趙莉邐，劉曉丹，PUREVDORJ Narangerel，王 然，李 蕾，孫續(xù)國

（天津醫(yī)科大學醫(yī)學檢驗學院臨床檢驗和血液教研室，天津300203）

轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白（transthyretin，TTR),是肝臟分泌的一種具有轉(zhuǎn)運甲狀腺素、視黃醇的功能性蛋白，是在老年性系統(tǒng)性淀粉樣變（senile systemic amyloidosis，SSA)[1]及家族型多發(fā)性神經(jīng)性損害（familial amyloidotic polyneuropathy，F(xiàn)AP)[2-3]等疾病淀粉樣變的前蛋白。通過分析SSA患者發(fā)生TTR相關(guān)淀粉樣變沉積組織特點[4]，發(fā)現(xiàn)淀粉樣變主要沉積于心臟組織[5-6]、中樞神經(jīng)[7]、血管壁等，但是這些組織細胞非均表達、分泌TTR蛋白[8-9]。大量研究表明SSA患者組織器官沉積的淀粉樣變的前蛋白成分為TTR蛋白[10-12]，由于TTR為機體內(nèi)存在的一

種生理蛋白，形成淀粉樣變后可以沉積于人體的組織器官導致器官損害及功能障礙。探究淀粉樣變相關(guān)蛋白的代謝修飾可能有助于解析SSA淀粉樣變形成的分子機制。前期本組利用基質(zhì)飛行質(zhì)譜技術(shù)（MALDI-TOF-MS）建立直接分析血液中TTR蛋白修飾的方法[13-14]，并且最近有報道ProteomeLab PF-2D技術(shù)分析蛋白等電點的變化[15-16]，利用兩項結(jié)合可以分析SSA患者TTR蛋白的化學修飾類型，輔助解析SSA患者形成淀粉樣變的分子機制。

1 材料與方法

1.1 患者標本收集 收集30位健康的志愿者以及經(jīng)臨床影像和病理診斷為SSA的患者的血清。

1.2 血清總蛋白、白蛋白、TRR定量 根據(jù)操作指導，應用TOSHBA-120RF全自動生化分析儀測定人血清總蛋白和白蛋白含量，用UniCelDxI 800來檢測血清TTR。

1.3 蛋白分離 首先，根據(jù)操作說明將高效聚焦層析柱用于蛋白質(zhì)分離。緩沖液以0.2 mL/min的流速平衡130 min，之后手動將樣本用注射器推入層析柱內(nèi)。在第一相中，蛋白與強陰離子交換劑交換，并從pH 8.5到4.0范圍內(nèi)進行連續(xù)洗脫。40～45 min后，pH開始下降。以間隔0.2個單位的pH值在48孔深孔板中收集蛋白。應用高效反相梯度分離蛋白，并在第二相將其分離。

1.4 免疫印跡法檢測TRR 將從層析柱中收集得到的蛋白溶解在2.0 μL溶液中，然后轉(zhuǎn)至硝酸纖維素薄膜上，并用兔抗人TTR抗體孵育1 h。應用抗兔第二抗體孵育結(jié)合后檢測結(jié)果。

1.5 檢測硫磺素（ThT）標記的淀粉樣纖維熒光強度 取5 μL血清，向其中加入200 μL 50 mmolThT緩沖液（pH 8.5,sigma），37°C孵育1 h后檢測。

1.6 利用 UPLC-Q-TOF/MS（Waters，America） 分析TTR蛋白的化學修飾[17]WatersACQUITYUPLC分系統(tǒng)，蛋白分離柱為BEH C18（2.1×100 mm，1.7 μm），利用 0.1%methanoic acid acetonitrile（solvent A）和0.1%methanoic acid（solvent B）試劑按照儀器操作說明仔細操作。質(zhì)譜用儀器內(nèi)標分子為：Leucineenk ephalin（LE），C28H37N5O7 TyrGlyGlyPheLeu（M+H）+M/Z 556.2771，（M-H）-M/Z 554.2615.[Glu1]-Fib rinopetideB（GluFib），C66H95N19O26GluGlyValAs nAspAs nGluGluGlyPhePheSerAlaArg，（M+H）+M/Z 1570.6774，（M+2H）2+M/Z 785.8426，（M-H）-M/Z 1568.6618ESI。

1.7 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 13.0軟件分析數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)用±s表示。兩組間均數(shù)比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床收集SSA患者的基礎(chǔ)資料 依據(jù)SSA臨床診治指南，收集SSA患者30例，同時收集年齡與性別相匹配的健康體檢志愿者30名。發(fā)現(xiàn)SSA患者與健康志愿者在3項指標中無顯著性差異（P＞0.05）。結(jié)果見表1。

表1 患者的臨床特征Tab 1 Clinical characteristics of patients

2.2 利用PF-2D系統(tǒng)分析SSA及志愿者人群血清各個pI區(qū)域的蛋白豐度 利用PF-2D分析系統(tǒng)，分選各個等電點的蛋白質(zhì)，兩項電解質(zhì)的pH分別為pH4.0及pH8.0。利用波長208 nm直接檢測蛋白的相對強度，以每0.2pH為一個樣品采集點，采集各個pI點的蛋白質(zhì)。SSA患者結(jié)果在pH8.1～pH8.0、pH 6.42范圍、pH 5.69范圍及pH 4.49范圍內(nèi)存在高蛋白豐度（圖 1a，b，c，d）。同樣分析方法分析健康志愿者，結(jié)果在 pH 8.1～pH 8.0，pH 6.51 范圍、pH6.18 范圍及 pH 4.49 范圍發(fā)現(xiàn)高豐度蛋白（圖 1a，b，c，d）。

2.3 進一步分析SSA及志愿者TTR蛋白的pI為分析各個pH值范圍內(nèi)可存在TTR蛋白，利用點免疫印跡的方法鑒定TTR的存在，結(jié)果在pH6.8-pH5.8范圍及pH 4.0-pH 4.5范圍發(fā)現(xiàn)高豐度TTR蛋白（圖 1）。

圖1使用ProteomeLab PF-2D系統(tǒng)對SAA患者和健康志愿者血清蛋白進行色譜分析Fig 1 Chromatographic analysis of serum proteins of SAA patients and healthy volunteers using ProteomeLab PF-2D

2.4 利用ThT測定各個部分收集液中淀粉樣變的強度 利用ThT熒光試劑為一種可以檢測淀粉樣變成分含量的一種特異性試劑，可以分析被檢測部分淀粉樣變成分的濃度，結(jié)果見表2，SSA患者pH6.40~pH6.60范圍內(nèi)，淀粉樣變成分顯著高于對照組。

表2 血清淀粉樣蛋白在每段pH范圍形成的熒光強度Tab 2 The fluorescence intensity of serum amyloid formation in each pH fraction

2.5 利用MALDI-TOT-MS分析TTR蛋白的化學修飾 對上述各個部分的TTR均進行質(zhì)譜分析，TTR蛋白發(fā)生的修飾類型結(jié)果見表3及圖2。對于利用質(zhì)譜技術(shù)解析TTR蛋白發(fā)生化學修飾類型及發(fā)生位點，其標記結(jié)果見圖3。

表3 血清TTR在每段pH范圍中的修飾Tab 3 The serum TTR modification in each pH fraction

圖2 SSA患者和健康志愿者的TTR修飾鑒定Fig 2 Identification of the TTR modification in those collected fraction in SSA patients and Healthy volunteers

圖3 TTR氨基酸位點修飾組化學結(jié)構(gòu)總結(jié)Fig 3 Summarizing chemical structure of the modified group in TTR amino acid sites

3 討論

TTR蛋白的野生型(w-TTR)及發(fā)生基因突變的突變型（m-TTR）均可發(fā)生淀粉樣變沉積，突變型TTR形成淀粉樣變沉積發(fā)生于FAP患者，并且在雜合子FAP患者中約50%沉積的淀粉樣變?yōu)閣-TTR，說明野生型TTR也能夠形成淀粉樣變沉積[10]。

最近有學者利用PF-2D系統(tǒng)分選蛋白，而淀粉樣變蛋白研究的難點是在分析過程中不能改變相關(guān)蛋白分子結(jié)構(gòu)，根據(jù)我們掌握的文獻，利用PF-2D分析淀粉樣變蛋白尚未見報道[18-19]，本論文依據(jù)蛋白pI的分選系統(tǒng)收集SSA患者及健康志愿者血清，確實發(fā)現(xiàn)在 pH 8.1～pH 8.0范圍、pH 6.8～pH 5.8范圍以及pH 4.0～pH 4.6范圍存在高豐度蛋白，這些蛋白是否存在TTR蛋白有待于進一步鑒定。

為進一步鑒定TTR蛋白存在的范圍，采用抗人TTR抗體，點免疫印跡的方法鑒定TTR蛋白存在的部分，結(jié)果在pH8.0～pH8.1范圍，SSA患者與志愿者人群均存在大量TTR蛋白。在pH 6.8～pH 5.8范圍及pH 4.0～pH 4.6范圍中，SSA患者與健康志愿者存在高豐度的pI發(fā)生改變，SSA患者在pH6.42范圍明顯增高，并且化學修飾類型發(fā)生改變，定量分析淀粉樣變沉積成分定量也發(fā)現(xiàn)明顯高于健康志愿者。SSA患者TTR與健康志愿者的TTR蛋白為w-TTR，即兩組TTR蛋白質(zhì)的氨基酸順序、類型沒有改變，兩組TTR蛋白的pI應當相同，造成已經(jīng)pI能夠分選TTR蛋白的理論基礎(chǔ)是TTR蛋白發(fā)生化學修飾，實驗結(jié)果也顯示TTR蛋白存在于不同的pH范圍之內(nèi)，說明TTR蛋白在人機體內(nèi)能夠發(fā)生化學修飾，以前也有報道TTR蛋白存在2個不同的pI，支持本實驗結(jié)果。

總結(jié)上述實驗發(fā)現(xiàn)SSA患者及健康志愿者血清TTR蛋白均存在化學修飾，但是SSA患者TTR蛋白在pI 6.42范圍發(fā)生修飾的類型與健康志愿者不同，且淀粉樣變成分含量顯著高于對照組，提示機體代謝過程中TTR蛋白可發(fā)生化學修飾，其修飾類型與淀粉樣變形成的相關(guān)性有待進一步研究。

（致謝感謝王卓偉在UPLC-MS/MS技術(shù)上的幫助）