相當(dāng)。

表2 微流控技術(shù)與傳統(tǒng)快速檢測(cè)方法的對(duì)比Table 2 Comparison between microfluidics and traditional rapid detection methods

3 結(jié)論

本文提出了一種用于水產(chǎn)品中甲醛、雙氧水和SO2現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)的微流控芯片方法，使用一次性的扇形高聚物微流控芯片，配合自行研制的便攜式微流控速測(cè)儀，可實(shí)現(xiàn)對(duì)水產(chǎn)品中甲醛、雙氧水和SO2的全自動(dòng)、高通量、低成本的快速檢測(cè)。微流控芯片具有以下顯著優(yōu)勢(shì)：(1)自動(dòng)化程度高，可直接將3種添加物檢測(cè)所需試劑預(yù)存儲(chǔ)于芯片內(nèi)部，無(wú)需現(xiàn)場(chǎng)配制溶液，且加樣后自動(dòng)完成整個(gè)檢測(cè)過(guò)程；(2)檢測(cè)效率高，每次可以同時(shí)檢測(cè)3種指標(biāo)，檢測(cè)時(shí)間僅為5 min；(3)樣本及試劑消耗量少，靈敏度較好；(4)使用高聚物PMMA為芯片基材，成本低，易批量生產(chǎn)。此外，基于本文提出的離心式流體控制技術(shù)，還可在同一張圓盤(pán)形微流控芯片上平行集成多個(gè)扇形結(jié)構(gòu)，有望實(shí)現(xiàn)一次性檢測(cè)多個(gè)樣本，提高檢測(cè)通量和效率。

在食品安全領(lǐng)域，微流控芯片不僅可用于食品中添加物的檢測(cè)，還可應(yīng)用于農(nóng)藥殘留[23-24]、獸藥殘留[28]、重金屬殘留[29]的監(jiān)控和各種生物毒素[30-32]的分析。目前，國(guó)內(nèi)的微流控芯片產(chǎn)品，主要是應(yīng)用于農(nóng)藥殘留、微生物致病菌的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)，產(chǎn)業(yè)應(yīng)用仍處于發(fā)展初期。隨著微流控芯片及配套儀器微型化、集成化、自動(dòng)化的迅猛發(fā)展，可以預(yù)料，在不久的將來(lái)它將成為食品安全領(lǐng)域分析檢測(cè)主要的研究手段之一。