譚太龍，馮 韜，羅海燕，彭 燁，劉睿洋，官春云

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，國(guó)家油料改良中心湖南分中心, 湖南 長(zhǎng)沙 410128)

磷脂二酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶(Phospholipids: diacylglycerol acyltransferase, PDAT1)是催化合成TAG的重要酶，在不依賴(lài)?；?CoA 的三酰甘油合成代謝途徑中催化最后一個(gè)反應(yīng)。擬南芥dgat1-1背景下干擾PDAT1表達(dá)或pdat1-1 背景下干擾DGAT1表達(dá)，種子含油量下降70%～80%，且均導(dǎo)致胚胎無(wú)法正常發(fā)育。目前,還沒(méi)有獲得dgat1-1×pdat1-2雙純和突變體。這些結(jié)果表明，PDAT1 在擬南芥TAG 生物合成中與DGAT1功能重疊[1]。轉(zhuǎn)過(guò)表達(dá)載體35S-AtPDAT1，擬南芥中根和葉的PDAT活性與PDAT的一致，表明其編碼的蛋白為 PDAT1。AtPDAT1可以利用碳鏈從 10 到 22的磷脂作為?；w，當(dāng)?；w含有羥基、雙鍵或環(huán)氧時(shí)酶活性最高。過(guò)表達(dá)AtPDAT1 17 d的擬南芥突變體幼苗中脂肪酸和總脂含量與野生型差異不明顯[2]。Mhaske 等[3]分離得到1個(gè)pdat突變體，它的PDAT上插入1個(gè) T-DNA，種子TAG含量和脂肪酸組成與野生型差異同樣不明顯，表明PDAT 并不是種子合成 TAG的決定酶，應(yīng)從PDAT基因突變體其他組織中尋找表型差異。

過(guò)表達(dá)AtPDAT(At5g13640)，發(fā)現(xiàn)擬南芥 7 周大的突變體蓮座葉TAG含量比野生型提高了 28 倍，導(dǎo)致油滴通過(guò)融合而體積過(guò)度膨脹[4]。已有研究表明，過(guò)表達(dá)OLE1，增加酵母中TAG的積累[5]。過(guò)表達(dá)OLE1，擬南芥轉(zhuǎn)基因植株 3 周大的葉片中 TAG 含量增加 7 倍，小油滴聚集成簇形成指環(huán)結(jié)構(gòu)，脂肪酸組分主要是C16∶0、C18∶2、C18∶3[6]。在擬南芥PDAT1/OLE1 的雙轉(zhuǎn)化株中，發(fā)現(xiàn)其 7 周大的蓮座葉中 TAG 含量比野生型提高 74 倍，總脂肪酸提高了 2 倍，油體成簇，與OLE1異位表達(dá)結(jié)果相似；但是葉片中不存在大而不規(guī)則的油體，與PDAT1過(guò)表達(dá)結(jié)果不同[6]。上述證明植物組織的含油量受多基因控制，提高其含油量需調(diào)控多個(gè)關(guān)鍵基因。后續(xù)研究表明,PDAT 在葉片中的功能有：一是過(guò)表達(dá)增加脂肪酸合成速率；二是介導(dǎo)脂肪酸從膜脂轉(zhuǎn)移到TAG。

PDAT在TAG合成過(guò)程中具有提高特殊脂肪酸含量的現(xiàn)象，從亞麻種子克隆的PDAT基因，偏好含有亞麻?；湹孜?，合成三亞麻酸甘油酯。過(guò)表達(dá)亞麻酸特異的PDAT，可大幅度提升酵母和擬南芥中 TAG的亞麻酸比例。從蓖麻中克隆的特異PDAT1-2底物偏好含有蓖麻?；湹牧字?，其能夠顯著提高 TAG 中羥基脂肪酸的積累[7-8]。在澤漆、斑鳩菊、蓖麻和琉璃菊等物種種子中，PDAT與環(huán)氧化脂肪酸和羥基積累密切相關(guān)[9]。

DGAT和PDAT是催化二酰甘油合成三酰甘油(TAG) 的關(guān)鍵酶[10]。DGAT的研究較為系統(tǒng)和深入，而PDAT發(fā)現(xiàn)較晚，研究較少，主要集中在擬南芥、酵母、蓖麻、亞麻、亞麻薺[11]、海甘藍(lán)[12]、向日葵、紅花種子[13]和衣藻[14]中。油菜是異源四倍體，基因多拷貝現(xiàn)象十分常見(jiàn)，油脂合成中涉及的基因與通路更復(fù)雜。穆嬌[15]以白菜型油菜中克隆得到2個(gè)PDAT1 基因的全長(zhǎng)編碼序列(Coding sequence, CDS)，并在擬南芥 Col-0 中驗(yàn)證了它們的功能，BrPDAT1 重復(fù)基因結(jié)構(gòu)上存在差異，BrPDAT1-2 缺少跨膜區(qū)域，但它們均能提高葉片中TAG及不飽和脂肪酸的含量。筆者已從湘油15號(hào)cDNA中克隆到3個(gè)PDAT1 CDS分別定位于A02、A10、C09號(hào)染色體，分別命名為BnaA02.PDAT1、BnaA10.PDAT1和BnaC09.PDAT1，其序列長(zhǎng)分別為1 998，2 002，2 004 bp，各自編碼665，666，667個(gè)氨基酸，酵母互補(bǔ)驗(yàn)證了PDAT1酶活性[16]。

本研究擬通過(guò)研究BnaPDAT1不同拷貝在2個(gè)含油量不同的甘藍(lán)型油菜(BrassicanapusL.)雙低品系中表達(dá)特性，分析其表達(dá)與含油量的相關(guān)性。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

雙低油菜品種(系)：選擇含油量 50%左右、35%左右的甘藍(lán)型油菜雙低品系 2 個(gè)，其中855(49.72%)、868(35.06%)均由國(guó)家油料改良中心湖南分中心提供。

試劑與試劑盒：RNA提取試劑盒(Transzol)、染料法qRT-PCR試劑盒TransStart Green qPCR SuperMix UDG購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；cDNA合成試劑盒PrimeScriptTMRTreagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real-time) (寶生物工程有限公司)；硅膠G60薄層色譜板、制備板(青島海洋)，普通層析板(默克.密里博)；十七烷酸甘油三酯購(gòu)自西格瑪公司；其他試劑均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)藥業(yè)股份有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 材料種植與取材 甘藍(lán)型油菜雙低品種(系)2013年秋季播種于湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)耘園實(shí)驗(yàn)基地，種植密度 15 萬(wàn)株/hm2，常規(guī)水、肥栽培管理。苗期(七葉一心)取葉片，盛花期取花蕾，立即使用液氮速凍，-80 ℃保存，用于總RNA的提取以及cDNA合成。分別取授粉后15,20,25,30,35,40,45 d的角果(分別用DAP15、DAP20、DAP25、DAP30、DAP35、DAP40、DAP45表示)，并在低溫條件下，剝離角果皮與種子，液氮速凍后-80 ℃保存，用于種子總RNA和油脂提取。

1.2.2 RNA提取與qRT-PCR 使用北京全式金生物技術(shù)有限公司TransZolTMup RNA試劑盒，按照說(shuō)明書(shū)提取甘藍(lán)型油菜種子、葉、花總RNA，按照寶生物的PrimeScriptTMRTreagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real-time)試劑盒說(shuō)明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA第一鏈作為qRT-PCR模板。

分析克隆獲得的BnaPDAT1序列并從BRAD數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取其3′端非翻譯區(qū)(Untranslated region, UTR)，根據(jù)BnaPDAT1各拷貝UTR序列特征設(shè)計(jì)分型引物，以BnaUBC21作為內(nèi)參基因，用于BnaPDAT1的時(shí)空表達(dá)分析，每樣品進(jìn)行 3 次重復(fù)。qRT-PCR在ABI7500熒光定量PCR系統(tǒng)上運(yùn)行。PCR體系包含: 1 μL cDNA、10 μL 2×FastStart Universal SYBR GreenMaster with ROX、10 μmol/L正向引物和反向引物各0.5 μL、8 μL ddH2O。PCR程序?yàn)? 95 ℃ 10 min; 95 ℃ 15 s, 60 ℃ 15 s, 72 ℃ 32 s, 35個(gè)循環(huán)。反應(yīng)完成后進(jìn)行95 ℃ 20 s, 60 ℃ 20 s, 95 ℃ 20 s, 59 ℃ 20 s繪制熔解曲線檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的正確性和引物二聚體。

1.2.3 qRT-PCR分型引物設(shè)計(jì)與數(shù)據(jù)處理 分析顯示BnaPDAT1基因三拷貝序列相似性超過(guò) 95%，基于CDS序列差異無(wú)法有效區(qū)分三拷貝，因此，通過(guò)鑒別3′非翻譯區(qū)(3′-UTR)差異對(duì)BnaPDAT1基因三拷貝進(jìn)行分型。

首先，基于甘藍(lán)型油菜基因組數(shù)據(jù)庫(kù)，獲取BnaPDAT1基因三拷貝 3′端下游序列(根據(jù) 3′-UTR序列長(zhǎng)度的一般特征，選擇 3′下游400 bp長(zhǎng)度)；根據(jù) 3′序列設(shè)計(jì)一系列間隔若干堿基的引物對(duì)，上游引物引物固定于各拷貝CDS序列的 5′末端。同時(shí)對(duì)cDNA與BnaPDAT1基因三拷貝的CDS序列進(jìn)行擴(kuò)增，找出在cDNA擴(kuò)增中能出現(xiàn)條帶，而在CDS序列中無(wú)法完成擴(kuò)增的所有引物對(duì)，然后對(duì)三拷貝mRNA序列庫(kù)進(jìn)行分型擴(kuò)增，找出最合適的qRT-PCR引物，測(cè)定引物擴(kuò)增效率備用。

1.2.4 不同發(fā)育時(shí)期油菜種子粗脂肪含量 采用索氏抽提法[17]測(cè)定。

1.2.5 不同發(fā)育時(shí)期油菜種子TAG提取與測(cè)定 采用薄層色譜法[18]。

2 結(jié)果與分析

2.1 BnaPDAT1基因分型引物設(shè)計(jì)

基于在BnaPDAT1基因 3 個(gè)拷貝序列特征，在BnaPDAT1的CDS末端設(shè)計(jì)固定的5′端引物，并分別在3′-UTR區(qū)域內(nèi)設(shè)計(jì) 8，10，10 條 3′端分型引物(表 1)；分別使用與BnaPDAT1基因克隆相同的gDNA模板和cDNA模板進(jìn)行分型驗(yàn)證，挑選出其中最好的3對(duì)引物(A02-R2、A10-R2、C09-R1)用于BnaPDAT1基因三拷貝的qRT-PCR。

表1 BnaPDAT1基因分型引物Tab.1 BnaPDAT1 genotyping primers

2.2 BnaPDAT1基因在甘藍(lán)型油菜不同品系中的表達(dá)

含油量不同的 2 個(gè)油菜品系855和868中BnaA02.PDAT1的表達(dá)(圖 1)隨種子發(fā)育呈先升高后降低的趨勢(shì)，但在2個(gè)材料的表達(dá)變化規(guī)律有一定差異。高含油量品系855種子在授粉后 30 d出現(xiàn)表達(dá)量峰值；低含油量品系868種子在授粉后 25 d出現(xiàn)表達(dá)量峰值，而授粉后 30 d的種子中幾乎不表達(dá)。2個(gè)油菜品系的花、葉中均有BnaA02.PDAT1表達(dá)，且高含油量品系 855 在葉中表達(dá)量為全生育期最高值(3.639 9)。高油品系855相對(duì)低油品系868在葉和授粉后20 d的種子中BnaA02.PDAT1表達(dá)具有極顯著性差異(P<0.01)，差異分別為 5.57 倍和3.64倍。

不同大小寫(xiě)字母分別表示數(shù)值由大到小間差異達(dá)0.01，0.05顯著水平。圖2-4、表2,3同。Different upper and lower letters indicate that the value varies from large to small，with a difference of 0.01，0.05.The same as Fig.2-4,Tab.2,3.

除授粉后 20 d的種子中存在極顯著差異外，855和858中BnaA10.PDAT1表達(dá)無(wú)明顯差異(圖 2)，在葉中幾乎不表達(dá)，在授粉后 25 d的種子中表達(dá)量極低，在花和授粉后其他時(shí)期的種子中均表達(dá)。BnaA10.PDAT1在高含油量品系855授粉后 20 d 種子中表達(dá)量為全生育期最高值(5.322 1)，與868中表達(dá)量具有極顯著差異(P<0.01)，差異為7.33倍。

圖2 BnaA10.PDAT1在不同品系甘藍(lán)型油菜中的表達(dá)Fig.2 Expression of BnaA10.PDAT1 in different Brassica napus strains

855和858中BnaC09.PDAT1的表達(dá)(圖 3)隨種子發(fā)育呈先升高后降低的趨勢(shì)，與BnaA02.PDAT1基本一致， 855種子在授粉后 20 d 表達(dá)量出現(xiàn)峰值，868種子在授粉后 25 d 表達(dá)量出現(xiàn)峰值；BnaC09.PDAT1在葉和花中均表達(dá)，其中高含油量品系855葉中BnaC09.PDAT1表達(dá)量為全生育期最高值(5.2063)。另外在高含油量品系 855 相對(duì)低含油量品系868在授粉后 20 d種子和葉中BnaC09.PDAT1表達(dá)量具有極顯著差異(P<0.01)，差異分別為 4.10 倍和9.43 倍。

圖3 BnaC09.PDAT1在不同品系甘藍(lán)型油菜中的表達(dá)Fig.3 Expression of BnaC09.PDAT1 in different Brassica napus strains

855和868中3個(gè)BnaPDAT1拷貝的總表達(dá)量(圖4)在授粉后種子中同樣呈先升高后降低的趨勢(shì)，855種子在授粉后20 d表達(dá)量出現(xiàn)高峰，868種子在授粉后25 d表達(dá)量出現(xiàn)高峰；花、葉片、種子中均有BnaPDAT1表達(dá)，除葉和授粉后20 d 種子中表達(dá)量差異較大外，其余各時(shí)期兩品系間表達(dá)差異不大，與湘油15號(hào)表達(dá)特性一致[16]，整體調(diào)控的特點(diǎn)得到驗(yàn)證。BnaPDAT1在高含油量品系855中授粉后20 d表達(dá)量為全生育期最高值(11.100 9)，是868的5.07倍；葉中表達(dá)量8.858 6，為868的7.34倍。BnaPDAT1整體表達(dá)特性與BnaC09.PDAT1相似。

圖4 BnaPDAT1在不同品系甘藍(lán)型油菜中的表達(dá)Fig.4 Expression of BnaPDAT1 in different Brassica napus strains

2.3 不同油菜品系種子發(fā)育中TAG積累規(guī)律

油菜成熟種子中油脂以TAG形式固定、貯存，但是前期種子發(fā)育過(guò)程中甘油一酯、甘油二酯和游離脂肪酸所占比重較大，粗脂肪含量不能代替TAG含量。經(jīng)研究在成熟種子中TAG含量可以代表含油量，相關(guān)系數(shù)r=0.992 9**。從2個(gè)品系不同時(shí)期TAG含量值看(圖5)，其趨勢(shì)基本一致，類(lèi)似S型，授粉后20 d以前TAG含量很低，授粉20 d后油脂合成速度加快，授粉后30 d進(jìn)入快速增長(zhǎng)階段，授粉后35 d進(jìn)入緩慢增長(zhǎng)期，授粉后30 d以前TAG含量材料間差異不大，授粉后35 d開(kāi)始出現(xiàn)差異，授粉后40 d差異進(jìn)一步擴(kuò)大并趨于穩(wěn)定，這與姚金保等[19]的研究結(jié)論一致。

圖5 不同含油量油菜品系 TAG含量變化Fig.5 Variation of TAG content in rapeseed varieties with different oil contents

從2個(gè)材料TAG含量增長(zhǎng)值看，授粉后20 d以前TAG含量和增長(zhǎng)值很小，20～25 d，25～30 d，30～35 d，35～40 d TAG增長(zhǎng)值較大，0～15 d，40～45 d TAG增長(zhǎng)值變小。其中高含油品系855中TAG增長(zhǎng)值最大的是授粉后30～35 d，其次是授粉后20～25 d，35～40 d和25～30 d相差不大 ；低含油品系868中TAG增長(zhǎng)值最大的是授粉后30～35 d，其次是授粉后25～30 d，再次是20～25 d。兩者增長(zhǎng)量差異最大的是30～35 d，其次是35～40 d (表2)。

表2 種子不同發(fā)育時(shí)期TAG含量變化Tab.2 Changes of TAG content in different developmental stages of seeds

2.4 BnaPDAT1基因?qū)Σ煌l(fā)育時(shí)期種子TAG含量的影響

分析前述2個(gè)具有不同含油量水平的甘藍(lán)型油菜品系TAG積累規(guī)律與BnaPDAT1基因表達(dá)的關(guān)系如圖6(TAG含量)和圖7(TAG增長(zhǎng)量)所示。

由圖 6,7可見(jiàn)，BnaPDAT1基因表達(dá)和種子TAG含量變化沒(méi)有明顯的相關(guān)性，但總體而言，高油品系中BnaPDAT1基因表達(dá)水平具有更大的峰值。2個(gè)油菜品系TAG增長(zhǎng)量均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，855在授粉后 25～40 d 均具有較穩(wěn)定的增長(zhǎng)量，授粉后 35 d 達(dá)到峰值；868在授粉后 25～35 d 均具有較穩(wěn)定的增長(zhǎng)量，授粉后 35 d 達(dá)到峰值，表明在授粉后 35 d前后為甘藍(lán)型油菜TAG積累的核心時(shí)期。從BnaPDAT1基因表達(dá)值看，在不同品系油菜中存在差異，授粉后逐漸變大，855中在授粉后 20 d表達(dá)量出現(xiàn)高峰，授粉后 30 d表達(dá)量出現(xiàn)次高峰；868中授粉后 30 d表達(dá)量出現(xiàn)高峰，后期下降趨勢(shì)均不明顯。

圖6 不同時(shí)期油菜品系TAG含量和BnaPDAT1表達(dá)量Fig.6 TAG content and BnaPDAT1 expression in rape varieties at different times

圖7 不同時(shí)期油菜品系TAG增長(zhǎng)量和BnaPDAT1表達(dá)量Fig.7 TAG increment and BnaPDAT1 expression in rape varieties at different times

授粉后 20～25 dBnaPDAT1基因表達(dá)值出現(xiàn)峰值，但是TAG含量變化最大的時(shí)間是授粉后 30～35 d，主要是種子體積在開(kāi)花后 25～30 d 基本定型，干物質(zhì)積累速度 35 d 達(dá)最高值[20]，前期TAG合成絕對(duì)值增大快但體積增大也很快，且不完全用于存儲(chǔ)性油脂積累，所以TAG比例變化不大。另外，BnaPDAT1基因表達(dá)值是其催化能力的代表，而TAG含量是一個(gè)逐步累積的相對(duì)值，在前期一定積累的基礎(chǔ)上，后期增長(zhǎng)速度必然減緩。

另外，對(duì)苗期、開(kāi)花后0～25 d，0～45 d以及全生育期2個(gè)品系PDAT1表達(dá)量之和進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)高油品系 855極顯著高于低含油品系868(表3)。

表3 不同含油量品系BnaPDAT1表達(dá)量分析Tab.3 Analysis of expression level of BnaPDAT1 in different oil content lines

3 結(jié)論與討論

本研究結(jié)果顯示，BnaPDAT1在葉、花和種子中均有表達(dá)，與在花生[21]、油茶[22]、紫蘇[23]中研究結(jié)果一致。甘藍(lán)型油菜在授粉后 20～30 d油脂合成轉(zhuǎn)化效率明顯提高，且種子發(fā)育后期BnaPDAT1保持較高表達(dá)水平。BnaPDAT1基因表達(dá)和種子TAG含量相關(guān)性分析顯示，二者之間沒(méi)有明顯的相關(guān)性，由于PDAT1蛋白僅具備?；D(zhuǎn)移蛋白功能，與在花生[21]、油茶[22]中研究結(jié)果相似。這表明影響TAG含量的并非單一由TAG組裝效率決定，而是由光合底物合成與TAG組裝能力共同決定。TAG組裝過(guò)程中至少還存在1條以上有別于PDAT途徑的?；D(zhuǎn)移方式將脂肪酸鏈轉(zhuǎn)移至甘油骨架上。

在DGAT1基因突變體中，PDAT1 途徑所產(chǎn)生的 TAG 含量是野生型種子的 70%；擬南芥PDAT1和DGAT1雙突變體中種子含油量下降 70%～80%，胚發(fā)育不正常。Fan 等[4]過(guò)表達(dá)了 AtPDAT(At5g13640)，擬南芥 7 周大的蓮座葉TAG含量比野生型提高了28 倍；而Mhaske 等[3]獲得的 pdat 突變體種子TAG 含量及脂肪酸組分與野生型無(wú)明顯差異；St?hl等[24]過(guò)表達(dá)了AtPDAT1，17 d苗齡的擬南芥幼苗中脂肪酸和總脂的含量也與野生型無(wú)明顯差異。說(shuō)明PDAT是擬南芥TAG合成關(guān)鍵基因，但是與DGAT具有功能重疊，2個(gè)基因具有動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)特性。

筆者從甘藍(lán)型油菜中克隆的BnaPDAT1基因能恢復(fù)缺陷型酵母H1246的油脂合成能力，3個(gè)拷貝均能夠明顯提高擬南芥突變體pdat1 TAG含量，證實(shí)該基因編碼蛋白具有PDAT1 酶活性，但是在甘藍(lán)型油菜中3個(gè)拷貝表達(dá)特性有差異，且不同拷貝表達(dá)量在不同含油量材料中同一時(shí)期和不同時(shí)期均與含油量沒(méi)有表現(xiàn)出相關(guān)性，同樣體現(xiàn)出總體調(diào)控的特點(diǎn)。另外，從基因表達(dá)到酶活力產(chǎn)生作用有一個(gè)過(guò)程，受到很多因素的影響，而且在自然條件下，每一個(gè)取樣時(shí)期天氣狀況也不一樣，與DGAT基因也有相互競(jìng)爭(zhēng)[25]。

通過(guò)分析還發(fā)現(xiàn)，BnaA02.PDAT1、BnaA10.PDAT1、BnaC09.PDAT1、BnaPDAT1基因在高含油量品系 855 授粉后 20 d表達(dá)量均極顯著高于低含油品系868，BnaA02.PDAT1、BnaC09.PDAT1、BnaPDAT1基因在高含油量品系 855 葉中表達(dá)量均極顯著高于低含油品系868，是否可以將這一指標(biāo)作為選擇高含油量油菜品種的特征性指標(biāo)，以及其臨界點(diǎn)有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

本研究選擇 2 個(gè)含油量具有顯著差異的甘藍(lán)型油菜雙低品系855和868對(duì)BnaPDAT1基因表達(dá)特性及與種子中油脂積累的相關(guān)性開(kāi)展研究，取得了一些初步結(jié)果。此結(jié)果對(duì)油菜高含油量育種具有一定的指導(dǎo)意義。