李丹

（威海市立醫(yī)院南院區(qū)檢驗(yàn)科，威海264200）

多發(fā)性硬化癥（multiple sclerosis，MS）是一種以中樞神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘病變?yōu)橹鞯淖陨砻庖咝约膊?，常?jiàn)于歐美國(guó)家，中國(guó)發(fā)病率較低，為1/10萬(wàn)~2/10萬(wàn)[1]。MS確切的病因及發(fā)病機(jī)制尚未清楚。通常認(rèn)為，MS的發(fā)生與遺傳因素、自身免疫反應(yīng)及環(huán)境因素關(guān)系密切。主要病理改變是免疫活性細(xì)胞浸潤(rùn)、軸索損傷及髓鞘脫失，主要的臨床表現(xiàn)為進(jìn)行性神經(jīng)功能障礙，隨著病程的進(jìn)展，雙下肢癱瘓為絕大多數(shù)患者最終的結(jié)果。目前為止尚無(wú)根治MS的方法，常用的是激素治療和免疫抑制，可明顯緩解急性期和復(fù)發(fā)期的病程，但病損程度卻不能減輕，長(zhǎng)期療效也不肯定，且毒副作用很大。本文通過(guò)對(duì)31例MS患者靜脈血T淋巴細(xì)胞亞群及相關(guān)細(xì)胞因子含量的檢測(cè)，探討Th17細(xì)胞、Treg細(xì)胞在多發(fā)性硬化發(fā)病中的作用，為今后臨床治療多發(fā)性硬化提供新的方向。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2014年1月-2017年8月威海市立醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科門(mén)診及住院MS患者31例，男13例，女18例；平均年齡（37±11）歲，均符合 2005年修訂的Mcdonald診斷標(biāo)準(zhǔn)；正常對(duì)照組選自同期該院健康體檢者20例，平均年齡（38±12）歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）并發(fā)嚴(yán)重心、腦血管疾病，肝、腎功能不全；（2）急、慢性感染；（3）合并其他自身免疫性疾??；（4）應(yīng)用免疫調(diào)節(jié)劑、非甾體類抗炎藥物者；（5）腫瘤；（6）合并妊娠。

1.2 儀器與試劑 儀器采用美國(guó)BD FACSCalibur流式細(xì)胞儀，小鼠抗人熒光標(biāo)記的抗體、同型對(duì)照抗體小鼠IgG，流式微球芯片捕獲技術(shù)細(xì)胞因子試劑盒均購(gòu)自美國(guó)BD公司；小鼠抗人IL-17-FITC購(gòu)自eBiocience公司；淋巴細(xì)胞分離液、佛波酯乙醇、離子霉素、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑莫能霉素購(gòu)自Sigma公司。

1.3 標(biāo)本采集 31例門(mén)診及住院MS患者初診和潑尼松治療4周后均清晨空腹采集肘靜脈血標(biāo)本5 mL于肝素鈉抗凝管中，3 mL血標(biāo)本用于分離外周血單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)，2 mL血標(biāo)本離心后留取血漿于EP管中保存在-80°C低溫冰箱中用于檢測(cè)細(xì)胞因子，隨機(jī)抽取20名同期健康體檢人員采集相應(yīng)血液標(biāo)本作為對(duì)照檢查。

1.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè) T淋巴細(xì)胞亞群加入等體積PBS稀釋靜脈血，采用淋巴細(xì)胞分離液分離單個(gè)核細(xì)胞。加入10 mg/L的布雷菲德菌素A、1 mg/L的離子霉素和0.02 mg/L的佛波酯，37℃培養(yǎng)箱孵育4 h。3 000 r/min離心5 min，棄去上清液收集細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×106/mL，取細(xì)胞懸液300 μL，按淋巴細(xì)胞亞群配對(duì)方案分別加入10 μL熒光標(biāo)記mAbCD4-APC、CD8-PercP，室溫避光孵育30 min，4%多聚甲醛固定20 min，加破膜緩沖液作用10 min。按組合方案加入相應(yīng)的小鼠抗人mAbIFN-γ-FITC、IL-4-PE、IL-17-FITC、FOXP3-PE，室溫避光孵育30 min，PBS充分洗滌，1%多聚甲醛固定，上機(jī)檢測(cè)，每份標(biāo)本采集的細(xì)胞數(shù)≥20 000個(gè)，采用Cell Quest分析。

1.5 流式微球芯片捕獲技術(shù)（CBA）檢測(cè)血漿細(xì)胞因子 通過(guò)BD FACSComp軟件設(shè)置FCM的基本參數(shù)，按照試劑盒中細(xì)胞因子標(biāo)準(zhǔn)品梯度法依次稀釋成以下 8 個(gè)濃度：1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128和1∶256，加上陰性對(duì)照和最高濃度繪制各細(xì)胞因子標(biāo)準(zhǔn)曲線。待測(cè)血漿1 500 r/min離心5 min，吸取50μL上清液于待測(cè)管中，加入5種捕獲微球混合物 50 μL，孵育 1 h，再加入 50 μL PE 檢測(cè)試劑，室溫避光孵育2 h。加入1 mL洗液，1 500 r/min離心5 min，棄上清，加入300μL洗液上機(jī)，使用CellQuest檢測(cè)。將標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)樣品捕獲數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)入BD FCAP Array軟件，繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，分析待測(cè)樣品的細(xì)胞因子 IFN-γ、TNF-α、IL-17A、IL-4、IL-10 含量。

2 結(jié)果

2.1 3組外周血T淋巴細(xì)胞亞群與正常組比較 MS組Th1細(xì)胞和Th17細(xì)胞均明顯升高（P＜0.05）；Treg細(xì)胞和TC1細(xì)胞顯著下降（P＜0.01），Th17/Treg比例明顯升高（P＜0.01）；與 MS 組比較，潑尼松組 Tc1、Tc2和Treg細(xì)胞百分率均明顯升高（P＜0.01），而Th1和 Th17細(xì)胞顯著下降（P＜0.05)，Th17/Treg比值降低（P＜0.01）（表 1，圖 1）。

2.2 血漿細(xì)胞因子的變化與正常組比較 MS組IFN-γ 和 IL-17A 含量升高（P＜0.05；P＜0.01），IL-4 和IL-10含量明顯降低（P＜0.01）；與 MS組比較，潑尼松組IL-17A含量明顯降低（P＜0.01），IL-4和IL-10均顯著升高（P＜0.01）（表 2）。

表1 3組外周血T淋巴細(xì)胞亞群的變化（±s）Tab 1 Changes of T lymphocyte subsets in peripheral blood of patients in three groups（±s）

表1 3組外周血T淋巴細(xì)胞亞群的變化（±s）Tab 1 Changes of T lymphocyte subsets in peripheral blood of patients in three groups（±s）

▲：P＜0.01,vs正常組；#：P＜0.05，*：P＜0.01，vsMS 組

組別T淋巴細(xì)胞亞群/% Th1/Th2 Th17/Treg Th1 Th2 Th17 Treg TC1 TC2正常組 0.54±0.27 1.96±0.44 3.12±1.67 35.04±4.21 3.39±1.42 4.57±1.87 0.36±0.12 0.10±0.02 MS 組 1.57±0.20▲ 1.84±0.36 15.24±2.54▲ 10.12±4.13▲ 0.62±0.18▲ 3.35±1.31 0.91±0.33 1.51±0.62▲潑尼松組 0.70±0.30# 1.13±0.39 6.12±2.04# 29.52±12.01* 2.97±0.69* 13.70±7.22* 0.61±0.97 0.19±0.07*

圖1 3組外周血淋巴細(xì)胞亞群FCM圖Fig 1 Phenotype of lymphocyte subsets analyzed by FCM in three groups

表 2 3 組血漿細(xì)胞因子的含量（±s，pg/mL）Tab 2 Concentrations of plasma cytokines in three groups（±s，pg/mL）

表 2 3 組血漿細(xì)胞因子的含量（±s，pg/mL）Tab 2 Concentrations of plasma cytokines in three groups（±s，pg/mL）

▲：P＜0.05，&：P＜0.01，vs正常組；*：P＜0.01，vsMS 組

組別 Th1型細(xì)胞因子 Th2型細(xì)胞因子 Th17型細(xì)胞因子IFN-γ TNF-α IL-10 IL-4 IL-17A正常組 8.53±1.42 378.21±283.72 36.65±15.41 13.07±7.24 22.53±2.26 MS 組 17.54±4.20▲ 241.03±132.40 12.10±10.21& 3.83±1.10& 269.97±75.93&潑尼松組 12.40±1.30 211.04±110.45 66.45±14.31* 9.20±1.93* 50.63±8.62*

3 討論

過(guò)去普遍認(rèn)為，Th1細(xì)胞活性異常升高是MS的重要免疫發(fā)病機(jī)制，MS是由Th1細(xì)胞介導(dǎo)的。近年來(lái)，Th17細(xì)胞成為免疫學(xué)研究的熱點(diǎn)，研究發(fā)現(xiàn)其在自身免疫性疾病發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮重要作用[1-2]。Th17細(xì)胞是一類獨(dú)立的CD4+T細(xì)胞，因活化后可以產(chǎn)生IL-17而得名，IL-17是早期產(chǎn)生的具有廣泛生物學(xué)活性的炎性細(xì)胞因子，Th17細(xì)胞同時(shí)也分泌IL-21、IL-22、IL-26、IL-29和 TNF-α 等，這些細(xì)胞因子可以誘導(dǎo)促炎性細(xì)胞因子、趨化因子和基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)，引起組織細(xì)胞炎性浸潤(rùn)和組織破壞[3]，進(jìn)而引起自身免疫性疾病的發(fā)生。已有研究證明在MS患者病灶中IL-17轉(zhuǎn)錄上調(diào)，且腦脊液中IL-17表達(dá)明顯高于正常對(duì)照組[4]。國(guó)內(nèi)研究已證明在多發(fā)性硬化動(dòng)物模型 EAE（experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE） 大鼠外周血中CD4+IL-17+（Th17）細(xì)胞亞群百分率明顯升高，且在EAE模型組腦和脊髓組織呈現(xiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，有血管套形成[5-6]。

本研究中MS患者靜脈血中Th1和Th17細(xì)胞亞群百分率明顯升高，而Treg細(xì)胞百分比顯著降低，且Th17/Treg比例也明顯升高。有研究報(bào)道，F(xiàn)oxP3+Treg可以調(diào)節(jié)機(jī)體對(duì)外源性抗原免疫反應(yīng)的程度，其功能失調(diào)與多種疾病密切相關(guān)如自身免疫性疾病、過(guò)敏性疾病、感染性疾病等[7-8]。正常情況下，Th17和FoxP3+Treg細(xì)胞之間相互拮抗、制約，維持兩者的生理平衡是機(jī)體抗感染免疫和自身免疫耐受的重要機(jī)制。通過(guò)本實(shí)驗(yàn)推測(cè)，MS的發(fā)生與Th17/Treg比例失衡關(guān)系密切。因此探討靶向抑制Th17細(xì)胞和調(diào)節(jié)FoxP3+Treg細(xì)胞是目前自身免疫性疾病重要的免疫治療方向。目前，臨床上治療多發(fā)性硬化大多應(yīng)用激素和非特異性的免疫抑制劑，本實(shí)驗(yàn)中潑尼松治療組Tc1、Tc2和Treg細(xì)胞百分率均明顯升高，而Th1和Th17細(xì)胞顯著下降，Th17/Treg比值降低；IL-17A含量明顯降低，IL-4和IL-10均顯著升高，在一定程度上可以緩解MS的癥狀，但是毒副作用較大,不適合長(zhǎng)期使用，因此，尋找靶向免疫調(diào)節(jié)Th17/Treg失衡可能是今后臨床治療MS的新希望。已有研究報(bào)道，干細(xì)胞不僅具有自我復(fù)制及定向分化的功能，更能發(fā)揮巨大的免疫調(diào)節(jié)功能，間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）治療實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE） 模型具有明顯的效果，主要是MSCs抑制T淋巴細(xì)胞增殖，下調(diào)Th1和Th17，上調(diào)Th2和Treg細(xì)胞，糾正Th1/Th2、Th17/Treg失衡，機(jī)制可能主要與其抑制炎性細(xì)胞因子及促進(jìn)抗炎細(xì)胞因子分泌密切相關(guān)[9-13]。國(guó)內(nèi)也已有研究證實(shí)人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞、人羊膜上皮細(xì)胞，可以下調(diào)Th17細(xì)胞的表達(dá)，上調(diào)FoxP3+Treg細(xì)胞的表達(dá)，糾正Th17/Treg失衡[5-6]。

在免疫系統(tǒng)中，各類細(xì)胞因子相互協(xié)同或制約發(fā)揮著重要的免疫調(diào)節(jié)作用，本文通過(guò)檢測(cè)Th1和Th2型細(xì)胞因子發(fā)現(xiàn)，MS組Th1型細(xì)胞因子IFN-γ含量均明顯高于正常組，Th2型細(xì)胞因子IL-10和IL-4則明顯降低，推測(cè)通過(guò)調(diào)節(jié)Th1/Th2型細(xì)胞因子的平衡也是減輕MS免疫損傷的重要機(jī)制之一。本實(shí)驗(yàn)采用CBA方法檢測(cè)血漿細(xì)胞因子含量，與傳統(tǒng)的ELISA和Western blot技術(shù)相比，該種方法不僅標(biāo)本用量少，檢測(cè)速度更快，結(jié)果更精準(zhǔn)，靈敏度更高，值得臨床研究及實(shí)驗(yàn)室廣泛應(yīng)用。同時(shí)，本研究由于樣本量較少也存在一定的局限性，今后的研究中要增加臨床樣本量，降低結(jié)果的誤差。本實(shí)驗(yàn)推測(cè)，MS的發(fā)生與Th17/Treg比例失衡和Th1/Th2型細(xì)胞因子的失衡關(guān)系密切，但在MS的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中具體通過(guò)什么途徑促使Th17表達(dá)上調(diào)，Treg表達(dá)下調(diào)，還不完全清楚，是今后研究的重點(diǎn)內(nèi)容，此外TC1和TC2淋巴細(xì)胞亞群在MS中意義尚不清楚，值得進(jìn)一步探討。