蒲 艷，劉曉東，阿爾祖古麗·塔什，魏 倩，劉 超

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 烏魯木齊 830052)

番茄屬于茄科，在2012年完成了番茄全基因組測(cè)序，其具有較完整的遺傳轉(zhuǎn)化體系，這使得番茄成為一個(gè)可以很好地運(yùn)用于科學(xué)研究的模式之物。然而，由于缺乏有效的突變體遺傳材料，筆者對(duì)這些基因或DNA片段的作用或功能卻知之甚少。為了從大量的數(shù)據(jù)中更好地了解基因的功能，迫切需要新的基因編輯技術(shù)來滿足日益增長的科研需求；同時(shí)，通過基因編輯技術(shù)培育具有優(yōu)良性狀的農(nóng)作物可以在一定程度上解決農(nóng)作物的轉(zhuǎn)基因問題。

近幾年，基因編輯技術(shù)成為生物學(xué)研究的熱點(diǎn)，其主要包括鋅指核酸酶(Zinc-finger nucleases, ZFNs)[1]、TALEN核酸酶(Transcription activator like effector nucleases, TALENs)[2]、CRISPR/Cas(規(guī)律成簇間隔短回文重復(fù)序列clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein)[3]3種技術(shù)體系。而Type Ⅱ的CRISPR/Cas9系統(tǒng)作為一項(xiàng)新型的基因組編輯技術(shù)，是繼ZFNs及TALEN后在作物基因功能組學(xué)研究領(lǐng)域新進(jìn)的一個(gè)基因打靶系統(tǒng)，其載體構(gòu)建簡單，特異性高，據(jù)報(bào)道已成功地在許多不同的物種中實(shí)現(xiàn)了基因的定點(diǎn)編輯[4-12]。CRISPR/Cas9系統(tǒng)中，行使向?qū)Чδ艿氖怯蓆racrRNA與crRNA分子間形成的RNA二元復(fù)合體改造的單鏈RNA嵌合體sgRNA，其招募Cas9核酸酶對(duì)靶位點(diǎn)進(jìn)行切割，切割位點(diǎn)于PAM位點(diǎn)上游3～4個(gè)堿基處，PAM序列為緊鄰靶位點(diǎn)的5′-NGG-3′。而U3啟動(dòng)子是CRISPR/Cas9系統(tǒng)中重要的元件之一，能驅(qū)動(dòng)sgRNA的轉(zhuǎn)錄。在植物中，U3和U6啟動(dòng)子由RNA聚合酶Ⅲ轉(zhuǎn)錄，其具有非常明確的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，并且轉(zhuǎn)錄活性較高，U3啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)為A，U6啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)為G，明確的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)在CRISPR/Cas9系統(tǒng)靶序列的設(shè)計(jì)及構(gòu)建更加精確[13-14]，同時(shí)可以保證不會(huì)有多余的序列被轉(zhuǎn)錄出來，在sgRNA靶向基因組模板時(shí)，也可以提高特異性，從而減少脫靶的現(xiàn)象[15-16]，如Shan等[12]利用水稻內(nèi)源U3啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)sgRNA轉(zhuǎn)錄，成功在水稻中實(shí)現(xiàn)了PDS和DEP1基因的編輯。Liang等[9]克隆了玉米U3啟動(dòng)子，并成功在玉米原生質(zhì)體中實(shí)現(xiàn)了內(nèi)源基因ZmIPK的編輯。雖然目前有關(guān)U3啟動(dòng)子的CRISPR/Cas9系統(tǒng)在許多物種中已經(jīng)得到了應(yīng)用，但相同的U3啟動(dòng)子在同緣關(guān)系較遠(yuǎn)的物種中不一定適用，并且目前未見適用于番茄的內(nèi)源U3啟動(dòng)子的報(bào)道，篩選出在番茄葉片中有功能活性的U3啟動(dòng)子很有必要。USE和TATA框是真核生物中U3啟動(dòng)子發(fā)揮轉(zhuǎn)錄功能的2個(gè)重要元件，本研究通過對(duì)候選的3種U3啟動(dòng)子與擬南芥U3啟動(dòng)子序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)番茄的U3啟動(dòng)子內(nèi)也含有非常保守的2個(gè)元件，但它們是否均具有轉(zhuǎn)錄活性還需進(jìn)一步驗(yàn)證。

本研究從番茄中蔬四號(hào)中克隆了3種6個(gè)不同長度的U3啟動(dòng)子，再利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法侵染番茄葉片，通過GUS染色對(duì)其轉(zhuǎn)錄活性進(jìn)行分析，篩選出活性較高的U3啟動(dòng)子，旨在為構(gòu)建番茄CRISPR/Cas9基因編輯載體提供更多高效的內(nèi)源啟動(dòng)子。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用中蔬四號(hào)番茄品種、農(nóng)桿菌GV3101均由新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室保存。限制性內(nèi)切酶購于Thermo公司；克隆感受態(tài)細(xì)胞Trans5α、Blunt Zero平端載體、T4DNA連接酶、1 kb Plus DNA Ladder、植物基因組DNA提取試劑盒、膠回收試劑盒等均購自北京全式金生物技術(shù)公司；PhusionDNA聚合酶購于北京NEB公司；引物合成和測(cè)序由上海杰李生物科技有限公司完成。

1.2 番茄SlU3-1P、SlU3-3P、SlU3-4P啟動(dòng)子的克隆

將中蔬四號(hào)番茄品種播種于含蛭石和營養(yǎng)土的土壤中，取生長21～28 d番茄幼苗葉片，采用植物基因組DNA提取試劑盒提取番茄基因組DNA，用保守的U3 RNA序列在番茄基因組數(shù)據(jù)庫中搜索候選U3 RNA對(duì)應(yīng)的U3啟動(dòng)子序列。本研究采用2輪PCR的方法，以番茄基因組DNA為模板設(shè)計(jì)引物(表1)，第1輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為SlU3-1P、SlU3-3P、SlU3-4P啟動(dòng)子全長，用PhusionDNA 聚合酶進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃ 4 min；98 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min 30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 8 min。反應(yīng)體系為5×Phusion Buffer 4 μL；2.5 mmol/L dNTP 1.6 μL；ddH2O 11 μL；上下游引物各1 μL；Phusion超保真DNA 聚合酶0.4 μL；DNA模板1 μL；共20 μL體系。

第2輪擴(kuò)增的受體質(zhì)粒為GhU6-5P2::GUS，供體質(zhì)粒為SlU3-1P、SlU3-3P、SlU3-4P啟動(dòng)子進(jìn)行Transfer PCR[17]，根據(jù)第1輪測(cè)序正確的SlU3-1P、SlU3-3P、SlU3-4P啟動(dòng)子序列和GhU6-5P2::GUS載體序列分別設(shè)計(jì)了2對(duì)引物(表1)。使用超保真DNA 聚合酶進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃ 1 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 1 min，72 ℃ 90 s，13個(gè)循環(huán)；94 ℃ 30 s，67 ℃ 1 min，72 ℃ 4 min，20個(gè)循環(huán)；72 ℃ 8 min。反應(yīng)體系為5×Phusion Buffer 10 μL；2.5 mmol/L dNTP 2.5 μL；上下游引物各1 μL；供體質(zhì)粒和受體質(zhì)粒模板各1 μL；ddH2O 32.7 μL；Phusion超保真DNA 聚合酶0.8 μL；共50 μL體系。通過瓊脂糖凝膠電泳對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行分析，對(duì)分析正確的PCR產(chǎn)物用DpnⅠ在37 ℃進(jìn)行酶切處理3 h，取酶切產(chǎn)物10 μL轉(zhuǎn)化Trans5α感受態(tài)細(xì)胞，用BglⅡ和NotⅠ雙酶切鑒定SlU3-1P重組質(zhì)粒，XhoⅠ和NotⅠ雙酶切鑒定SlU3-3P重組質(zhì)粒，NsiⅠ和NotⅠ雙酶切鑒定SlU3-4P重組質(zhì)粒，酶切鑒定后選取正確的質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序正確的質(zhì)粒命名為T-SlU3-Ps。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

注：下劃線部分為受體質(zhì)粒堿基序列。

Note：Underlined for the acceptor plasmid partial base sequence.

1.3 SlU3啟動(dòng)子序列分析

運(yùn)用 DNAMAN 軟件對(duì)候選的番茄U3啟動(dòng)子與擬南芥U3啟動(dòng)子進(jìn)行序列比對(duì)，對(duì)候選的U3啟動(dòng)子內(nèi)功能元件進(jìn)行分析。

1.4 不同截短SlU3Ps∷GUS-sgRNA-P1300融合表達(dá)載體的構(gòu)建

用KpnⅠ和HindⅢ雙酶切植物表達(dá)載體 pCAM-BIA 1300及SlU3-1P、SlU3-3P、SlU3-4P后分別回收目標(biāo)片段并用T4連接酶連接、轉(zhuǎn)化后對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，鑒定正確的質(zhì)粒命名為SlU3∷GUS-sgRNA-P1300，轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞GV3101后，于28 ℃倒置培養(yǎng)2 d，挑取陽性克隆于LB培養(yǎng)基中(含 Rif 25μg/mL和Kan 50μg/mL)培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期。不同SlU3Ps∷GUS-sgRNA-P1300 融合表達(dá)載體示意圖如圖1所示。

1.5 農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)染番茄葉片

將構(gòu)建成功的不同SlU3-P∷GUS-P1300以及陽性對(duì)照P1301和陰性對(duì)照pCAMBIA1300農(nóng)桿菌，按照1∶100比例接種于LB培養(yǎng)基(含50 μg/mL Kan和25 μg/mL Rif)中180 r/min，28 ℃至菌液OD600=1時(shí)，分別吸取菌液到5 mL LB培養(yǎng)基(含50 μg/mL Kan和25 μg/mL Rif)中，每個(gè)菌液的OD值相同后，再次28 ℃, 180 r/min至所有菌液的OD600=1.5，12 000 r/min離心5 min收集菌體于重懸Buffer(50 mmol/L MgCl2、200 mmol/L MES、20 mmol/L乙酰丁香酮)至1 mL，室溫放置3 h后分別注射到生長21 d的番茄子葉中，最后進(jìn)行過夜暗培養(yǎng)。

圖1 不同截短SlU3-Ps啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)報(bào)告基因GUS的融合表達(dá)載體構(gòu)建Fig.1 Construction of GUS reporter gene fusion expression vector driven by different truncated SlU3-Ps promoter

1.6 不同截短SlU3-Ps∷GUS在番茄葉片中的瞬時(shí)表達(dá)分析

剪下暗培養(yǎng)過夜后的番茄葉片浸泡在150 μLGUS染液中(0.5 mol/L EDTA, pH值8.0；0.5 mol/L磷酸緩沖液, pH值7.0；20 mmol/L X-Gluc；10% Triton X-100),-0.05 MPa下抽真空30 min。抽完真空后置于37 ℃，180 r/min振蕩染色6～7 h后100 r/min離心1 min吸取上清GUS染液。為徹底去除殘留的GUS染液，用蒸餾水漂洗染色后的葉片4～5次，100 r/min 離心1 min。染色完成后加入300 μL無水乙醇進(jìn)行脫色處理，每3～4 h更換一次脫色液，直至葉片呈透明狀。

2 結(jié)果與分析

2.1 第1輪SlU3-1P、SlU3-3P、SlU3-4P啟動(dòng)子擴(kuò)增產(chǎn)物鑒定

從中蔬四號(hào)番茄中成功擴(kuò)增出SlU3-1P、SlU3-3P、SlU3-4P啟動(dòng)子片段，長度分別為1 156，1 114，1 147 bp(圖2)。用BglⅡ和NotⅠ雙酶切鑒定SlU3-1P重組質(zhì)粒，XhoⅠ和NotⅠ 雙酶切鑒定SlU3-3P重組質(zhì)粒，NsiⅠ和NotⅠ雙酶切鑒定SlU3-4P重組質(zhì)粒，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果正確，最終測(cè)序比對(duì)后為預(yù)期的SlU3-1P、SlU3-3P、SlU3-4P啟動(dòng)子。

M.2 kb PlusⅡ標(biāo)準(zhǔn)分子量；1.SlU3-1P,1 156 bp；2.SlU3-3P,1 114 bp；3.SlU3-4P,1 147 bp。M.2 kb PlusⅡDNA Marker; 1.SlU3-1P,1 156 bp; 2.SlU3-3P,1 114 bp; 3.SlU3-4P,1 147 bp.

2.2 Transfer PCR擴(kuò)增產(chǎn)物鑒定

以測(cè)序正確的第1輪SlU3-1P、SlU3-3P、SlU3-4P為供體質(zhì)粒，GhU6-5P2∷GUS受體質(zhì)粒進(jìn)行Transfer PCR，其目的是將受體質(zhì)粒GhU6-5P2∷GUS啟動(dòng)子片段置換為SlU3∷GUS-sgRNA片段。圖3為成功克隆的不同截短的T-SlU3-1P4f、T-SlU3-1P5f、T-SlU3-3P4f、T-SlU3-3P5f、T-SlU3-4P4f、T-SlU3-4P5f啟動(dòng)子電泳圖，其片段大小依次是489，318，450，248，457，248 bp。用MfeⅠ和Hind Ⅲ分別雙酶切鑒定各截短啟動(dòng)子質(zhì)粒，電泳后發(fā)現(xiàn)，酶切結(jié)果與預(yù)測(cè)片段大小一致，測(cè)序比對(duì)后為預(yù)期截短的T-SlU3Ps啟動(dòng)子(圖3)。

A、B、C．Transfer PCR擴(kuò)增；M. 2 kb PlusⅡ DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量；A: 1.T-SlU3-1P4f；2.T-SlU3-1P5f; B: 1.T-SlU3-3P4f；2.T-SlU3-3P5f；C: 1.T-SlU3-4P4f；2.T-SlU3-4P5f；圖中小片段為第1階段擴(kuò)增的SlU3啟動(dòng)子，大片段為第2階段擴(kuò)增產(chǎn)物。D.酶切鑒定: 1.T-SlU3-1P5；2.T-SlU3-3P5；3.T-SlU3-3P4；4.T-SlU3-4P5；5.T-SlU3-4P4；6.T-SlU3-1P4.

A,B,C.Transfer PCR amplificaton;M. 2 kb PlusⅡDNA Marker; A: 1.T-SlU3-1P4f;2.T-SlU3-1P5f;B:1.T-SlU3-3P4f;2.T-SlU3-3P5f; C:1.T-SlU3-4P4f;2.T-SlU3-4P5f;The small fragment in the figure is the first-stage amplifiedSlU3 promoter, and the large fragment is the second-stage amplification product.D. Identification: 1.T-SlU3-1P5; 2.T-SlU3-3P5; 3.T-SlU3-3P4;4.T-SlU3-4P5; 5.T-SlU3-4P4; 6.T-SlU3-1P4.

圖3三種番茄U3啟動(dòng)子的TransferPCR擴(kuò)增及酶切鑒定
Fig.3TransferPCRamplificationandidentificationofthreekindsoftomatoU3promoters

2.3 SlU3啟動(dòng)子序列分析

對(duì)本研究已克隆的3種番茄U3啟動(dòng)子和擬南芥U3啟動(dòng)子進(jìn)行序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)番茄U3啟動(dòng)子區(qū)域包含RNA聚合酶Ⅲ轉(zhuǎn)錄所需要的元件，位于-30 bp的TATA框和位于-60 bp的USE元件5′-RTCCCA CATCG-3′，圖中方框?yàn)閁SE和TATA框，黑色箭頭處為U3 RNA的起始位點(diǎn)(圖4)。

圖4 SlU3啟動(dòng)子序列分析Fig.4 Sequence analysis of SlU3 promoters

2.4 不同截短SlU3Ps∷GUS-sgRNA-P1300融合表達(dá)載體構(gòu)建

將正確的番茄不同截短SlU3Ps∷GUS-sgRNA的重組質(zhì)粒片段連入植物表達(dá)載體pCAMBIA1300，用KpnⅠ和HindⅢ分別對(duì)不同SlU3Ps∷GUS-sgRNA-P1300重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，酶切的結(jié)果和預(yù)測(cè)片段大小一致(圖5)。

A: M.1 kb DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量；1.SlU3-1P4∷GUS-sgRNA-P1300；2.SlU3-3P4∷GUS-sgRNA-P1300；3.SlU3-1P5∷GUS-sgRNA-P1300；4.SlU3-3P5∷GUS-sgRNA-P1300；B：M.2 kb plusⅡ標(biāo)準(zhǔn)分子量；1.SlU3-4P4∷GUS-sgRNA-P1300；2.SlU3-4P5∷GUS-sgRNA-P1300。A：M.1 kb DNA Marker;1.SlU3-1P4∷GUS-sgRNA-P1300; 2.SlU3-3P4∷GUS-sgRNA-P1300; 3.SlU3-1P5∷GUS-sgRNA-P1300;4.SlU3-3P5∷GUS-sgRNA-P1300;B：M.2 kb plusⅡ DNA Marker; 1.SlU3-4P4∷GUS-sgRNA-P1300; 2.SlU3-4P5∷GUS-sgRNA-P1300.

2.5 不同截短SlU3啟動(dòng)子功能分析

將構(gòu)建好的不同截短SlU3Ps∷GUS-sgRNA-P1300，陰性對(duì)照pCAMBIA1300及陽性對(duì)照pCAMBIA1301通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法注射番茄葉片。通過GUS組織化學(xué)染色分析結(jié)果顯示，侵染成功后的番茄葉片均被染成藍(lán)色，其表明已克隆的6種SlU3啟動(dòng)子均能驅(qū)動(dòng)報(bào)告基因GUS的表達(dá)，但其表達(dá)水平存在一定差異(圖6)。

圖6 番茄不同截短SlU3啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)GUS在番茄葉片中的瞬時(shí)表達(dá)Fig.6 Transient expression of GUS in tomato leaves driven by different truncated SlU3 promoters in tomato

3 討論

Ⅱ型CRISPR/Cas9基因組編輯系統(tǒng)作為一項(xiàng)全新的基因組定點(diǎn)修飾技術(shù)，近幾年已被成功地應(yīng)用于不同植物中，能實(shí)現(xiàn)在基因組特定位點(diǎn)的修飾。在基因組編輯的過程中，sgRNA能夠靶向結(jié)合到目的基因位點(diǎn)，與CRISPR/Cas9系統(tǒng)的特異性相關(guān)[18]。其中U3啟動(dòng)子是重要組成成分之一，被廣泛用于驅(qū)動(dòng)sgRNA的轉(zhuǎn)錄。U3啟動(dòng)子具有非常明確的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(A)且序列較短，其在生物體內(nèi)驅(qū)動(dòng)的U3 snRNA序列非常保守。依據(jù)這些信息U3啟動(dòng)子可以被精確的克隆。在真核生物體內(nèi)存在多種U3啟動(dòng)子，每個(gè)啟動(dòng)子是否均具有轉(zhuǎn)錄活性并不清楚。雖然有關(guān)U3啟動(dòng)子的CRISPR/Cas9系統(tǒng)已在許多物種中得到了應(yīng)用，但同樣的U3啟動(dòng)子在同緣關(guān)系較遠(yuǎn)的物種中不一定適用[19]，并且目前番茄內(nèi)源U3啟動(dòng)子的研究還未見報(bào)道，因此，篩選出在番茄中具有功能活性的U3啟動(dòng)子很有必要。另外,雖然劉曉東課題組已克隆了番茄的U6啟動(dòng)子，并且利用該啟動(dòng)子將番茄內(nèi)源基因成功地實(shí)現(xiàn)了編輯，建立了番茄的CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)體系。但由于研究的需要，如研究一個(gè)基因家族的功能、多基因控制的復(fù)雜數(shù)量性狀的研究、單個(gè)基因多位點(diǎn)編輯以及長基因片段的刪除，都需要克隆出更多U3或U6啟動(dòng)子，用于構(gòu)建多位點(diǎn)基因編輯載體。如擬南芥PYL和水稻FTL基因家族成員的多基因敲除，都使用了植物內(nèi)源多種U3和U6啟動(dòng)子[16]。

番茄中至少含有4個(gè)U3啟動(dòng)子，本課題組克隆的3個(gè)U3啟動(dòng)子，將它們和擬南芥U3啟動(dòng)子進(jìn)行序列比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)番茄U3啟動(dòng)子區(qū)域包含RNA聚合酶Ⅲ轉(zhuǎn)錄所需要的USE元件和TATA框[20]，且這2個(gè)元件的序列非常保守、它們之間的距離也比較固定，則推測(cè)番茄U3啟動(dòng)子也同樣具有轉(zhuǎn)錄活性。為了方便構(gòu)建CRISPR/Cas9基因組編輯載體，所用的U3啟動(dòng)子對(duì)其轉(zhuǎn)錄活性和長度上都有很高的要求，因此，有必要克隆長度適宜且活性較高的番茄U3啟動(dòng)子。本研究通過番茄不同U3啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)GUS報(bào)告基因，并通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法瞬時(shí)轉(zhuǎn)化番茄葉片來驗(yàn)證其功能活性。通過GUS組織化學(xué)染色分析結(jié)果顯示，侵染成功后的番茄葉片均被染成藍(lán)色，表明克隆的6種U3啟動(dòng)子均能驅(qū)動(dòng)報(bào)告基因GUS的表達(dá)，都具有轉(zhuǎn)錄活性，當(dāng)這3種啟動(dòng)子截短到300 bp左右，甚至是250 bp以內(nèi)的長度時(shí)，仍然能驅(qū)動(dòng)報(bào)告基因GUS的表達(dá)。這顯示出番茄的U3啟動(dòng)子也相對(duì)較短，與在其他作物中克隆的U3啟動(dòng)子特點(diǎn)相同[21]。這些啟動(dòng)子進(jìn)一步截短后是否還具有轉(zhuǎn)錄活性，為了構(gòu)建多位點(diǎn)基因編輯載體，也需要在后續(xù)的工作中對(duì)進(jìn)一步截短的啟動(dòng)子的功能進(jìn)行研究。本研究克隆的啟動(dòng)子可為后期在番茄中建立高效的CRISPR/Cas9基因組編輯載體提供更多適用于驅(qū)動(dòng)sgRNA的啟動(dòng)子。